Summary
Protein konformation och dynamik är nyckeln till att förstå sambandet mellan proteiners struktur och funktion. Väte utbyte kombination med högupplösande masspektrometri är en mångsidig metod för att studera konforma dynamiken av proteiner såväl som karakterisera protein-ligand och protein-proteininteraktioner, inklusive kontaktytor och allosteriska effekter.
Abstract
Alla cellulära processer beror på funktionaliteten hos proteiner. Även om funktionaliteten hos ett givet protein är en direkt följd av dess unika aminosyrasekvens, är det bara realiseras genom vikning av polypeptidkedjan till en enda definierad tredimensionell konstruktion, eller mer allmänt i en ensemble av interconverting konformationer. Undersöka sambandet mellan proteinkonformation och dess funktion är därför viktigt för en fullständig förståelse av hur proteiner kan uppfylla sin stora variation av arbetsuppgifter. En möjlighet att studera strukturförändringar ett protein genomgår samtidigt utvecklas genom sin funktionella cykel är väte-1 H / 2 H-utbyte i kombination med högupplösande masspektrometri (HX-MS). HX-MS är en mångsidig och robust metod som tillför en ny dimension till strukturell information som erhållits genom t.ex. kristallografi. Det används för att studera protein-och utfällning, bindning av små molecule ligander, protein-proteininteraktioner, konformationsförändringar som är kopplade till enzymkatalys och allostery. Dessutom är HX-MS används ofta när mängden av protein är mycket begränsad eller kristallisation av proteinet inte är genomförbar. Här ger vi ett allmänt protokoll för att studera proteindynamik med HX-MS och beskriver som ett exempel hur man kan avslöja samspelet gränssnittet av två proteiner i ett komplex.
Introduction
Antalet kristallstrukturer hos proteiner och proteinkomplex ökat snabbt under senare år. De presenterar ovärderliga ögonblicksbilder av den strukturella organisationen av dessa proteiner och ge underlag för struktur-funktionsanalys. Men dynamiken i proteiner och de strukturförändringar som är väsentliga för deras funktioner, sällan avslöjas av röntgenkristallografi. Cryo-elektronmikroskopi, å andra sidan, är i stånd att fånga upp protein-och protein-komplex i olika konformationer, men i allmänhet inte kan lösa konformationsförändringar ned till sekundärstrukturen nivå 1. Konforma dynamik proteiner i lösning vid atom uppgifter kan endast lösas genom NMR, men denna metod är fortfarande begränsad till proteiner av relativt liten storlek (vanligen ≤ 30 kDa) och behöver höga halter av proteiner (≥ 100 M), vilket försvårar försöken med oligomeriserings eller aggregering utsatta proteiner 2. En metod somkan överbrygga mellan högupplösta röntgenkristallografi och Cryo-elektronmikroskopi och som inte begränsas av proteinstorlek eller koncentration är amid väte-1 H / 2 H-utbyte (HX) i kombination med masspektrometri (MS). Under senare år har denna metod har utvecklats till ett värdefullt analytiskt verktyg för analys av proteindynamik, proteinveckning, proteinstabilitet och konformationsförändringar 3-5. Den molekylära grunden för denna metod är den labila naturen hos ryggrads amid-väten i proteiner, som kommer att växla med deuteriumatomer när proteinet placeras i en D-2 O lösning. Den efterföljande ökning av proteinmassan över tiden mäts med högupplösande MS.
I korta ostrukturerade peptider HX endast beror på temperatur, katalysatorkoncentration (OH -, H 3 O + dvs pH, se figur 3) och aminosyrasidokedjor hos intilliggande rester på grund av induktiva, katttiskt och steriska effekter. Dessa effekter på den inneboende kemiska växelkurs k ch har elegant kvantifierats av Bai et al. 6 och ett program är tillgänglig (artighet Z. Zhang), som beräknar k ch för varje aminosyra i en polypeptid beroende av pH och temperatur. Vid neutralt pH-värde och omgivningstemperaturer k ch är i storleksordningen 10 1 -10 3 sek -1. I veckade proteiner kan HX vara 2-9 storleksordningar långsammare främst på grund av vätebindning i den sekundära strukturen och i mindre grad på grund av begränsad tillgång av hydratiserade OH - joner till det inre av en tätt vikta proteinet. HX i naturliga proteiner blandar därför partiell eller globala utbredning, kemiskt utbyte och återveckning till det nativa tillståndet enligt ekvation (1) och de observerade växelkurser k obs beror på öppningshastigheten k op, balansdagens valutakurs k cl och den inneboende kemiska utbytes rate k ch enligt ekvation (2).
Under infödda state k op är mycket mindre än k lm och kan försummas i nämnaren. Det finns två extrema växelkurssystem som kallas EX1 och EX2. Om k cl är mycket mindre än k lm (EX1) Den observerade hastigheten är praktiskt taget lika med öppningshastighet och HX tillåter omedelbar observation av utvecklandet av ett strukturelement. Ett sådant utbyte regim, där alla amid protoner utbyte på en gång vid öppning av strukturelementet är direkt observerbara som MS av en bimodal fördelning av isotoptoppar 7. Om k cl är mycket större än k lm (EX2) den observerade hastigheten är proportionell mot k ch varvid proportionalitetskonstanten är lika med fällbara-utspelas jämvikter konstanten K u = k op cl. Under dessa förhållanden, många öppnings-och stängningshändelser krävs innan alla amid protoner utbyte mot deuteroner, vilket leder till en gradvis ökning av genomsnittlig massa medan isotopfördelningen förblir ungefär samma. EX2 regim medger bestämning av den fria energin för uppveckling AGu och därigenom stabilitet hos ett strukturelement. Under infödda state är EX2 regimen vanligast. Ökning av pH och tillsats av kaotropa medel kan skifta utbytet mekanismen till EX1. Därför kan HX-MS att användas för att undersöka termodynamiska samt kinetiska parametrar av proteinveckning och konformationsförändringar.
Såsom nämnts ovan HX är inneboende pH-och temperaturberoende och utbytet halveringstiden för en helt lösningsmedel exponeras proton av ryggraden amidgruppen är mellan 5-400 msek vid fysiologiskt pH (pH 7,6) och 30 ° C, men 10 min till> 15 timmar med ett genomsnitt på> 2 timmar vid pH 2,9 och 0 °C (utom för protonen hos den första ryggraden amidbindning av en polypeptid, som utbyte med en halveringstid av ca. 1-2 min). Under sådana långsam utbyta förhållanden är det möjligt att smälta provet med hjälp av proteaser (t.ex. pepsin) som är aktiva under dessa förhållanden, utan att förlora all den information som finns i de ingående deuteroner. Sedan införandet av peptiska matsmältning under långsam utbyter förhållanden, kan inte bara den totala HX kinetik fullängds proteiner analyseras men HX kan lokaliseras till specifika regioner 8,9. Spatial upplösning är för närvarande begränsad till storleken på de peptiska fragment genereras, vilket är i allmänhet mellan 10-30 rester. Emellertid kunde överlappande fragment som skapas på grund av den icke-specifika naturen av klyvning med pepsin leda till en ökning i rumslig upplösning. Dessutom har flera andra proteaser befunnits vara aktivt i dämpningen förhållanden, dock mycket mindre effektiv än pepsin 10. Ytterligare increase av rumsliga upplösningen kan nås med fragmentering av peptider i gasfas med metoder som bevarade den deuteration mönstret såsom elektroninfångnings dissociation (ECD), elektronöverföring dissociation (ETD) och infraröd multi dissociation (IRMPD) 11-13. Dessa tekniker för att förhindra förlust av rumslig upplösning på grund av intramolekylär proton migration ("krypteringskod"), som kan observeras genom kollision inducerad dissociation (CID) är det mest använda fragmentering teknik. Men dessa metoder kräver optimering för varje individuell peptid och är således fortfarande ganska utmanande.
HX-MS har använts för att analysera protein-ligand och protein-proteininteraktioner, inklusive virala kapsiden aggregatet 14-17. Protein utspelas och omveckning samt temperatur inducerade konformationsförändringar undersöktes 7,18,19. Fosforylering och enkel aminosyramutation relaterade konformationsändringar 16,20 och nucleotide-inducerade förändringar analyserades 21,22. Därför verkar den här metoden passar utmärkt för att analysera sammansättning och dynamik molekylära maskiner. En attraktiv kandidat, vars mekanism är av stort allmänt intresse, är det Hsp90 förkläde komplexet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av buffertar och proteinprover
- Förbered H2O buffert. Användning Hsp90 standardbuffert (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol) som H 2 O-buffert.
OBS: Om provet har dialyseras före analys, använd dialysbufferten som H2O buffert. Det är väsentligt att den D2O buffert skiljer sig från H 2 O buffert endast i väteisotop. Flyktiga buffertar som NH 4 CO 3 eller NH 4-acetat eller buffertkomponenter är inte lämpliga! - Förbered D 2 O buffert genom frystorkning av Hsp90 standard buffert med hjälp av en vakuum koncentrator. Efter fullständig avdunstning av H 2 O lägga ren D2O till röret för att nå den totala ursprungliga volymen (t.ex. 1 ml buffert med 15% glycerol kräver tillsats av 850 | il D2O). Upprepa fullständig avdunstning av buffert och återupplösa buffert / salt comnenter i D 2 O 2x.
- Förbered släcka buffert (0,4 M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 pH 2,2).
OBS: För att förbättra effektiviteten i peptiska sammandrag av mycket stabila proteiner 4 M guanidinhydroklorid och 0,5 M Tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP-HCl) kan läggas till. - Förbered kontrollprov 100% (6 M guanidinhydroklorid, D2O). Lägg guanidinhydroklorid till en Hsp90 alikvot för att nå en slutlig koncentration på 6 M. Helt avdunsta H2O från provet och tillsätt D 2 O till röret för att nå den ursprungliga totala volymen (t.ex. 100 ^ prov med 10% glycerol kräver tillägg av 90 | il D2O). Upprepa fullständig avdunstning av buffert och återupplösa de buffert / saltkomponenter i D 2 O.
OBS: 20-100 pmol prov krävs för varje injektion. Förbered tillräckligt med prov för att få en 100% kontroll för varje dag i HX-MS-experiment. - Förbered 50 pmol Hsp90 i 5 ^ Hsp90 standardbuffert.
Anm: Ett belopp på 20-100 pmol prov krävs för varje punkt i rådata. Volymen av provet i reaktionen är 1-5 l idealt. Justera koncentrationen för att passa dessa krav. Varje buffert kan användas så länge som den inte innehåller detergenter eller flyktiga komponenter.
2. Framställning av immobiliserade Pepsin på aldehyd Aktiverade Pärlor
- Lös 80 mg färsk pepsin i 2 ml 50 mM natriumcitrat (pH 5).
- Lös 20 mg natriumcyanoborhydrid, handtag med omsorg (mycket giftigt!) I 1 ml 2 M Na 2 SO 4 och lägga till pepsin lösning.
- Inkubera blandningen i 10 minuter vid rumstemperatur under försiktig omskakning (t ex överliggande skakare).
- Addera 600 mg pärlor med immobiliserade aldehydgrupper till blandningen och inkubera i 5-10 min vid rumstemperatur.
- Lägg till 2,2 ml av 2 M Na 2 SO4 (pH = 5) i 100 | il alikvoter varje 3 min under en timme för att långsamt salt ut pepsinet. Blanda försiktigt provet mellan tillsatserna i en overhead-skakanordning vid rumstemperatur.
- Inkubera pepsin pärlorna vid 4 ° C under 14 till 16 tim / över natten i en överliggande skakare.
- Avbryt reaktionen genom tillsats av 1 ml 1 M etanolamin och inkubering vid rumstemperatur under 2 timmar.
- Centrifugera ner kulorna i ett 50 ml Falcon-rör vid 500 rpm, kasta supernatanten och resuspendera kulorna i 0,1% myrsyra. Upprepa detta steg 2x. Efter det sista centrifugeringssteget, kassera supernatanten och uppskattning volym av pärlor. Lägg till en motsvarande volym av 0,1% myrsyra och förvara vid 4 ° C.
3. Beredning av Kolumner för Amid Hydrogen-utbyte
- Använd vakt kolonner med en inre diameter av 1 mm för att fånga kolumner och med 2 mm för pepsin kolumner.
- Skruva en sida av förkolonnen och ta bort filtret. Tätt skruva packning funnel på den öppna änden av kolonnen. Använd en 1/16 tum adapter och slangen för att fästa en tom spruta (5 ml) till bottenutloppet av kolonnen. Se till att fixa det gastäta till vakten kolumnen.
- Applicera några droppar flytgödsel pärla material ovanpå tratten. Dra ut kolven i sprutan för att suga uppslamningen genom tratten in i skyddskolonnen. Applicera mer slurry pärla material på tratten och fortsätta proceduren tills vakten kolumnen är helt fylld med pärla material. Avlägsna tratten och placera filtret och filterringen på den öppna änden. Skruva fast kolumn locket på vakten kolumnen och ta bort sprutan från den andra sidan. Stäng båda ändarna av vakt kolumner med pluggar för att undvika uttorkning av kolonnmaterial.
4. Ställ in systemet för vätgas Exchange masspektrometri (HX-MS)
- Anslut fällan kolonnen med HPLC-systemet (fig 1). Jämvikta kolonnen genom inställning av flödeshastigheten förpump A till 0,4 ml / min med 0,1% myrsyra som lösningsmedel. Anslut inte pepsin kolumnen eller den analytiska kolonnen ännu.
- Kalibrera masspektrometer och ansluta utloppet av HPLC till källan för masspektrometern.
5. Fastställande av dynamiskt omfång för Exchange
- Förbered ultraren lösningsmedel A (0,1% myrsyra i vatten) och ultrarent lösningsmedel B (0,1% myrsyra i acetonitril); ready blandade lösningsmedel är kommersiellt tillgängliga. Rensa HPLC pumpar. Ställ in kromatografi och masspektrometri metoder i styrprogramvaran genom att välja ett program med en steggradient efter en kort avsaltningssteg. För fullängds Hsp90 använda en 1-2 min avsaltningssteg följt av omkoppling av 6-ports ventil från AVSALTA / LOAD för att eluera och en steggradient från 90% lösningsmedel A/10% lösningsmedel B till 5% lösningsmedel A/95% lösningsmedel B. Före injektion ställa in insprutningsventilen för att ladda och den 6-vägsventil för att avsalta / LADDAR läge.
Obs: Använd inte en pepsin eller analytisk kolonn under detta experiment. - Förbered 100-200 pmol av Hsp90 i 1-10 | il H2O buffert och inkubera under 10 min vid 30 ° C. Lägg temperatur justerad D 2 O buffert för att få provvolym upp till 100 l och inkubera exakt för en viss tid (t.ex. 10 sek, 100 sek, 1,000 sek). Addera 100 pl quench buffert och blanda genom att pipettera upp och ned. Injicera provet 200 | il i injektionsporten av insprutningsventil med en Hamilton-spruta. Starta kromatografi programmet och byta insprutningsventilen i INJECT läge. Efter två minuter växlar 6-vägsventil från AVSALTA / LADDAR för eluering. Upprepa detta minst tre tidpunkter.
- Upprepa steg 5,2 men lägg 2-3x överskott av Sti1 till Hsp90 provet före inkubation under 10 min vid 30 ° C.
- Bestäm fullängds proteinmassor genom deconvolution av spektra i massprogramvaru spektrometri. Beräkna antalet incorporated deuteroner genom jämförelse av molekylvikten för fullängds-Hsp90 med den observerade massan efter varje körning (t ex 10 sek, 100 sekund, 1000 sek).
- Plotta de ingående deuteroner för Hsp90 i frånvaro och närvaro av Sti1 (y-axeln) som funktion av tiden (x-axeln). Bestäm den tidspunkt i det dynamiska området, där skillnaden mellan de båda kurvorna är maximalt. Använd detta värde för inkubationstiden i D 2 O vid identifiering Hsp90-Sti1 gränssnitt och dynamik på peptidnivå.
6. Fastställande av Magsår peptider Använda MS / MS Spectra
- Anslut pepsin kolonn och analytiska kolonnen till systemet.
- Ställ in parametrarna för kromatografi och masspektrometri i styrprogramvaran genom att välja övertoningstyp och masspektrometri metod. Välj en lång sluttning (t ex mer än 90 min) för att säkerställa god kromatografisk upplösning. Aktivera MS / MS-spektra på masspektrometern.
OBS: Bra upplösningtion på HPLC och högmässa noggrannhet har högsta prioritet i det här steget. - Förbered 100-200 pmol av Hsp90 i 100 ^ il H2O buffert. Addera 100 pl quench buffert och blanda genom att pipettera upp och ned. Injicera provet 200 | il i injektionsporten av insprutningsventil med en Hamilton-spruta. Starta kromatografi programmet och byta insprutningsventilen i INJECT läge. Efter två minuter växlar 6-vägsventil från AVSALTA / LADDAR för eluering läge.
OBS: Om mer än ett protein som ska analyseras i HX-MS (dvs protein-proteininteraktioner gränssnitt) peptiderna för varje protein måste bestämmas individuellt. - Identifiera peptiska peptider av Hsp90 genom att söka en databas (dvs. Mascot) för de resulterande peptider.
OBS: Det är möjligt att använda en anpassad databas som målet är att så många peptiska peptider som möjligt och analys görs med renat protein. Prov renhets kommer have att beaktas. - Upprepa detta steg utan MS / MS och med lutning som kommer att användas för den verkliga HX experimentet. För Hsp90 och Sti1 använda en 10 min gradient från 90% lösningsmedel A/10% lösningsmedel B till 45% lösningsmedel A/55% lösningsmedel B.
OBS: Lutningar är normalt mellan 5-15 min och mycket beror på prov komplexitet och HX systemspecifikationer. - Fastställ retentionstiderna för peptiska peptider som identifierats i 6.4 i lutning som används i 6.5 och skapa en lista som består av 1.) Peptidsekvens 2.) Peptidladdningstillstånd och 3.) Retentionstid. Detta kommer att användas för att identifiera varje peptid efter HX experiment.
OBS: Tänk på att peptider med små m / z skillnader, samma laddningstillstånd och samma uppehållstid kan vara en källa till tvetydighet.
7. Identifiering av protein-proteininteraktion Gränssnitt
- Sätt upp gradienten och masspektrometri metod i kontroll software. Använd en 10 min linjär gradient från 90% lösningsmedel A/10% lösningsmedel B till 45% lösningsmedel A/55% lösningsmedel B. Ladda en masspektrometri-metod som är optimerad för detektering av massorna mellan 300-1,500 m / z, även om de flesta av peptiderna kommer att vara lägre än 1000 m / z. Ställ injektionsventilen i LOAD position, 6-vägsventil i LOADING / avsaltning position. Ställ in flödet av laddningspumpen till 0,4 ml / min.
OBS: Längd och typ av lutning är provberoende och kan behöva optimeras. Längre gradienter förbättra upplösningen av kromatografi men minskar införlivandet av deuteroner till proteiner på grund av rygg-utbyte. De valda metoderna måste vara samma för alla experiment som ska jämföras. - För unexchanged referens förbereda 20-100 pmol av Hsp90 i 100 ^ il H2O buffert. Tillsätt 100 l iskall släcka buffert, pipett upp och ner två gånger och injicera provet i insprutningsventil av HPLC. Omedelbart starta kromatografi programmet och swklia insprutningsventilen in INJECT position. Efter två minuter växlar 6-vägsventil från AVSALTA / LADDAR för eluering läge. Gör detta för Hsp90 och Sti1 individuellt och för blandningen av proteiner.
- Förbered 20-100 pmol av Hsp90 i en volym av 1-5 | il. Lägg temperatur justerad D 2 O buffert för att få provvolym upp till 100 l och inkubera exakt för en viss tid (t.ex. 30 sek; för konformationsdynamik se not). Tillsätt 100 | il iskall quench buffert pipetteras upp och ner två gånger och snabbt injicera 200 pl in i insprutningsventilen enligt HPLC. Omedelbart starta kromatografi programmet och byta insprutningsventilen i INJECT läge. Efter två minuter växlar 6-vägsventil från AVSALTA / LADDAR för eluering läge. Gör detta för varje protein för sig, för att bestämma deuteronen införlivande i varje peptid i frånvaro av interagerande protein.
Obs: När du studerar dynamiken i överensstämmational ändringar, upprepa experimentet med olika inkubationstider av Hsp90 i D 2 O buffert. Försök att täcka ett brett tidsskala genom att välja inkuberingstider logaritmiskt (t.ex. 10 sek, 30 sek, 100 sek, 300 sek, 1,000 sek, etc.). D2O buffert och provbuffert måste vara exakt identiska med undantag för väte isotop. - Bered en lika stor mängd kontrollprov 100% (20 till 100 pmol) och tillsätt D 2 O buffert för att bringa provvolym upp till 100 | il. Tillsätt 100 | il iskall quench buffert pipetteras upp och ner två gånger och snabbt injicera 200 pl in i insprutningsventilen enligt HPLC. Omedelbart starta kromatografi programmet och byta insprutningsventilen i INJECT läge. Efter två minuter växlar 6-vägsventil från AVSALTA / LADDAR för eluering läge.
- För att bestämma interaktionen yta blanda Hsp90 med en åtminstone 2-faldigt överskott av Sti1 att förskjuta jämvikten till den bundna tillstånd (se anmärkning) och inkuberavid den önskade temperaturen till dess att komplexbildningen är vid jämvikt. Lägg temperatur justerad D 2 O buffert för att få provvolym upp till 100 l och inkubera exakt för en viss tid (t.ex. 30 sek). Tillsätt 100 | il iskall quench buffert pipetteras upp och ner två gånger och snabbt injicera in i insprutningsventilen enligt HPLC. Efter två minuter växlar 6-vägsventil från AVSALTA / LADDAR för eluering läge. Upprepa detta experiment med 20-100 pmol Sti1 och överskott av Hsp90.
Anmärkning: De absoluta koncentrationerna bero på dissociation jämviktskonstant av interaktionen. Helst efter utspädning i D2O koncentrationen av proteinet tillsätts i överskott bör vara minst 10 gånger K D (motsvarar> 85% av den nedre koncentrerade proteinbundet). - Analysera de förvärvade data med lämplig programvara och använda retentionstiderna bestäms i steg 6,5 för att hitta varje peptid i analysen. Calculate centroid isotopfördelningen för unexchanged proteinet (steg 7,2) och för HX experiment (steg 7,3).
Notera: Även om isotopmönster utbytta peptider ser annorlunda från deras unexchanged motsvarigheter, både kunskapen om laddningstillstånd av peptiden och högmässa noggrannhet masspektrometern möjliggör enkel bestämning av masscentra. - Jämför inkorporering av deuteroner av målprotein ensam och med överskott av bindningspartner. Detta kan göras automatiskt med kommersiell programvara eller manuellt med ett kalkylprogram. De sampelvärden 100% kontroll beteckna den maximala utbytet för varje peptid och kan användas för att bestämma mängden av D2O etiketten förlorad under försöket på grund av att baksidan utbyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hsp90 är en molekylär förkläde i jäst och medlem av Hsp90 chaperonen familjen. Genom att gå igenom en komplicerad ATPas cykel det hjälper sent fällbara stegen i många protein klienter. Effektiv vikning kräver överföring av kunder från Hsp70 och interaktion av co-förkläde Sti1/Hop. Sti1 direkt binder till Hsp90 och underlättar klient bindande genom hämning av Hsp90 ATPas-aktivitet. Interaktion av Hsp90 med Sti1 nyligen studeras med hjälp av HX-MS 23. Här presenterar vi representativa resultat från de underliggande experiment efter ovanstående protokoll.
Den direkt interaktion protein-protein testades genom märkning av proteinkomplex i jämvikt med D2O och jämföra Sti1 peptid spektra i frånvaro och närvaro av Hsp90.The resulterande skillnaden tomt kan ses i Figur 5A (data från 23). Peptiderna är orienterade från topp till botten med början vid N-terminalen. Mestadels peptider iTPR2a och TPR2b visar ett starkt skydd i närvaro av Hsp90 (negativa värden för D + Hsp90 - D-Hsp90), vilket indikerar att dessa regioner interagerar med Hsp90. Skyddet i TPR2a lätt kan rationaliseras från kristallstrukturen för Sti1-TPR2a-TPR2b i komplex med en peptid som representerar C-terminal MEEVD-motivet av Hsp90 (Figur 5B). En sådan tydlig skydd i protein-protein interaktioner är inte alltid iakttas. Skyddet i Hsp90 i närvaro av Sti1 är inte lika uttalad och inte såsom lokaliserad såsom i Sti1 (figurerna 5C och 5D). Alla peptider visar något ökat skydd från deuteronen inkorporering i närvaro av Sti1. Sti1 stabiliserar uppenbarligen Hsp90 globalt som ingen region av proteinet visar mer flexibilitet i närvaro av Sti1. Vi kan dock inte urskilja om det reducerade deuteronen inkorporering härstammar från direkt interaktion med Sti1 eller genom allosteriska effekter på konformaav Hsp90. Den information som erhålls minskar förmodade interaktions platsen till några peptider (t.ex. peptid 43-62 i NBF). Ytterligare experiment såsom tvärbindning används vanligtvis för att bekräfta bindningsställena efter HX-MS 23. Att notera är att sekvenstäckning av Hsp90 minskat vid mätning av Hsp90-Sti1 komplex. Eftersom Sti1 lades i 3,5-faldigt överskott den teoretiska totala mängden peptider i analysen var några fyrfaldigt högre än med Hsp90 ensam. Detta ökar risken för Sti1 peptider överskuggar eller överlappande Hsp90 peptider under analys. För att optimera för högre sekvenstäckning bättre kromatografisk separation verkar vara den mest lovande metoden.
En möjlighet för att studera dynamiken i olika proteinregioner är användningen av kontinuerlig märkning HX-MS. Det handlar om odling av till jämvikt prov protein i D 2 O för olika tidsperioder och därmed gör förutsägelser om stabilitetindividuella proteinsegment. Figur 6 illustrerar spektra för peptiden 43-62 från NBD av Hsp90 i närvaro och frånvaro av ett 3,5-faldigt överskott av Sti1. De inkubationstider valdes på en logaritmisk skala (10 sek, 100 sek, och 1000 sek) för att få god täckning över ett brett tidsfönster. Peptid spektra visar en beroende inkorporering tid deuterium i det protein som ökar längre inkubationstider. För peptid 43-62 utbyte följer EX2 mekanismen där k int << k cl. Graden av skydd förändras under inkubationstiden, visar den stora skillnaden med kortare inkubationstid och nästan samma kurs vid längst tid punkten. Detta tyder på en lägre grad stabilisering eller en region av dynamiska interaktioner med täta dissociation och återförening. Antingen det observerade skyddet beror på en totalt sett minskad växelkurs av amid protoner i peptiden eller effekten kan tilldelas en eller tvåspecifika amid protoner som utbyter långsammare i närvaro av Sti1. I detta fall är det senare är mycket mer troligt eftersom Hsp90 kristallstruktur avslöjas området ska ha en exponerad slinga i stället för en vanlig sekundär struktur som α-helixar eller β-sheets.
Det är viktigt att nämna att ryggen utbytet inte har subtraherats från de data som visas innebär att de observerade effekterna blir mer uttalad när normaliserad till kontrollen 100%.
Figur 1. HPLC-setup för HX-MS. a) Typisk konfiguration av en HX-MS inrättas. De olika färgade områden representerar sektioner som hålls vid olika temperaturer. Provet injicerades i provslingan av insprutningsventilen (i LADDA-läget, cyan) och efter omkoppling av ventilen i "injicera läge" (svart) pumpas genompepsinet kolumnen till 6-vägsventil. Pepsin kolonnen hålles på ungefär 10 ° C för att förbättra den enzymatiska aktiviteten av pepsinet. Den 6-portsventilen har två lägen, "Läser / Desalting Mode" och "Elution Mode" (se b). Efter avsaltning av provet peptiderna separeras kromatografiskt med en acetonitrilgradient på en analytisk kolonn med omvänd fas. Peptiderna sprutas därefter in i masspektrometern med en ESI-källa. B) Lägen av 6-ports ventil. Direkt efter HX den 6-ports ventil är i "Läser / Desalting position" för att fånga de peptiska peptiderna på fällan kolumnen. Detta fortsattes under upp till tre minuter för att avlägsna eventuella salter eller föreningar av de reaktionsbuffertar som kan störa masspektrometri. Efter detta ventil omkopplarna 6-port i "Elution Mode" sätta den laddade fällan kolumnen i flödesvägen mellan lutning pump och analytisk kolonn. De fångade peptiska peptider eluerar nu från fällan ColuMn och separeras i en gradient av 0,1% myrsyra acid/0.1% myrsyra i acetonitril.
Figur 2. Flödesschema av en HX experiment. 1) Mål-proteinet renas och levereras i standardbuffertar utan detergent. 2) Proteinet enzymatiskt digererades med pepsin och peptiska peptider identifieras och karakteriseras av tandem-masspektrometri (MS / MS). Först efter att ha erhållit sekvens, ladda tillstånd och retentionstiden för så många peptider som möjligt HX-MS framgångsrikt kan genomföras. 3) De experimentella förhållanden sätts upp exempel inkubation av proteinet under särskilda omständigheter (tillägg av ligand / kemisk förening eller förändring i temperatur eller pH. 4) HX utförs genom att späda provet 1:10 eller högre i D 2 O buffert . Den D2O buffert måste vara identiska med provbufferten till AVOid bufferteffekter. Sedan provet inkuberas exakt under en definierad tidsperiod. 5) Efter inkubering stoppas reaktionen och injicerades i HPLC-MS-system. Provet är enzymatiskt klyvs och de resulte peptiska peptider separeras i ett organiskt lösningsmedels-gradient och injiceras i masspektrometern. 6) Analys av den erhållna peptiden spektra. De masscentra hos peptiden spektra jämförs under olika reaktionsbetingelser. Detta kan göras manuellt med lämplig programvara eller automatiskt med en HX analysprogram.
Figur 3. Väteutbytesmekanism. Reaktionen av väteutbyte kan katalyseras av bas-eller syra och därför är pH-beroende med en minimal kursen mellan pH 2,5 och 3, beroende på sidokedjorna i resterna som flankerar amidbindning 6. During avsaltning och kromatografisk separation av peptider, som genomföres i H 2 O-innehållande lösningsmedel, är inkorporerade deuteroner utbyts tillbaka för protoner enligt samma mekanism ("back utbyte"). Därför är avgörande för att minska förlusten av inbyggda deuteroner optimering av systemet och använda lösningsmedel.
Figur 4. Principen om HX-MS. Bindning av en ligand till protein resulterar i skydd av amiden ryggrad väten vid bindningsstället från det omgivande lösningsmedlet. Detta minskar växelkurserna för drabbade protoner och minskar införlivandet av deuteroner. Eftersom viktskillnaden mellan protonen och deuteron är en Da kommer peptider härrörande från denna region av proteinet visar en lägre m / z i masspektrometri. Vid jämförelse av peptid spektra för experimenteni frånvaro och närvaro av bindningspartner kommer att avslöja en förskjutning av tyngdpunkten för det spektra till lägre m / z-värden (skydd händelse). Regioner som uppvisar framstående skydd efter tillsats av bindningspartner är potentiella bindningsställen. Beroende på sekvenstäckning och tillgängligheten av överlappande peptider bindningsställen kan inskränkas till ett fåtal aminosyror.
Figur 5. Interaktion av Hsp90 och Sti1. en, Differens plot av deuteron inkorporering i Sti1 i närvaro av bindningspartner Hsp90 minus deuteron inkorporering i Sti1 i frånvaro av Hsp90 (Data från 23). b, tecknad representation av ett fragment av Sti1 fattande TPR2a och TPR2b (PDB kod 3UQ3) i komplex med en peptid, som representerar den C-terminala MEEVD-motivet av Hsp90. Serien är färgad enlighetding till antalet amid protoner skyddade från deuteron inkorporering såsom anges. c, Differens plot av Hsp90 i närvaro av bindningspartner Sti1. Observerad deuteron inkorporering i Hsp90 efter 10 min förinkubering med 3.5x överskott Sti1 vid 30 ° C och 30 sek; HX vid samma temperatur. Experimentet utfördes i tre exemplar och standardfelet för medelvärdet visas för varje peptid. Globala negativa värden anger minskad inkorporering av deuteroner och därmed högre total stabilitet Hsp90 i närvaro av Sti1. Tillbaka utbyte inte ansågs i detta experiment. D., Cartoon representation av jäst Hsp90 (PDB kod 2CG9) färgade beroende på antalet amid protoner skyddas från deuteronen införlivande som anges i b.. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 7. Exempel på peptid-spektra med bimodal utdelningsjon. en, deuteron inkorporering in i E. coli Hsp90 i frånvaro och närvaro av ATP (uppgifter från 22 suppl. Figur 3). Spektra av peptidresterna 192-206 är visade före inkubation i D2O (0% D), efter 30 sek, 5 min, 10 min och 30 min inkubation i D2O, och kontrollen 100% (100% D) . I frånvaro av ATP (-ATP) en typisk EX2 utbyte beteende observeras. I närvaro av ATP (+ ATP) ett starkt skydd observeras vid 30 sek och vid 5 min och 10 min bimodala fördelningar av isotoptoppar, vilket visar två populationer av proteiner, en befolkning som liknar den ATP-bundna tillstånd och ett andra liknande nukleotid fritt tillstånd. Vid 30 min ingen skillnad mellan frånvaro och närvaro av ATP har observerats. Den bimodal fördelning är mest sannolikt orsakas av ATP hydrolys och övergång genom nukleotid fritt tillstånd med ökad flexibilitet i detta protein segment. Dessa spektra liknar en klassisk EX1 utbytes regimig. b, Bimodalteknik distribution av isotop toppar i puls-märkning HX experiment. E. coli-Hsp90 inkuberades i frånvaro av ATP eller i närvaro av ATP under 10 till 300 sekunder och därefter pulsmärktes under 10 sek i D2O som indikeras (data som tas från 22 Figur 4A). De bimodala fördelningar visar återigen två samexisterande populationer av molekyler, ett utbyte snabbare amid protoner för deuteroner än den andra. ATP inducerar en långsam övergång från det snabbare att byta in den långsammare utbyte konformation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bindning av en interaktionspartner till ett protein som oundvikligen orsakar förändringar i lösningsmedelstillgänglighet på bindningsstället. Dessutom har många proteiner genomgår dynamiska konformationsförändringar vid bindning, som påverkar andra regioner än den faktiska fäst gränssnittet. HX-MS är en robust metod för att övervaka dessa förändringar och är till och med kan avslöja konformationsförändringar i proteiner på tidsskalor som andra metoder inte kan täcka.
För att framgångsrikt utföra HX-MS tre punkter är kritiska: 1) en optimal systeminstallation, 2) exakt utförande av provbearbetning och 3) noggrann analys av data när du tilldelar peptid spektra och tolka resultat.
Systeminställnings
Eftersom masspektrometri används för detektion av deuteronen införlivande i peptiderna, samma försiktighetsåtgärder vad gäller provberedning ansöka om HX-MS. Rengöringsmedel, salter och andra föreningar som interfererar med masspektrometri should undvikas eller tas bort före analys. Medan HX-MS tillåter analys av stora proteinkomplex, desto högre komplexitet kräver ökad kvalitet på peptidseparation och masspektrometri. Optimering av kromatografiska förhållanden är nyckeln till att få fram uppgifter av god kvalitet. Detta involverar val av de högkvalitativa organiska lösningsmedel, omvänd fas-material såväl som optimering av gradienter och lösningsmedel. Tvättning av kolonnerna med organiska lösningsmedel kan ske mellan experiment och över natten för att minska bakgrundssignalen. Masspektrometri metoder bör optimeras för detektion av peptiska peptider (mellan 300-1,200 m / z). Högupplösta masspektrometrar hög grad underlätta dataanalys eftersom delvis överlappande isotoptoppkluster som kommer från olika peptider kan urskiljas.
Bearbetningen av prover är avgörande för HX-MS. Vanligtvis våra buffertar och prover centrifugeras ned i 10 min vid 13.000 rpm (mikrofug) för att avlägsna aggregat och partilarna. Dessutom kan flera inlinefilter installeras i HPLC-systemet för att förhindra igensättning av kolonner. Mindre avvikelser i D 2 O inkubationstider kan få stora effekter. För mycket flexibla proteinregioner en skillnad på bara några sekunder kan göra skillnaden mellan ingen deuteronen inkorporering alls och full deuteration. Eftersom proteindynamik samt den inneboende växelkursen är en funktion av temperaturen, inkubation av prov och buffertar är tätt temperaturstyrd. Det är fördelaktigt att alltid upprepa den exakta sekvensen av steg för varje experiment. Om förs korrekt felet mellan två experiment kommer att vara relativt liten. Idag automatik för HX-MS är kommersiellt tillgängliga och minska de utmaningar som provbearbetning.
Analys av data
Det mest kritiska steget i HX-MS är analys av data, särskilt tilldelningen av peptid spektra och bestämning av deuterering nivåer. The utgången på HX-MS är en elueringsprofil av det kromatografiska gradient innehållande ett stort antal peptid spektra. De operatörer uppgift är att tilldela dessa spektra med de peptider som identifierats av MS / MS i steg 6) i protokollet. Det kan vara lite svårt eftersom spektra kan avsevärt skifta mot högre m / z efter HX. Också den partiella överlappningen av spektra kan komplicera uppgiften av peptider. I detta fall att använda högupplösta masspektrometrar med högmässa noggrannhet lönar sig därför att de ofta kan lösa överlappande peptider. Skillnader i deuteronen inkorporering är beräknade utifrån de centroids av peptid spektra. De centroider kan bestämmas: 1) manuellt genom att markera varje isotoptopp av en peptidspektrum och överföra sina värderingar för intensitet och m / z i ett kalkylprogram (t.ex. Excel, Microsoft) och beräkna tyngd eller 2) med programvara som utformats för att tilldela isotop toppar tillhör en identifierad peptid och för att beräknacentroider automatiskt (t.ex. HDExaminer, Sierra Analytics eller Hexicon 24,25).
Optimering av HX-MS
Om antalet utvärderbara peptider är för låg, det finns flera andra möjligheter att optimera experimentet: 1) Optimering av kromatografi (lösningsmedel, längd / form-gradient, för användning av olika omvänd fas-material) eller 2) förändring av enzymatisk klyvning av proteinet (alternativt proteas, längre / kortare inkubationstid med pepsin, tillsats av denatureringsmedel till härdningsbuffert). Båda parametrarna ändrar elueringsbeteende av peptider, eftersom de antingen förändrar peptidpool självt eller HPLC-separation. Båda optimerings metoder kommer till priset av att behöva recharacterize peptider. Andra proteaser kommer att producera olika peptider som måste identifieras med MS / MS och karakteriserades såsom beskrivs i steg 6.6). Ändra kromatografiska förhållanden kommer inte att ändra peptid poolen men behålla times hos de individuella peptider. Retentionstiderna måste sedan bestäms igen såsom i steg 6,5). Det bör nämnas att högre retentionstider alltid kommer att minska mängden av detekterbar markör som back utbytesökningar vid längre retentionstider. Normalisering av data till kontroll 100% är det bästa sättet att ta itu med baksidan utbyte. Hög rygg utbyte leder till en förlust av inkorporerade deuteroner och därför signalen. Det rekommenderas starkt för att minska mängden ryggen utbyte till ett minimum. Det bör noteras att olika HX-MS uppställningar kommer att ha skiljaktiga hastigheter av tillbaka utbyte, beroende på maskinvara, sammansättningen av använda buffertar och lösningsmedel och den typ av gradienter som används 26.
Tolkning av data
Vid analys av data, måste intensiteten fördelningen av de isotoptoppar utvärderas noggrant eftersom den kan ge indikationer till växeln mekanismen. För peptider med en massa mindreän 2000 Da intensiteterna hos de isotopiska topparna av unexchanged provet är generellt asymmetrisk med högre intensiteter för den monoisotope eller den första högre isotop topp. För EX2 utbyte regim denna asymmetriska intensitetsfördelning blir Gaussisk-liknande med ökande tid i D2O och ökande övergång till högre m / z och bredden hos den isotopiska klustret ökar med ca 50% (figur 7). Som nämndes i inledningen EX2 är oftast observeras i HX-MS under nativa förhållanden och den observerade kurs är proportionell mot jämvikts utspelas konstanten K u och därmed till den termodynamiska stabiliteten hos proteinet. Däremot för EX1 utbytessystemet bredden fördelningen av isotopkluster betydligt ökar och bimodala eller multimodala intensitetsfördel observeras (se Figur 7) 25,27. Bimodala isotopfördelningar visar alltid två eller flera olika molekylarteri analysen, som är potentiellt intressant. Det finns dock två typer av fallgropar. För det första kan isotopen kluster vara sammansatt av toppar som härrör från två olika peptider. Därför är det obligatoriskt att kontrollera spektret för unexchanged provet för peptider med samma m / z och identisk laddning. Sådana peptider skiljer sig vanligen något i retentionstid och intensitetsfördelningen av de isotoptopparna varierar med elueringstid. I högupplösta masspektrometrar kan isotoptoppar som inte tillhör samma peptid också särskiljas genom decimaler för m / z-värden. För det andra är överföring från en tidigare HPLC-MS run observer 28. Sådana överföringar visas som nonexchanged arter och kan elimineras genom tomma HPLC-gradient körs mellan analyskörningar. Det finns många orsaker till uppenbar EX1 växelkurssystem. 1) I HX experiment i närvaro av denatureringsmedel EX1 observeras ofta 29. 2) Spontan eller inducerad, reversibel eller irreversibel local eller global utbredning av proteiner orsakar EX1 beteende 7,30,31. 3) Conformational övergångar som är långsamma jämfört med HX orsakade av t.ex. substrat omsättning, ATP hydrolys orsaka bimodala isotopfördel liknar EX1 utbytessystemet (figur 7a) 22. 4) ligandinducerad långsam konforma övergångar i puls-märkningsförsök uppvisar också en EX1 liknande signatur (Figur 7b) 22.
Tolkningen av erhållna uppgifter är slutligen det som gör HX-MS sådan utmanande men också kraftfull teknik. En bred kunskap om proteindynamik krävs för att komma hela vägen från de observerade skydd / avlägsnande mönster till en mekanistisk modell av proteindynamik. Icke desto mindre kan som producerar högkvalitativa HX-MS-data göras inom relativt kort tid och är mycket reproducerbar. Tolkningen av data gynnar klart från någon ytterligare information om strukturen av proteinet investeraigated. Å andra sidan, kan HX-MS indikerar vilka delar av ett protein som är flexibla, som kan behöva tas bort för att underlätta kristallisation för strukturbestämning.
HX-MS är en metod som kraftigt vinster av innovationer inom masspektrometri och kromatografi. Ett nytt framsteg inom HX-MS är användningen av lipid nanodiscs för analys av membranproteiner som ytterligare breddar användningen av denna teknik 32. Även användningen av elektronöverförings dissociation (ETD) och elektroninfångnings dissociation (ECD) visar en stark potential för HX-MS, eftersom det ökar upplösningen av inkorporerat deuteron till nivån för enskilda aminosyror 11,12 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar M. Boysen för kommentarer på manuskriptet. Projektet har finansierats av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 och MA 1278/4-1 till MPM, och Cluster of Excellence: CellNetworks EXC 81/1). MPM är utredaren av Cluster of Excellence: CellNetworks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| maXis QTOF | Bruker | ||
| nanoAcquity UPLC | Waters Corp. | ||
| Shimadzu 10AD-VP | Shimadzu | ||
| 6-port Valve EPC6W with microelectric actuator | Valco | #EPC6W | |
| Injection valve (manual) | Rheodyne | #7725 | |
| Poros AL20 media | Applied Biosystems | #1-6029-06 | |
| Poros R2 | Applied Biosystems | #1-1118-02 | |
| Pepsin | Sigma | #P6887 | use fresh pepsin |
| Microbore (1 mm) | IDEX | #C-128 | |
| Microbore (2 mm) | IDEX | #C-130B | |
| Acquity UPLC BEH C8 Column | Waters Corp. | #186002876 | |
| Thermomixer | Eppendorf | #5355000.011 | |
| Tubing (various diameters) | IDEX | ||
| Fittings | IDEX | #PK-110 with PK-100 |
References
- Saibil, H. R. Conformational changes studied by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
- Rist, W., Jørgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange. The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).
- Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).
- Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
- Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins. Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).
- Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., Jørgensen, T. J. D. Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements. J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).
- Yamada, N., Suzuki, E. -I., Hirayama, K. Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).
- Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry. Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).
- Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange. Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).
- Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).
- Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry. Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).
- Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry. J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).
- Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry. Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).
- Lanman, J., Lam, T. T., et al. Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry. J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).
- Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).
- Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine. EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).
- Lee, C. -T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1. EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).
- Lou, X., Kirchner, M., et al. Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments. Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).
- Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon. Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).
- Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).
- Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).
- Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses. Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).
- Deng, Y., Smith, D. L. Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates. Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale. J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).
- Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator. J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).
- Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).
- Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).
