Измерения биомаркеров в сложных биологических образцов все больше руководящих принятия клинических решений. Мы описываем высокочувствительным методом для одновременного измерения сердечного миозин-связывающего белка С, креатин киназы MB и сердечного тропонина I в образцах сыворотки пациентов с инфарктом миокарда и группой контроля.
Биомаркеров становится все более важным в принятии клинических решений, а также фундаментальной науки. Диагностика инфаркта миокарда (ИМ) во многом основывается на выявлении сердечно-специфических белков в пациентов сыворотки или плазмы в качестве индикатора повреждения миокарда. Недавно показано, что сердечный миозин-связывающего белка-С (cMyBP-C) можно обнаружить в сыворотке крови после ИМ, мы предложили его в качестве потенциальных биомаркеров ИМ. Биологические маркеры обычно обнаруживаются традиционными сэндвич иммуноферментного анализа. Однако этот метод требует большого объема пробы, имеет небольшой динамический диапазон, и может измерять только один белок одновременно.
Здесь мы показываем, мультиплексе иммунотестом, в котором три сердечных белки могут быть измерены одновременно с высокой чувствительностью. Измерение cMyBP-C в Uniplex или вместе с креатина киназы MB и сердечного тропонина я показал чувствительность сопоставима. Эта техника использует мезо Масштаб Discovery(MSD) способ мультиплексирования в 96-луночный планшет в сочетании с электрохемилюминесценция для обнаружения. В то время как лишь небольшие объемы образцов требуются высокая чувствительность и широкий динамический диапазон будут достигнуты. Используя эту технику, мы измерили cMyBP-C, креатин киназы MB и сердечного тропонина I в сыворотке крови образцы из 16 пациентов с ИМ и сравнили результаты с 16 субъектами управления. Мы смогли обнаружить все три маркера в этих образцах и нашел всех трех биомаркеров быть увеличена после ИМ. Этот способ, следовательно, подходит для чувствительного обнаружения сердечных биомаркеров в образцах сыворотки.
Измерение небольших количеств белка в сложных биологических образцов, таких как сыворотка, приобретает все большее клиническое значение для лечения пациента, а также основные науки. Например, увеличение сывороточных уровней сердечных биомаркеров, таких как тропонин I, в клинических условиях согласуется с острым инфарктом миокарда (ИМ) 1. Для обнаружения белков в образцах сыворотки, стандартный твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее часто используемым способом, как это имеет высокую чувствительность и позволяет абсолютного количественного определения анализируемого вещества. Однако традиционные ELISA, требуют относительно большого количества образца (как правило, 100 мкл), имеют высокую фонового сигнала в некоторых биологических жидкостей, а ограничиваются измерением только одного аналита в ELISA-2.
В последнее время новый метод иммуноанализа была введена в обход многие из этих недостатков. Этот модифицированный анализа, разработанного MSD, использует electrochemiluminescENCE (ECL) для обнаружения сигнала, которая позволяет очень низкий фон и повышенная чувствительность, что позволяет использовать небольшие объемы образца. Электрохемилюминесценция основан на молекуле-репортеру рутений (II) trisbipyridal, которая крепится на обнаружение антител. Это репортерной молекулой излучает свет при 620 нм на электрической стимуляцией в нижней части 96-луночный планшет который имеет углеродные электроды интегрированы в них 3. Кроме того, при использовании точечного покрытия, несколько антител захвата могут быть покрыты в одну лунку (до 10 на 96-луночном планшете), что обеспечивает одновременное определение количества различных белков в одном образце 4. Этот метод был недавно использован для измерения профилей провоспалительных цитокинов в сыворотке 5,6. Мультиплекс плиты из MSD выгодно отличаются от других платформ множественного аналитического 7.
Использование MSD в качестве основной платформы анализа, мы также разработали на заказ 3-комплекса, что с пластинойодновременного количественного определения уровня сердечного миозин-связывающего белка-C (cMyBP-C), креатин-киназы MB (CK-MB), и сердечный тропонин I (cTnI), и результаты сравнивали с monoplex обнаружения cMyBP-C. CK-MB и cTnI хорошо отлаженных биомаркеров для ИМ. Однако увеличение этих маркеров может быть вызвано патологий, кроме М.И., например, миокардит или почечной недостаточностью 8. Это свидетельствует о добавлении дополнительных биомаркеров для увеличения специфичности диагностики инфаркта миокарда. Недавно мы показали, что cMyBP-C также является потенциальным биомаркеров для MI 9. cMyBP-C представляет собой толстую нить ассоциированный белок, который экспрессируется в сердце, 10-12, но не в скелетной или гладкой мускулатуры. Таким образом, повышение уровня cMyBP-C в системе кровообращения является специфическим показателем повреждения сердца 13.
В этом исследовании сравнивали Uniplex обнаружения cMyBP-C с использованием пользовательского 3-комплекса анализе на определение сывороточных уровнейcMyBP-C, CK-MB, и cTnI в сыворотке крови больных с ОИМ. В будущем эта подпись техники может быть использован для диагностики инфаркта миокарда у пациентов с болями в груди в отделении неотложной помощи.
Учреждение обзор платы (IRB) из Университета Лойолы Чикаго одобрил исследования для использования deidentified человека образцы и использование иммуноферментного анализа (LU # 20392).
В этом исследовании мы покажем применимость мультиплекса иммуноанализа для обнаружения нескольких сердечных биомаркеров в сыворотке крови у пациентов. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными ELISA. Во-первых, в ECL набора для анализа используют вместо колориметрич?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансировалось Национальным институтом здоровья и гранты R01HL105826 K02HL114749 (Dr. Sadayappan) и Американской Ассоциации Сердца Запада стипендий; 11PRE7240022 (г-н Barefield) и 13POST14720024 (Dr. Говиндана). Авторы выражают признательность за помощь доктор Джимми Пейдж, Джилл Clampit и д-р Джон Хадсон, MSD, за их отличную техническую поддержку и литературы в развитии анализа.
Reagents | |||
MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
Plates and Equipment | |||
Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 |