Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50839
Automatic Translation
1, 1
1Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg (ZMBH), University of Heidelberg

Summary

التشكل البروتين وديناميات هي المفتاح لفهم العلاقة بين بنية البروتين ووظيفته. تبادل الهيدروجين مقرونا عالية الدقة قياس الطيف الكتلي هو طريقة تنوعا لدراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات وكذلك تميز البروتين يجند والبروتين البروتين التفاعلات، بما في ذلك واجهات الاتصال والآثار تفارغي.

Abstract

تعتمد جميع العمليات الخلوية على وظيفة البروتينات. على الرغم من أن وظيفة بروتين معين هو نتيجة مباشرة لتسلسل الأحماض الأمينية فريدة من نوعها، ويتحقق ذلك إلا من خلال للطي سلسلة ببتيد في ترتيب ثلاثي الأبعاد تحديدا واحدة أو أكثر شيوعا في مجموعة متكاملة من التشكل interconverting. التحقيق في العلاقة بين التشكل البروتين وظيفتها لذا فمن الضروري لفهم كامل لكيفية البروتينات هي قادرة على الوفاء تنوعها كبير من المهام. احتمال واحد لدراسة التغيرات متعلق بتكوين البروتين يخضع بينما تتقدم من خلال دورة وظيفية لها هو الهيدروجين H-1/2 H-الصرف بالاشتراك مع عالية الدقة قياس الطيف الكتلي (HX-MS). HX-MS هو أسلوب تنوعا والقوية التي تضيف بعدا جديدا إلى المعلومات التي حصلت عليها الهيكلية مثل البلورات. يتم استخدامه لدراسة البروتين للطي والتي تتكشف، ملزم من مول الصغيرةبروابط ecule، البروتين البروتين التفاعلات، والتغيرات متعلق بتكوين مرتبطة انزيم الحفز، وallostery. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم HX-MS في كثير من الأحيان عندما كمية البروتين محدودة جدا أو بلورة البروتين ليست مجدية. ونحن هنا نقدم بروتوكول عام لدراسة ديناميات البروتين مع HX-MS ووصف كمثال كيفية الكشف عن واجهة التفاعل من اثنين من البروتينات في مجمع.

Introduction

ارتفع عدد هياكل الكريستال من البروتينات والمجمعات البروتين بسرعة في السنوات الأخيرة. ما يقدمونه لقطات لا تقدر بثمن للتنظيم الهيكلية لهذه البروتينات وتوفير أساس لتحليل هيكل وظيفة. ومع ذلك، فإن ديناميات البروتينات والتغيرات متعلق بتكوين جزئي، والتي هي ضرورية لمهامهم، ونادرا ما كشفت عنه البلورات بالأشعة السينية. البرد electronmicroscopy، من ناحية أخرى، قادرة على التقاط مجمعات البروتين والبروتين في التشكل مختلفة ولكن بصفة عامة لا يمكن حل التغييرات متعلق بتكوين وصولا الى المستوى الثانوي هيكل 1. ديناميات بتكوين جزئي للبروتينات في الحل في التفاصيل الذرية لا يمكن حلها إلا عن طريق الرنين المغناطيسي، ولكن هذا الأسلوب لا يزال يقتصر على البروتينات ذات أحجام صغيرة نسبيا (عادة ≤ 30 كيلو دالتون) ويحتاج تركيزات عالية من البروتينات (≥ 100 ميكرومتر)، الذي يعيق التجارب مع oligomerization أو تجميع البروتينات عرضة 2. أسلوب واحدقادرة على سد بين عالية الدقة البلورات بالأشعة السينية والبرد electronmicroscopy والذي لا يقتصر حسب حجم البروتين أو تركيز أميد الهيدروجين H-1/2 H-الصرف (HX) في تركيبة مع مطياف الكتلة (MS). في السنوات الأخيرة تطورت هذه الطريقة إلى أداة تحليلية قيمة لتحليل ديناميات البروتين، والبروتين للطي، والاستقرار البروتين والتغيرات متعلق بتكوين 3-5. الأساس الجزيئي لهذه الطريقة هي طبيعة عطوب من الهيدروجين أميد العمود الفقري في البروتينات، والتي سوف تبادل مع ذرات الديوتيريوم عندما يتم وضع البروتين في D 2 O الحل. يتم قياس زيادة لاحقة في البروتين الشامل على مر الزمن مع ارتفاع القرار-MS.

في الببتيدات غير منظم قصيرة HX يعتمد فقط على درجة الحرارة، وتركيز محفز (OH -، H 3 O + أي درجة الحموضة، انظر الشكل 3) وسلاسل الأحماض الأمينية الجانب المخلفات المجاورة بسبب الاستقرائي، والقطآثار alytic والفراغية. هذه التأثيرات الجوهرية على سعر الصرف الكيميائية ك الفصل تم كميا بأناقة من قبل باي وآخرون. 6 والبرنامج متاح (مجاملة Z. تشانغ)، الذي يحسب ك الفصل لكل الأحماض الأمينية داخل ببتيد تعتمد على درجة الحموضة ودرجة الحرارة. في الرقم الهيدروجيني محايدة ودرجات الحرارة المحيطة ك ch غير في الترتيب من 10 1 -10 3 ثانية -1. في البروتينات مطوية HX يمكن أن تكون 2-9 أوامر من حجم أبطأ ويرجع ذلك أساسا إلى الرابطة الهيدروجينية في هيكل الثانوية وبدرجة طفيفة بسبب الوصول المحدود للرطب OH - الأيونات إلى داخل البروتين مطوية بإحكام. لذا HX في البروتينات الأم تورط تتكشف، وتبادل الكيميائية جزئية أو العالمية وطوي ثانية إلى الدولة الأم وفقا للمعادلة (1) وفقا لأسعار الصرف المرصودة ك OBS تعتمد على المرجع سعر الافتتاح ك، سعر الإقفال ك البنود وتبادل الكيميائية الذاتية راالشركة المصرية للاتصالات ك الفصل وفقا لمعادلة (2).

المعادلات 1-2
في ظل ظروف الدولة الأم ك المرجع هو أصغر بكثير من الفصل ك ويمكن إهمالها في المقام. هناك نوعان من أنظمة الصرف المدقع دعا EX1 EX2 و. إذا كانت البنود ك هو أصغر بكثير من الفصل ك (EX1) معدل احظ تساوي عمليا إلى سعر الافتتاح وHX يسمح الملاحظة المباشرة للتتكشف من عنصر هيكلي. مثل هذا النظام الصرف، حيث جميع البروتونات أميد الصرف في آن واحد على افتتاح العنصر الهيكلي، ويمكن ملاحظتها بسهولة في MS قبل توزيع ذات النسقين من قمم النظير 7. إذا ك البنود هو أكبر بكثير من الفصل ك (EX2) معدل وحظ يتناسب مع ك الفصل حيث ثابت التناسب يساوي التوازنات-تتكشف للطي المستمر K = ش ك المرجع البنود. في ظل هذه الظروف، فإن العديد من افتتاح واختتام الأحداث ضرورية قبل كل تبادل البروتونات أميد لدوتيرونس، مما يؤدي إلى زيادة تدريجية في متوسط ​​كتلة بينما يبقى توزيع النظائر تقريبا نفس. النظام EX2 يسمح تحديد الطاقة خالية من تتكشف ΔG u و بالتالي استقرار عنصر هيكلي. تحت شرط الدولة الأم النظام EX2 هو الأكثر شيوعا. زيادة درجة الحموضة وإضافة وكلاء chaotropic يمكن تحويل آلية الصرف لEX1. وبالتالي، HX-MS يمكن استخدامها لاستكشاف الحرارية وكذلك المعلمات الحركية للطي البروتين والتغيرات متعلق بتكوين.

كما ذكر أعلاه HX هو جوهرها ودرجة الحموضة ودرجة الحرارة تعتمد وتبادل عمر النصف للبروتون يتعرض المذيبات تماما من مجموعة أميد العمود الفقري ما بين 5-400 ميللي ثانية في درجة الحموضة الفسيولوجية (الرقم الهيدروجيني 7.6) و 30 درجة مئوية، ولكن 10 دقيقة ل> 15 ساعة بمتوسط> 2 ساعة في درجة الحموضة 2.9 و 0 °C (ما عدا البروتون من أول العمود الفقري أميد السندات من ببتيد، والتي تتبادل مع حياة نصف من كاليفورنيا. 1-2 دقيقة). في ظل هذه الظروف تبادل بطيئة فمن الممكن لهضم العينة باستخدام البروتياز (مثل البيبسين) التي تنشط في ظل هذه الظروف، مع من فقدان جميع المعلومات الواردة في دوتيرونس يدمج. منذ إدخال الهضم المعوية في ظل ظروف تبادل بطيئة، وليس فقط حركية HX العام للبروتينات كامل طول يمكن تحليلها ولكن يمكن أن تكون مترجمة إلى HX مناطق محددة 8،9. يقتصر القرار المكانية حاليا لحجم الشظايا الناتجة الهضمية، والتي هي بشكل عام بين 10-30 المخلفات. ومع ذلك، يمكن تداخل شظايا إنشاؤها نظرا لطبيعة غير محددة من الانقسام قبل البيبسين يؤدي إلى زيادة في القرار المكانية. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على العديد من البروتياز الأخرى أن تكون نشطة في ظل ظروف إخماد، ومع ذلك، أقل كفاءة بكثير من البيبسين 10. مزيد من increaذاتها من القرار المكانية ويمكن الوصول عن طريق تجزئة الببتيدات في الطور الغازي من قبل الأساليب التي حافظت على نمط معالجة بالديوتريوم مثل أسر الإلكترون تفارق (تنمية الطفولة المبكرة)، ونقل الإلكترون تفارق (المفتشون) والأشعة تحت الحمراء multiphoton تفارق (IRMPD) 11-13. هذه التقنيات منع فقدان القرار المكانية بسبب الهجرة داخل الجزيء بروتون ("الهرولة")، والذي لوحظ من قبل الناجم عن الاصطدام تفارق (CID) تقنية تجزئة الأكثر استخداما. ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب التحسين لكل الببتيد الفردية وبالتالي لا تزال صعبة للغاية.

وقد استخدم HX-MS لتحليل البروتين يجند والبروتين البروتين التفاعلات بما في ذلك التجمع الفيروسية قفيصة 14-17. البروتين تتكشف وطوي ثانية وكذلك تم التحقيق في درجة الحرارة الناجمة عن التغيرات متعلق بتكوين 7،18،19. الفسفرة واحد من الأحماض الأمينية المتصلة بتكوين طفرة يغير 16،20 وnucleotوالتغيرات الناجمة عن بيئة تطوير متكاملة تحليل 21،22. وبالتالي، فإن هذا الأسلوب يبدو مناسبة بشكل مثالي لتحليل التجمع وديناميات الآلات الجزيئية. مرشح واحد جذاب، الذي هو آلية من المصلحة العامة كبيرة، هو مجمع كوصي Hsp90.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. عينات إعداد المخازن المؤقتة والبروتين

  1. إعداد H 2 O العازلة. استخدام Hsp90 عازلة معيار (40 ملي HEPES / كوه، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي بوكل، 5 ملي MgCl 2، 10٪ الجلسرين) كما H 2 O العازلة.
    ملاحظة: إذا كان مدال العينة قبل التحليل، واستخدام المخزن المؤقت لغسيل الكلى كما H 2 O العازلة. فمن الضروري أن O العازلة D 2 يختلف عن O العازلة H 2 فقط في النظائر الهيدروجين. مخازن متقلبة مثل NH 4 CO 3 أو 4 NH-خلات العازلة أو مكونات ليست مناسبة!
  2. إعداد D 2 O العازلة تجفيد من Hsp90 عازلة معيار باستخدام مكثف فراغ. بعد التبخر كاملة من H 2 O إضافة النقي D 2 O إلى أنبوب للوصول إلى الحجم الكلي الأولية (على سبيل المثال 1 مل العازلة مع 15٪ الجلسرين تتطلب إضافة 850 ميكرولتر D 2 O). تكرار التبخر الكامل للالعازلة وتنحل كوم العازلة / الملح* مكونات في D 2 O 2X.
  3. إعداد العازلة إخماد (0.4 M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 درجة الحموضة 2.2).
    ملاحظة: لتحسين كفاءة الجهاز الهضمي هضم البروتينات مستقرة جدا ويمكن أن يضاف 4 M جوانيداين هيدروكلوريد و 0.5 M تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP، حمض الهيدروكلوريك).
  4. إعداد 100٪ العينة الضابطة (6 M جوانيداين هيدروكلوريد، D 2 O). إضافة جوانيداين هيدروكلوريد لقسامة Hsp90 للوصول إلى تركيز النهائي من 6 M. تماما تتبخر H 2 O من العينة وإضافة D 2 O إلى أنبوب للوصول إلى الحجم الكلي الأولية (على سبيل المثال 100 عينة ميكرولتر مع 10٪ الجلسرين تتطلب إضافة من 90 ميكرولتر D 2 O). تكرار التبخر الكامل للالعازلة وتنحل العناصر العازلة / الملح في D 2 O.
    ملاحظة: يطلب من 20-100 بمول من العينة لكل الحقن. إعداد ما يكفي من العينة لديهم السيطرة 100٪ عن كل يوم من التجارب HX-MS.
  5. إعداد 50 بمول Hsp90 في 5 ميكرولتر العازلة Hsp90 القياسية.
    ملاحظة: مطلوب مبلغ 20-100 بمول من عينة لكل نقطة من البيانات الخام. حجم العينة في رد فعل هو 1-5 ميكرولتر من الناحية المثالية. ضبط تركيز لتناسب هذه المتطلبات. أي العازلة يمكن استخدامها طالما أنها لا تحتوي على المنظفات أو المكونات المتطايرة.

2. إعداد يجمد البيبسين على ألدهيد المنشط الخرز

  1. حل 80 ملغ البيبسين الطازجة في 2 مل 50 ملي سيترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5).
  2. حل 20 ملغ من الصوديوم cyanoborohydride، التعامل مع الرعاية (سامة جدا!) في 1 مل 2 M نا 2 SO 4 وإضافة إلى حل البيبسين.
  3. احتضان الخليط لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في حين تهييج بلطف (شاكر مثل النفقات العامة).
  4. إضافة 600 ملغ الخرز مع مجموعات ألدهيد يجمد إلى الخليط واحتضان لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة 2.2 مل من 2 M نا 2 SO4 (الرقم الهيدروجيني 5) في 100 ميكرولتر مأخوذة كل دقيقة أكثر من 3 ساعة واحدة إلى الملح ببطء والبيبسين. المزيج بلطف العينة بين الإضافات في النفقات العامة شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  6. احتضان حبات البيبسين في 4 درجات مئوية لمدة 14-16 ساعة / بين عشية وضحاها في شاكر في سماء المنطقة.
  7. إخماد رد فعل عن طريق إضافة 1 مل من 1 M ايثانول والحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
  8. تدور باستمرار الخرز في أنبوب 50 مل الصقر في 500 دورة في الدقيقة، وتجاهل طاف و resuspend حبات في حمض الفورميك بنسبة 0.1٪. كرر هذه الخطوة 2X. بعد الخطوة الطرد المركزي الماضي، تجاهل طاف وحجم التقدير من الخرز. إضافة حجم يعادل حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ وتخزينها في 4 درجات مئوية.

3. إعداد الأعمدة لأميد الهيدروجينية الصرف

  1. استخدام الأعمدة الحرس مع القطر الداخلي من 1 ملم لمحاصرة الأعمدة ومع 2 مم للأعمدة البيبسين.
  2. فك جانب واحد من العمود حارس وإزالة عامل التصفية. المسمار بإحكام التعبئة نتائج موجودةش على النهاية المفتوحة للعمود. استخدام محول 1/16 بوصة وأنابيب إرفاق حقنة فارغة (5 مل) للمخرج الجزء السفلي من العمود. تأكد من إصلاحه الغاز محكم إلى العمود الحراسة.
  3. تطبيق بضع قطرات من الطين مادة حبة على رأس القمع. سحب المكبس من المحاقن لامتصاص الطين من خلال القمع في العمود الحراسة. تطبيق المزيد من الطين المواد خرزة على القمع ومواصلة الإجراء حتى يتم تعبئة العمود الحرس تماما مع المواد حبة. إزالة القمع والتصفية ووضع عصابة على مرشح نهاية مفتوحة. المسمار بإحكام الغطاء العمود على العمود حارس وإزالة المحقنة من الجانب الآخر. إغلاق طرفي أعمدة الحرس مع المقابس لتجنب تجفيف المواد العمود.

4. إنشاء نظام للصرف الهيدروجين الطيف الكتلي (HX-MS)

  1. ربط العمود فخ مع نظام HPLC (الشكل 1). تتوازن العمود عن طريق تحديد معدل تدفقضخ ألف إلى 0.4 مل / دقيقة مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ كما المذيبات. لا ربط العمود البيبسين ولا العمود التحليلية حتى الآن.
  2. معايرة مطياف الكتلة وتوصيل مخرج HPLC لمصدر مطياف الكتلة.

5. تحديد المدى الديناميكي للنقد

  1. إعداد عالى النقاء المذيبات A (حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الماء) وعالى النقاء المذيبات B (حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في أسيتونتريل)؛ هي المذيبات الجاهزة متوفرة تجاريا. تطهير مضخات HPLC. إعداد اللوني وطرق قياس الطيف الكتلي في برنامج التحكم عن طريق اختيار البرنامج مع التدرج خطوة بعد خطوة تحلية قصيرة. لكامل طول استخدام Hsp90 خطوة تحلية 1-2 دقيقة تليها تبديل صمام 6 من ميناء DESALT / LOAD لأزل وخطوة متدرجة من 90٪ المذيبات المذيبات A/10٪ إلى 5٪ B المذيبات المذيبات A/95٪ B. قبل حقن تعيين صمام حقن لتحميل وصمام 6 الميناء لDESALT موقف / LOADING.
    مذكرة: لا تستخدم البيبسين أو عمود التحليلية خلال هذه التجربة.
  2. إعداد 100-200 بمول من Hsp90 في 1-10 ميكرولتر H 2 O العازلة واحتضان لمدة 10 دقيقة في 30 درجة مئوية. إضافة درجة حرارة تعديلها D 2 O عازلة لتبرزي حجم عينة تصل إلى 100 ​​ميكرولتر واحتضان بالضبط لفترة محددة من الزمن (مثلا 10 ثانية و 100 ثانية، 1،000 ثانية). إضافة 100 ميكرولتر العازلة إخماد وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. حقن العينة 200 ميكرولتر في منفذ حقن صمام الحقن مع حقنة هاميلتون. بدء تشغيل البرنامج اللوني وتبديل صمام حقن حقن في الموقف. بعد 2 دقيقة تبديل صمام 6 من ميناء DESALT / LOADING إلى أزل. كرر هذا لا يقل عن ثلاث نقاط الوقت.
  3. كرر الخطوة 5.2 ولكن إضافة 2-3X تتجاوز Sti1 إلى عينة Hsp90 قبل احتضان لمدة 10 دقيقة عند 30 درجة مئوية.
  4. تحديد الجماهير بروتين كامل طول بواسطة deconvolution الأطياف في برنامج مطياف الكتلة. حساب عدد incorporatإد دوتيرونس بمقارنة الوزن الجزيئي للبالطول Hsp90 مع كتلة وحظ بعد كل شوط (على سبيل المثال 10 ثانية و 100 ثانية، 1،000 ثانية).
  5. رسم دوتيرونس أدرجت لHsp90 في غياب وجود Sti1 (المحور الصادي) مقابل الوقت (محور س). تحديد نقطة في الوقت النطاق الديناميكي حيث الفرق بين كل من المنحنيات هي القصوى. استخدام هذه القيمة لفترة حضانة في D 2 O عند تحديد واجهة Hsp90-Sti1 وديناميكية على مستوى الببتيد.

6. تحديد هضمية الببتيدات عن طريق MS / MS الأطياف

  1. ربط العمود البيبسين والعمود التحليلي إلى النظام.
  2. إعداد المعلمات للاللوني وقياس الطيف الكتلي في برنامج التحكم عن طريق اختيار نوع التدرج وطريقة قياس الطيف الكتلي. اختيار التدرج طويلة (على سبيل المثال أكثر من 90 دقيقة) لضمان القرار الكروماتوغرافي جيدة. تمكين MS / MS الأطياف على مطياف الكتلة.
    ملاحظة: resolu جيدنشوئها على هبلك ودقة عالية الشامل لها الأولوية القصوى في هذه الخطوة.
  3. إعداد 100-200 بمول من Hsp90 في 100 ميكرولتر H 2 O العازلة. إضافة 100 ميكرولتر العازلة إخماد وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. حقن العينة 200 ميكرولتر في منفذ حقن صمام الحقن مع حقنة هاميلتون. بدء تشغيل البرنامج اللوني وتبديل صمام حقن حقن في الموقف. بعد 2 دقيقة تبديل صمام 6 من ميناء DESALT / LOADING إلى أزل الموقف.
    ملاحظة: إذا كان البروتين أكثر من واحد هو أن يتم تحليلها في HX-MS (أي البروتين البروتين واجهات التفاعل) الببتيدات لكل من البروتين يجب أن تحدد بشكل فردي.
  4. تحديد الببتيدات الهضمية من Hsp90 من خلال البحث في قاعدة البيانات (أي التميمة) لالببتيدات الناتجة عن ذلك.
    ملاحظة: من الممكن استخدام قاعدة بيانات مخصصة كما ان الهدف هو تحديد العديد من الببتيدات الهضمية ممكن، ويتم تحليل مع البروتين النقي. سوف نقاء العينة حافي أن تؤخذ بعين الاعتبار.
  5. كرر هذه الخطوة دون MS / MS ومع التدرج التي سيتم استخدامها للتجربة HX الفعلية. لHsp90 وSti1 استخدام التدرج 10 دقيقة من 90٪ المذيبات المذيبات A/10٪ إلى 45٪ B المذيبات المذيبات A/55٪ B.
    ملاحظة: تدرجات عادة ما تكون بين 5-15 دقيقة وتعتمد بشكل كبير على تعقيد نموذج ومواصفات النظام HX.
  6. تحديد أوقات الإبقاء على الببتيدات الهضمية المحددة في 6.4 في الانحدار المستخدمة في 6.5 وإنشاء قائمة تضم 1.) تسلسل الببتيد 2.) الببتيد ولاية تهمة و 3.) الوقت الاحتفاظ. وسوف تستخدم هذه لتعريف كل الببتيد بعد التجارب HX.
    ملاحظة: يجب أن تدرك أن الببتيدات مع وجود اختلافات صغيرة م / ض، متطابقة ولاية تهمة ومتطابقة الوقت الاحتفاظ يمكن أن تكون مصدرا للغموض.

7. تحديد البروتين البروتين واجهات التفاعل

  1. إعداد التدرج وطريقة قياس الطيف الكتلي في سوفتواري السيطرةه. استخدام التدرج الخطي 10 دقيقة من 90٪ المذيبات المذيبات A/10٪ إلى 45٪ B المذيبات A/55٪ B. المذيبات تحميل طريقة قياس الطيف الكتلي الذي هو الأمثل للكشف عن الجماهير بين 300-1،500 م / ض، على الرغم من أن معظم سيكون الببتيدات أدناه 1،000 م / ض. ضبط صمام الحقن في موقف LOAD، صمام 6 ميناء في LOADING / تحلية الموضع. ضبط معدل تدفق المضخة التحميل إلى 0.4 مل / دقيقة.
    ملاحظة: طول ونوع من التدرج تعتمد عينة، ويمكن أن يكون الأمثل. يعد تحسين التدرجات حل اللوني ولكن تقليل إدماج دوتيرونس في البروتينات بسبب الخلفية الصرف. الطرق المختارة تحتاج إلى أن تكون واحدة لجميع التجارب ليتم مقارنتها.
  2. للإشارة unexchanged إعداد 20-100 بمول من Hsp90 في 100 ميكرولتر H 2 O العازلة. إضافة 100 ميكرولتر العازلة إخماد الجليد الباردة، ماصة صعودا وهبوطا مرتين وحقن العينة في صمام حقن HPLC. بدء تشغيل البرنامج اللوني وجنوب غرب فوراحكة صمام الحقن في موقف حقن. بعد 2 دقيقة تبديل صمام 6 من ميناء DESALT / LOADING إلى أزل الموقف. للقيام بذلك Hsp90 وSti1 بشكل فردي وعلى خليط من البروتينات.
  3. إعداد 20-100 بمول من Hsp90 في حجم 1-5 ميكرولتر. إضافة درجة حرارة تعديلها D 2 O عازلة لتبرزي حجم عينة تصل إلى 100 ​​ميكرولتر واحتضان بالضبط لفترة محددة من الزمن (مثلا 30 ثانية؛ لديناميات بتكوين رؤية ملاحظة). إضافة 100 ميكرولتر من العازلة إخماد الجليد الباردة، ماصة صعودا وهبوطا مرتين وبسرعة حقن 200 ميكرولتر في صمام حقن HPLC. بدء فورا في برنامج اللوني وتبديل صمام حقن حقن في الموقف. بعد 2 دقيقة تبديل صمام 6 من ميناء DESALT / LOADING إلى أزل الموقف. القيام بذلك بشكل فردي لكل من البروتين، لتحديد إدماج دوتيرون في كل الببتيد في غياب البروتين التفاعل.
    ملاحظة: عند دراسة ديناميات conformational التغييرات، كرر التجربة مع أوقات مختلفة من الحضانة Hsp90 في D 2 O العازلة. محاولة لتغطية فترة زمنية واسعة من خلال اختيار الأوقات الحضانة غاريثمي (على سبيل المثال 10 ثانية، 30 ثانية و 100 ثانية، 300 ثانية، 1،000 ثانية، الخ). يجب أن يكون D 2 O العازلة والعازلة عينة متطابقة تماما فيما عدا النظائر الهيدروجين.
  4. إعداد مبلغ مساو من 100٪ العينة الضابطة (20-100 بمول) وإضافة D 2 O عازلة لتبرزي حجم عينة تصل إلى 100 ​​ميكرولتر. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة إخماد الجليد الباردة، ماصة صعودا وهبوطا مرتين وبسرعة حقن 200 ميكرولتر في صمام حقن HPLC. بدء فورا في برنامج اللوني وتبديل صمام حقن حقن في الموقف. بعد 2 دقيقة تبديل صمام 6 من ميناء DESALT / LOADING إلى أزل الموقف.
  5. لتحديد سطح التفاعل مزيج Hsp90 مع وجود فائض لا يقل عن 2 أضعاف من Sti1 لتحويل التوازن للدولة منضمة (انظر ملاحظة)، واحتضانفي درجة الحرارة المطلوبة حتى تشكيل معقدة هو في حالة توازن. إضافة درجة حرارة تعديلها D 2 O عازلة لتبرزي حجم عينة تصل إلى 100 ​​ميكرولتر واحتضان بالضبط لفترة محددة من الزمن (مثلا 30 ثانية). إضافة 100 ميكرولتر من العازلة إخماد الجليد الباردة، ماصة صعودا وهبوطا مرتين وبسرعة تحقن صمام حقن HPLC. بعد 2 دقيقة تبديل صمام 6 من ميناء DESALT / LOADING إلى أزل الموقف. تكرار هذه التجربة مع 20-100 بمول من Sti1 وتتجاوز Hsp90.
    ملاحظة: تركيزات المطلقة تعتمد على التوازن التفكك المستمر للتفاعل. من الناحية المثالية، وبعد التخفيف إلى D 2 O تركيز البروتين المضافة في الزائدة يجب أن تكون على الأقل 10X K D (الموافق> 85٪ من البروتين أقل تركيزا ملزمة).
  6. تحليل البيانات التي حصل عليها مع البرمجيات المناسبة واستخدام مرات الاحتفاظ تحديدها في الخطوة 6.5 لايجاد كل الببتيد في التحليل. Calculaالشركة المصرية للاتصالات النقطه الوسطى لتوزيع النظائر للبروتين unexchanged (الخطوة 7.2) وللتجارب HX (الخطوة 7.3).
    ملاحظة: على الرغم من أن أنماط النظائر من الببتيدات تبادل تبدو مختلفة عن نظيراتها unexchanged، فإن كلا من المعرفة حول الدولة المسؤول عن الببتيد ودقة عالية من الكتلة مطياف الكتلة يسمح لتحديد سهلة من النقطة الوسطى.
  7. مقارنة إدماج دوتيرونس من البروتين الهدف وحده، ومع فائض من شريك ملزمة. ويمكن القيام بذلك تلقائيا مع البرمجيات التجارية أو يدويا مع برنامج جدول بيانات. قيم العينة الضابطة 100٪ للدلالة على التبادل القصوى لكل الببتيد ويمكن استخدامها لتحديد مقدار D 2 O التسمية فقدت أثناء التجربة بسبب الصرف الظهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hsp90 هو كوصي الجزيئية في الخميرة وعضو في الأسرة كوصي Hsp90. من خلال الذهاب من خلال دورة أتباز المعقدة التي تساعد الخطوات للطي في وقت متأخر من العديد من العملاء البروتين. يتطلب كفاءة للطي نقل العملاء من HSP70 والتفاعل من Sti1/Hop المشترك كوصي. Sti1 يربط مباشرة إلى Hsp90 ويسهل العميل ملزم عن طريق تثبيط النشاط أتباز Hsp90 ل. تمت دراسة تفاعل مع Hsp90 Sti1 مؤخرا باستخدام HX-MS 23. نحن هنا تقديم نتائج ممثلة من التجارب الأساسية بعد بروتوكول أعلاه.

تم اختبار المباشر التفاعل البروتين البروتين بواسطة وصفها بروتين معقد في حالة توازن مع D 2 O ومقارنة الببتيد أطياف Sti1 في غياب وجود مؤامرة الناتجة Hsp90.The الفرق يمكن أن يرى في الشكل 5A (بيانات من 23). موجهة الببتيدات من الأعلى إلى الأسفل بدءا من N-محطة. الببتيدات معظمها فيTPR2a وTPR2b تظهر حماية قوية في وجود Hsp90 (قيم سالبة لD + Hsp90 - D-Hsp90)، مشيرا إلى أن هذه المناطق تتفاعل مع Hsp90. يمكن بسهولة أن ترشيد الحماية في TPR2a من التركيب البلوري للSti1-TPR2a-TPR2b في مجمع مع الببتيد-C التي تمثل محطة MEEVD-عزر من Hsp90 (الشكل 5B). ولم يلاحظ مثل هذا واضح في حماية البروتين البروتين التفاعلات دائما. حماية في Hsp90 بحضور Sti1 ليس كما وضوحا وليس كما المترجمة كما في Sti1 (أرقام 5C و 5D). عرض كل الببتيدات زيادة طفيفة الحماية من التأسيس دوتيرون بحضور Sti1. من الواضح Sti1 تستقر Hsp90 عالميا كما لا توجد منطقة من البروتين يظهر مزيدا من المرونة في وجود Sti1. ومع ذلك يمكننا أن لا يميز، إذا كان هذا التأسيس خفض دوتيرون تنبع من التفاعل المباشر مع Sti1 أو من خلال الآثار تفارغي على التشكلمن Hsp90. المعلومات التي تم الحصول عليها يقلل من موقع التفاعل المفترضة لعدد قليل من الببتيدات (مثل الببتيد 43-62 من NBD). تجارب إضافية مثل يشابك تستخدم عادة لتأكيد مواقع الربط بعد HX-MS 23. من المذكرة، وانخفضت التغطية تسلسل Hsp90 عند قياس معقدة Hsp90-Sti1. منذ تم إضافة Sti1 تتجاوز 3.5 أضعاف وكان المبلغ الإجمالي النظري من الببتيدات في تحليل بعض من أعلى أربعة أضعاف مع Hsp90 وحدها. هذا يزيد من خطر الببتيدات Sti1 يطغى أو تداخل الببتيدات Hsp90 خلال التحليل. لتحسين لتغطية أعلى تسلسل الفصل الكروماتوغرافي أفضل ويبدو أن النهج الواعدة.

احتمال واحد لدراسة ديناميات البروتين مناطق مختلفة هو استخدام الوسم المستمر HX-MS. أنه ينطوي على حضانة معايرتها عينة البروتين في D 2 O لفترات مختلفة من الزمن، وبالتالي يسمح التوقعات بشأن استقراريوضح شرائح البروتين الفردية. الشكل 6 أطياف الببتيد 43-62 من بنك دبي الوطني من Hsp90 في وجود وعدم وجود فائض 3.5 أضعاف من Sti1. وقد تم اختيار الأوقات الحضانة على مقياس لوغاريتمي (10 ثانية و 100 ثانية، و 1،000 ثانية) للحصول على تغطية جيدة خلال نافذة زمنية واسعة. تظهر أطياف الببتيد وقت التأسيس تعتمد من الديوتريوم في البروتين الذي يزيد عن الأوقات الحضانة لفترة أطول. لالببتيد 43-62 الصرف يتبع آلية EX2 حيث كثافة ك ك << البنود. درجة الحماية يتغير طوال فترة حضانة، والتي تبين الفرق الكبرى في أقصر فترة حضانة وسعر الصرف مماثلة تقريبا في أطول نقطة زمنية. هذا يشير إلى وجود استقرار درجة أقل أو منطقة من التفاعلات الديناميكية مع التفكك المتكررة وإعادة الترابط. إما هو حماية لوحظ نتيجة لانخفاض سعر الصرف الكلي للبروتونات أميد في الببتيد أو تأثير يمكن أن تسند إلى واحد أو اثنينالبروتونات أميد محددة تبادل ببطء أكثر في وجود Sti1. في هذه الحالة وهذا الأخير هو أكثر احتمالا بكثير كما كشفت التركيب البلوري Hsp90 هذه المنطقة أن تكون حلقة تتعرض بدلا من هيكل الثانوية العادية مثل اللوالب أو α β اوراق.

من المهم أن نذكر أنه لم يتم طرح تبادل مرة أخرى من البيانات التي تظهر مما يعني أن الآثار الملاحظة سوف تكون أكثر وضوحا بمجرد تطبيع للتحكم بنسبة 100٪.

الشكل 1
الشكل 1. الإعداد لHPLC HX-MS. تعيين أ) تكوين نموذجي من HX-MS المباراة. تمثل المناطق الملونة المختلفة أقسام الحفاظ على درجات حرارة مختلفة. يتم حقن العينة في حلقة عينة من صمام حقن (في وضع الحمل، سماوي) وبعد تبديل صمام إلى "وضع حقن" (أسود) من خلال ضخالعمود البيبسين في صمام 6 الميناء. يتم الحفاظ على العمود البيبسين تقريبا في 10 درجة مئوية لتحسين النشاط الأنزيمي من البيبسين. صمام 6 الميناء وضعين، "الوضع تحميل / إزالة الملوحة" و "الوضع شطف" (انظر ب). بعد إزالة الملوحة من العينة يتم فصل الببتيدات chromatographically مع التدرج أسيتونتريل التحليلية على عمود عكس المرحلة. ثم يتم رش الببتيدات في مطياف الكتلة مع المصدر ESI. ب) وسائط صمام 6 الميناء. مباشرة بعد HX صمام 6 المنفذ هو في "تحميل / إزالة الملوحة المركز" إلى اعتراض الببتيدات الهضمية على العمود الفخ. واستمر هذا لمدة تصل إلى ثلاث دقائق لإزالة أي أملاح أو مركبات المخازن المؤقتة ردود الفعل التي يمكن أن تتداخل مع مطياف الكتلة. بعد هذا التبديل صمام 6 منافذ في "الوضع شطف" وضع العمود فخ تحميلها في مسار تدفق المضخة بين التدرج والعمود التحليلية. الببتيدات الهضمية المحاصرين أزل الآن من فخ coluمليون وانفصلوا في التدرج من 0.1٪ الفورميك حمض الفورميك acid/0.1٪ في أسيتونتريل.

الرقم 2
الشكل 2. تدفق مخطط تجربة HX. 1) يتم تنقية البروتين المستهدف والمتوفرة في مخازن القياسية دون المنظفات. 2) يتم هضم البروتين إنزيمي مع البيبسين ويتم تحديد الببتيدات الهضمية ويتميز جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS). إلا بعد الحصول على تسلسل، تهمة الدولة والاحتفاظ الوقت من العديد من الببتيدات ممكن HX-MS لا يمكن أن يؤديها بنجاح. 3) يتم تعيين ظروف تجريبية تصل مثل الحضانة من البروتين في ظل ظروف معينة (إضافة مركب يجند / الكيميائية أو تغير في درجة الحرارة أو الحموضة. يتم تنفيذ 4) HX عن طريق تمييع العينة 1:10 أو أعلى في D 2 O العازلة . يجب أن تكون عازلة O D 2 مطابقة للعينة العازلة لافوآثار العازلة الهوية. ثم يتم تحضين العينة بالضبط لفترة محددة من الزمن. 5) بعد مرور فترة الحضانة تطفئ رد فعل وحقنها في نظام HPLC-MS. العينة هو المشقوق إنزيمي ويتم فصل الببتيدات الهضمية مما أدى إلى المذيبات العضوية والتدرج حقنها في مطياف الكتلة. 6) تحليل أطياف الببتيد التي تم الحصول عليها. تتم مقارنة النقطة الوسطى من أطياف الببتيد تحت ظروف التفاعل مختلفة. ويمكن القيام بذلك يدويا مع برامج مناسبة أو تلقائيا باستخدام برنامج التحليل HX.

الرقم 3
الرقم 3. آلية تبادل الهيدروجين. رد الفعل الصرف الهيدروجين يمكن يحفزه قاعدة أو حمض وبالتالي هو الرقم الهيدروجيني تعتمد مع سعر صرف الحد الأدنى من درجة الحموضة بين 2.5 و 3 اعتمادا على السلاسل الجانبية من مخلفات المرافقة السندات أميد 6. دوتحلية حلقة وفصل الكروماتوغرافي من الببتيدات، والتي تتم في H 2 O المذيبات المحتوية على، ويتم تبادل دوتيرونس أدرجت يعود لالبروتونات وفقا لنفس الآلية ("تبادل العودة"). وبالتالي، والتحسين من النظام والمذيبات المستخدمة أمر حاسم للحد من الخسائر في دوتيرونس يدمج.

الرقم 4
الشكل 4. مبدأ HX-MS. ملزمة ليجند لنتائج البروتين في حماية العمود الفقري أميد الهيدروجين في موقع ملزم من المذيب المحيطة بها. هذا يقلل من معدلات تبادل البروتونات المتضررة ويقلل من إدماج دوتيرونس. لأن الفرق بين وزن البروتون ودوتيرون هو 1 دا، والببتيدات المشتقة من هذه المنطقة من البروتين تظهر انخفاض م / ض في مطياف الكتلة. مقارنة أطياف الببتيد من التجاربفي غياب وجود شريك ملزم سوف تكشف عن وجود تحول من النقطه الوسطى من الأطياف إلى خفض قيمة م / ض (الحدث الحماية). المناطق التي تظهر بارزة الحماية بعد إضافة شريك ملزمة هي مواقع الملزمة المحتملة. اعتمادا على التغطية تسلسل وتوافر تداخل الببتيدات مواقع الربط يمكن يضيق الخناق على عدد قليل من الأحماض الأمينية.

الرقم 5
الرقم 5. تفاعل Hsp90 وSti1. لذلك، من مؤامرة الفرق دوتيرون إدماجها Sti1 في وجود شريك ملزم Hsp90 ناقص دوتيرون إدماجها Sti1 في غياب Hsp90 (بيانات من 23). ب، كارتون تمثيل جزء من Sti1 تضم TPR2a وTPR2b (PDB كود 3UQ3) في مجمع مع الببتيد الذي يمثل محطة C-MEEVD عزر من Hsp90. هو لون الكرتون أكورقرع لعدد البروتونات أميد محمية من دوتيرون التأسيس على النحو المشار إليه. ج، مؤامرة من الفرق Hsp90 في وجود شريك ملزم Sti1. الملاحظة التأسيس دوتيرون في Hsp90 بعد 10 دقيقة حضن مسبق مع الإصدار 3.5x الزائدة Sti1 عند 30 درجة مئوية و 30 ثانية؛ HX في نفس درجة الحرارة. وقد أجريت التجربة في ثلاث نسخ ويظهر الخطأ المعياري للمتوسط ​​لكل الببتيد. القيم السلبية العالمية دلالة على انخفاض إدماج دوتيرونس وبالتالي ارتفاع الاستقرار الشامل في Hsp90 جود Sti1. مرة أخرى لا يعتبر الصرف في هذه التجربة. د، والتمثيل الكرتون من الخميرة Hsp90 (PDB كود 2CG9) الملونة وفقا لعدد من البروتونات أميد محمية من دوتيرون التأسيس كما هو مبين في ب. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 6. بالطبع وقت دوتيرون إدماجها الخميرة Hsp90 في غياب وجود Sti1. لذلك، غير المجهزة الببتيد أطياف الببتيد 43-62 من المجال النوكليوتيدات ملزم من Hsp90 بعد تبادل وضع العلامات المستمر الهيدروجين. وحضنت 20 ميكرومتر Hsp90 مع 70 ميكرومتر Sti1 لمدة 10 دقيقة عند 30 درجة مئوية للوصول إلى التوازن وD 2 O تم تنفيذ وضع العلامات عند 30 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 100 ثانية، و 1،000 ثانية. علامات متناهية الحمراء تشير إلى النقطة الوسطى يحسب لكل الببتيد. ب، حركية تبادل الببتيد 43-62 في حضور وغياب الإصدار 3.5x الزائدة Sti1. لا يعتبر الصرف مرة أخرى في هذه التجربة.

الرقم 7
الرقم 7. أمثلة لالببتيد الأطياف مع distribut النسقينأيون. لذلك، دوتيرون إدماجها E. القولونية Hsp90 في غياب وجود ATP (بيانات مأخوذة من 22 ملحق. الشكل 3). وتظهر أطياف بقايا الببتيد 192-206 قبل الحضانة في D 2 O (0٪ D)، بعد 30 ثانية، 5 دقائق، 10 دقيقة، 30 دقيقة، والحضانة في D 2 O، والسيطرة 100٪ (100٪ D) . في غياب ATP (ATP) لوحظ السلوك الصرف EX2 نموذجية. في وجود ATP (+ ATP) لوحظ حماية قوية في 30 ثانية، وفي 5 دقائق و 10 دقيقة التوزيعات ذات النسقين من قمم النظائر، مشيرا إلى اثنين من السكان من البروتينات، والسكان واحدة مماثلة لحالة ATP ملزمة ومماثلة الثانية ل الدولة خالية من النوكليوتيدات. في 30 دقيقة يلاحظ أي فرق بين عدم وجود ATP. وعلى الأرجح تسبب في توزيع ذات النسقين من قبل ATP التحلل والتحول من خلال الدولة خالية من النوكليوتيدات مع مرونة أكبر في هذا الجزء البروتين. هذه الأطياف تشبه الكلاسيكية ريجي الصرف EX1لي. ب، توزيع ثنائي الصيغة من قمم النظائر في النبض وضع العلامات التجارب HX. E. وقد حضنت القولونية Hsp90 في غياب ATP أو في وجود ATP ل10-300 ثانية وبعد ذلك النبض المسمى لمدة 10 ثانية في D 2 O كما هو مبين (بيانات مأخوذة من 22 الشكل 4A). تشير التوزيعات ذات النسقين مرة أخرى اثنين من السكان التعايش من الجزيئات، واحدة تبادل البروتونات بسرعة أكبر أميد لدوتيرونس من الآخر. ATP يؤدي الى التحول البطيء من أسرع تبادل في التشكل تبادل أبطأ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ملزمة من شريك إلى التفاعل البروتين حتما يسبب تغيرات في الوصول المذيب على موقع ملزمة. بالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتينات تغيرات ديناميكية بتكوين عليها ملزمة، والتي تؤثر على مناطق أخرى من واجهة الربط الفعلي. HX-MS هو طريقة قوية لرصد هذه التغيرات وحتى قادرة على الكشف عن التغييرات متعلق بتكوين جزئي في البروتينات على الجداول الزمنية التي وسائل أخرى لا يمكن أن تغطي.

لأداء HX-MS بنجاح ثلاث نقاط حاسمة: 1) لإعداد النظام الأمثل؛ 2) التنفيذ الدقيق لتجهيز العينات و3) تحليل البيانات حذرا عند تعيين الببتيد الأطياف وتفسير النتائج.

إعداد نظام

منذ يستخدم مطياف الكتلة للكشف عن إدماج دوتيرون في الببتيدات، تطبيق نفس الاحتياطات بشأن إعداد نموذج لHX-MS. المنظفات والأملاح والمركبات الأخرى التي تتداخل مع مطياف الكتلة شويونيتبول تجنبها أو إزالتها قبل التحليل. بينما HX-MS يسمح تحليل البروتين المجمعات الكبيرة، وتعقد العالي يطالب زيادة نوعية الانفصال الببتيد وقياس الطيف الكتلي. تعظيم الاستفادة من الظروف الكروماتوغرافي هو مفتاح الحصول على بيانات ذات نوعية جيدة. هذا ينطوي على اختيار المذيبات العضوية عالية الجودة، والمواد عكس المرحلة وكذلك تعظيم الاستفادة من التدرجات والمذيبات. غسل الأعمدة مع المذيبات العضوية ويمكن أن يتم بين عشية وضحاها وبين التجارب للحد من إشارة الخلفية. ينبغي أن يكون الأمثل طرق قياس الطيف الكتلي للكشف عن الببتيدات الهضمية (بين 300-1،200 م / ض). الطيف الشامل عالية الدقة يسهل إلى حد كبير لأن تحليل البيانات المتداخلة جزئيا مجموعات الذروة النظائر منشؤها من الببتيدات مختلفة يمكن تمييزها.

تجهيز العينات أمر حاسم لHX-MS. وعادة ما يتم نسج لدينا مخازن وعينات لمدة 10 دقيقة في 13،000 دورة في الدقيقة (microfuge) لإزالة الركام والجسيماتكليس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تثبيت عدة مرشحات المضمنة في نظام HPLC لمنع انسداد الأعمدة. الانحرافات الطفيفة في D 2 O مرات الحضانة يمكن أن يكون لها آثار كبيرة. بالنسبة للمناطق البروتين مرنة جدا وجود اختلاف في بضع ثوان فقط يمكن أن تجعل الفرق بين أي إدراج دوتيرون على الإطلاق، ومعالجة بالديوتريوم الكامل. منذ ديناميات البروتين وكذلك سعر الصرف الجوهرية هي وظيفة من درجة الحرارة، والحضانة من العينة ومخازن هي درجة الحرارة التي تسيطر عليها بإحكام. فإنه من المفيد أن نكرر دائما التسلسل الدقيق للخطوات كل تجربة. إذا نفذت بشكل صحيح الخطأ بين تجربتين سوف تكون صغيرة نسبيا. اليوم، هي النظم الآلية لHX-MS المتاحة تجاريا وتقليل تحديات تجهيز العينات.

تحليل البيانات

الخطوة الأكثر أهمية في HX-MS هو تحليل البيانات، ولا سيما تعيين الببتيد الأطياف وتحديد مستويات معالجة بالديوتريوم. ال(ه) من الناتج HX-MS هو ملف تعريف شطف التدرج الكروماتوغرافي التي تحتوي على عدد كبير من الببتيد الأطياف. مهمة المشغلين لتعيين هذه الأطياف إلى الببتيدات التي حددها MS / MS في الخطوة 6) من البروتوكول. هذا يمكن أن يكون صعبا نوعا ما الأطياف يمكن أن تحول ملحوظ نحو أعلى م / ض بعد HX. أيضا تداخل جزئي من أطياف قد يعقد احالة الببتيدات. في هذه الحالة استخدام الطيف الشامل عالية الدقة مع دقة عالية الشامل يؤتي ثماره لأنهم في كثير من الأحيان يمكن حل الببتيدات متداخلة. يتم حساب الفروق في دوتيرون التأسيس على أساس النقطة الوسطى من الببتيد الأطياف. يمكن تحديد النقطة الوسطى: 1) يدويا عن طريق وضع علامة كل النظائر الذروة من الطيف الببتيد ونقل قيمها لكثافة وم / ض في برنامج جداول البيانات (مثل اكسل ومايكروسوفت) واحتساب النقطه الوسطى أو 2) مع البرامج المصممة لتعيين قمم النظائر الانتماء إلى الببتيد المحددة وحسابالنقطة الوسطى تلقائيا (على سبيل المثال HDExaminer، سييرا تحليلات أو HeXicon 24،25).

تعظيم الاستفادة من HX-MS

إذا كان عدد من الببتيدات للتقييم منخفض جدا، وهناك العديد من الاحتمالات الأخرى لتحسين التجربة: 1) تحسين اللوني (المذيبات، وطول / شكل التدرج، واستخدام مختلف المواد عكس المرحلة) أو 2) تغيير الانقسام الأنزيمية لل البروتين (البديل البروتيني، أطول / أقصر فترة حضانة مع البيبسين، إضافة تغيير طبيعة كلاء لإخماد المخزن المؤقت). كل من المعلمات تغيير سلوك شطف من الببتيدات كما يغير إما تجمع الببتيد نفسه أو الانفصال HPLC. كلا النهجين الأمثل تأتي بسعر الحاجة إلى recharacterize الببتيدات. سوف البروتياز الأخرى تنتج الببتيدات المختلفة التي يجب أن تحددها MS / MS ويتميز كما هو موضح في الخطوة 6.6). سوف تتغير الظروف اللوني لا يغير تجمع الببتيد لكن منظمة الشفافية الدولية الاحتفاظMES من الببتيدات الفردية. ثم لديك مرات الاحتفاظ إلى أن redetermined كما في الخطوة 6.5). وتجدر الإشارة إلى أن أوقات الاحتفاظ دائما أعلى وسوف تقلل من كمية تسمية اكتشاف ما يعود الزيادات الصرف في بعض الأحيان الاحتفاظ لفترة أطول. تطبيع البيانات إلى السيطرة بنسبة 100٪ هو أفضل طريقة للتعامل مع الصرف الظهر. تبادل ظهر عالية يؤدي إلى فقدان دوتيرونس أدرجت وبالتالي فإن الإشارة. فمن المستحسن لتقليل كمية الصرف إلى الحد الأدنى. تجدر الإشارة إلى أن مختلف الاجهزة HX-MS سيكون لها معدلات متباينة الصرف مرة أخرى، اعتمادا على الأجهزة، وتكوين مخازن والمذيبات المستخدمة ونوع من التدرجات التي تستخدم 26.

تفسير البيانات

عند تحليل البيانات، وتوزيع كثافة قمم النظائر يحتاج إلى تقييم دقيق لأنها يمكن أن تعطي مؤشرات لآلية الصرف. لالببتيدات مع كتلة من أقلمن 2،000 دا شدة القمم النظائر من العينة unexchanged غير متماثل بصورة عامة مع شدة أعلى للmonoisotope أو أول العالي النظائر الذروة. بالنسبة لنظام الصرف EX2 هذا التوزيع كثافة غير المتماثلة يصبح مثل جاوس مع زيادة الوقت في D 2 O وزيادة التحول إلى أعلى م / ض وعرض زيادة الكتلة النظائر بنحو 50٪ (الشكل 7). كما ذكر في مقدمة EX2 لوحظ الأكثر شيوعا في HX-MS في ظروف الأصلي والمعدل الملاحظ الصرف يتناسب مع التوازن تتكشف ثابت K u و بالتالي إلى الاستقرار الحرارية من البروتين. في المقابل، لنظام الصرف EX1 لوحظ توزيع عرض الزيادات كتلة النظائر بشكل ملحوظ وكثافة التوزيع ذات النسقين أو المتعدد الوسائط (انظر الشكل 7) 25،27. التوزيعات ذات النسقين النظائر تشير دائما اثنين أو أكثر من الأنواع المختلفة جزيءفي التحليل، والتي يمكن أن تكون مثيرة للاهتمام. ومع ذلك، هناك نوعان من المزالق. أولا، قد تتكون الكتلة من النظائر قمم القادمة من اثنين الببتيدات مختلفة. وبالتالي فإنه إلزامي للتحقق من أطياف العينة unexchanged لالببتيدات مع مماثلة م / ض وتهمة مماثلة. هذه الببتيدات عادة تختلف قليلا في الوقت الاحتفاظ وتوزيع كثافة قمم النظائر يختلف مع الوقت شطف. في الطيف الشامل عالية الدقة، قمم النظائر التي لا تنتمي إلى نفس الببتيد ويمكن أيضا أن تميز من قبل عشرية من القيم م / ض. الثاني، لوحظ المرحل من السابق HPLC-MS المدى 28. يبدو ان هذه المرحل الأنواع nonexchanged كما ويمكن القضاء عليه من خلال أشواط HPLC التدرج فارغة بين أشواط التحليل. هناك أسباب كثيرة لواضحة نظام الصرف EX1. 1) في التجارب HX بحضور denaturants EX1 كثيرا ما لوحظ 29. 2) الموضع العفوي أو المتعمد، عكسها أو لا رجعة فيهالقاعدة أو العالمية التي تتكشف من البروتينات يسبب السلوك EX1 7،30،31. 3) التحولات بتكوين التي هي بطيئة بالمقارنة مع HX الناجمة عن دوران مثل الركيزة، ATP التحلل تسبب توزيعات النظائر ذات النسقين تشبه نظام الصرف EX1 (الشكل 7A) 22. 4) يجند التي يسببها التحولات بتكوين بطيئة في التجارب نبض وضع العلامات أيضا يحمل توقيع مثل EX1 (الشكل 7B) 22.

تفسير البيانات التي تم الحصول عليها في نهاية المطاف هو ما يجعل HX-MS هذه التقنية صعبة ولكنها أيضا قوية. مطلوب معرفة واسعة ديناميات البروتين للحصول على كل وسيلة من أنماط الحماية / deprotection الملاحظة إلى نموذج الآلية ديناميات البروتين. مع ذلك، وانتاج نوعية عالية البيانات HX-MS يمكن القيام به في غضون وقت قصير نسبيا واستنساخه للغاية. تفسير البيانات يستفيد بوضوح من أي معلومات إضافية على هيكل بروتين استثمارigated. على الجانب الآخر، يمكن HX-MS التي تشير إلى أجزاء من البروتين مرنة، والتي قد يكون من الضروري إزالة لتسهيل بلورة لتحديد الهيكل.

HX-MS هو الأسلوب الذي الأرباح بشكل كبير من الابتكارات في مطياف الكتلة واللوني. A مسبقا الأخيرة في HX-MS هو استخدام nanodiscs الدهون لتحليل البروتينات الغشاء الذي يوسع كذلك استخدام هذه التقنية 32. أيضا استخدام نقل الإلكترون تفارق (المفتشون) والإلكترون القبض على التفكك (تنمية الطفولة المبكرة) تظهر إمكانات قوية لHX-MS كما أنه يزيد من حل دوتيرون أدرجت إلى مستوى الأحماض الأمينية واحد 11،12 33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

نشكر M. بويسن للتعليق على المخطوطة. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل جمعية الألمانية للبحوث (SFB638 وMA 1278/4-1 لإم، والكتلة التميز: CellNetworks EXC 81/1). إم هو محقق من الكتلة التميز: CellNetworks.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
maXis QTOF Bruker
nanoAcquity UPLC Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator Valco #EPC6W
Injection valve (manual) Rheodyne #7725
Poros AL20 media Applied Biosystems #1-6029-06
Poros R2 Applied Biosystems #1-1118-02
Pepsin Sigma #P6887 use fresh pepsin
Microbore (1 mm) IDEX #C-128
Microbore (2 mm) IDEX #C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column Waters Corp. #186002876
Thermomixer Eppendorf #5355000.011
Tubing (various diameters) IDEX
Fittings IDEX #PK-110 with PK-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saibil, H. R. Conformational changes studied by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).
  2. Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
  3. Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).
  6. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  7. Rist, W., Jørgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange. The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).
  8. Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).
  9. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
  10. Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins. Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).
  11. Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., Jørgensen, T. J. D. Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).
  12. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements. J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).
  13. Yamada, N., Suzuki, E. -I., Hirayama, K. Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).
  14. Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry. Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).
  15. Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange. Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).
  16. Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).
  17. Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry. Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).
  18. Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry. J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).
  19. Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry. Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).
  20. Lanman, J., Lam, T. T., et al. Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry. J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).
  21. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  22. Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine. EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).
  23. Lee, C. -T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1. EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).
  24. Lou, X., Kirchner, M., et al. Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments. Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).
  25. Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon. Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).
  26. Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).
  27. Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).
  28. Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses. Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).
  29. Deng, Y., Smith, D. L. Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates. Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).
  30. Wales, T. E., Engen, J. R. Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale. J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).
  31. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator. J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).
  32. Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  33. Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).

Tags

الكيمياء، العدد 81، الوصيفات الجزيئية، الطيف الشامل، الأحماض الأمينية، الببتيدات والبروتينات والإنزيمات، المرافقات، وديناميات البروتين، والتغيرات متعلق بتكوين جزئي، allostery والبروتين للطي وبناء الثانوية، قياس الطيف الكتلي
تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing… More

Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (81), e50839, doi:10.3791/50839 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter