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Chemistry

हाइड्रोजन विनिमय मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग प्रोटीन गतिशीलता का विश्लेषण करना

Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50839
Automatic Translation
1, 1
1Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg (ZMBH), University of Heidelberg

Summary

प्रोटीन रचना और गतिशीलता प्रोटीन संरचना और समारोह के बीच संबंधों को समझने की कुंजी हैं. उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर हाइड्रोजन विनिमय प्रोटीन के गठनात्मक गतिशीलता का अध्ययन करने के साथ ही संपर्क इंटरफेस और allosteric प्रभाव सहित प्रोटीन ligand और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, निस्र्पक के लिए एक बहुमुखी विधि है.

Abstract

सभी सेलुलर प्रक्रियाओं प्रोटीन की कार्यक्षमता पर निर्भर करती है. किसी दिए गए प्रोटीन की कार्यक्षमता अपनी अनूठी अमीनो एसिड अनुक्रम का सीधा परिणाम है, यह केवल एक ही परिभाषित तीन आयामी व्यवस्था या अधिक सामान्यतः interconverting रचना की टुकड़ी में में पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला की तह ने महसूस किया है. प्रोटीन रचना और अपने कार्य के बीच संबंध की जांच कर प्रोटीन कार्यों के अपने महान विविधता को पूरा करने में सक्षम रहे हैं की एक पूरी समझ के लिए इसलिए जरूरी है. अपने कार्य चक्र के माध्यम से प्रगति करते हुए एक प्रोटीन से होकर गुजरती गठनात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक संभावना यह हाइड्रोजन -1 उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सेमी एमएस) के साथ संयोजन में एच / 2 एच विनिमय है. सेमी एमएस जैसे क्रि द्वारा प्राप्त संरचनात्मक जानकारी के लिए एक नया आयाम कहते हैं कि एक बहुमुखी और मजबूत विधि है. यह छोटे मोल के बंधन, तह और खुलासा प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता हैecule ligands, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, कटैलिसीस एंजाइम से जुड़ा हुआ गठनात्मक परिवर्तन, और allostery. प्रोटीन की मात्रा बहुत ही सीमित है या प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण संभव नहीं है, जब इसके अलावा, सेमी एमएस अक्सर प्रयोग किया जाता है. यहाँ हम सेमी एमएस के साथ प्रोटीन की गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और कैसे एक परिसर में दो प्रोटीन की बातचीत इंटरफ़ेस प्रकट करने के लिए एक उदाहरण के रूप में वर्णन.

Introduction

प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों की क्रिस्टल संरचनाओं की संख्या में हाल के वर्षों में तेजी से वृद्धि हुई है. वे इन प्रोटीनों की संरचनात्मक संगठन की अमूल्य फोटो मौजूद है और संरचना समारोह विश्लेषण के लिए एक आधार प्रदान करते हैं. हालांकि, प्रोटीन और उनके कार्यों के लिए आवश्यक हैं जो गठनात्मक परिवर्तन की गतिशीलता, शायद ही कभी एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा पता चला रहे हैं. क्रायो electronmicroscopy, दूसरी ओर, विभिन्न रचना में प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों पर कब्जा करने में सक्षम है, लेकिन आम तौर पर माध्यमिक संरचना स्तर 1 के लिए गठनात्मक परिवर्तन नीचे हल नहीं कर सकता. परमाणु विवरण को समाधान में प्रोटीन के गठनात्मक गतिशीलता केवल एनएमआर द्वारा हल किया जा सकता है, लेकिन इस पद्धति अभी भी अपेक्षाकृत छोटे आकार (आम तौर पर ≤ 30 केडीए) के प्रोटीन के लिए प्रतिबंधित है और साथ प्रयोगों बाधित जो प्रोटीन की उच्च सांद्रता (≥ 100 माइक्रोन), की जरूरत है oligomerization या एकत्रीकरण का खतरा प्रोटीन 2. एक विधि है किउच्च संकल्प एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी और क्रायो electronmicroscopy और जो बीच पुल करने के लिए सक्षम है प्रोटीन आकार या एकाग्रता द्वारा ही सीमित नहीं है एमाइड हाइड्रोजन -1 मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ संयोजन में एच / 2 एच एक्सचेंज (सेमी) है. हाल के वर्षों में इस विधि प्रोटीन गतिशीलता, प्रोटीन तह, प्रोटीन स्थिरता और गठनात्मक परिवर्तन 3-5 के विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान विश्लेषणात्मक उपकरण को विकसित किया है. इस विधि के आणविक आधार प्रोटीन एक डी 2 हे समाधान में रखा जाता है जब ड्यूटेरियम परमाणुओं के साथ आदान प्रदान करेंगे जो प्रोटीन में रीढ़ एमाइड hydrogens, का अस्थायी प्रकृति है. समय के साथ प्रोटीन जन में बाद में वृद्धि उच्च संकल्प एमएस के साथ मापा जाता है.

कम असंरचित पेप्टाइड्स में ही तापमान, उत्प्रेरक एकाग्रता पर निर्भर करता सेमी (ओह - चित्रा 3 देखें, एच 3 O + यानी पीएच,) और प्रेरक, बिल्ली के कारण आसन्न अवशेषों के अमीनो एसिड पक्ष श्रृंखलाalytic और steric प्रभाव. आंतरिक रासायनिक विनिमय दर कश्मीर चर्चा पर इन प्रभावों को सुंदर ढंग से बाई एट अल. 6 द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया है और एक कार्यक्रम पीएच और तापमान पर निर्भर एक पॉलीपेप्टाइड के भीतर प्रत्येक अमीनो एसिड के लिए कश्मीर चर्चा की गणना करता है जो (सौजन्य से जेड जांग), उपलब्ध है. तटस्थ पीएच और परिवेश तापमान पर कश्मीर सीएच 10 1 -10 3 सेकंड -1 के क्रम में है. एक कसकर तह प्रोटीन के इंटीरियर के लिए आयनों - मुड़ा प्रोटीन में सेमी मुख्य कारण माध्यमिक संरचना में हाइड्रोजन संबंधों को और ओह हाइड्रेटेड की प्रतिबंधित पहुंच की वजह से एक मामूली डिग्री करने के लिए धीमी परिमाण के 2-9 आदेश हो सकता है. देशी प्रोटीन में सेमी इसलिए आंशिक या वैश्विक खुलासा, रासायनिक विनिमय और समीकरण के अनुसार देशी राज्य के लिए refolding implicates (1) और कश्मीर OBS उद्घाटन दर कश्मीर सेशन, समापन दर कश्मीर सीएल और आंतरिक रासायनिक विनिमय पर निर्भर मनाया एक्सचेंज आरएते कश्मीर CH समीकरण के अनुसार (2).

समीकरण 1-2
देशी राज्य शर्तों के तहत कश्मीर सेशन कश्मीर CH तुलना में काफी छोटा है और हर में उपेक्षित किया जा सकता है. EX1 और EX2 ​​नामक दो चरम विनिमय शासनों कर रहे हैं. कश्मीर सीएल कश्मीर CH (EX1) की तुलना में काफी छोटा होता है तो मनाया दर खोलने की दर को व्यावहारिक रूप से बराबर है और सेमी एक संरचनात्मक तत्व का खुलासा का तत्काल अवलोकन की अनुमति देता है. संरचनात्मक तत्व के उद्घाटन पर एक ही बार में सभी एमाइड प्रोटॉन विनिमय, आइसोटोप चोटियों 7 की एक bimodal वितरण से एमएस में आसानी से मानने योग्य है, जहां इस तरह के एक एक्सचेंज शासन,. कश्मीर सीएल कश्मीर CH तुलना में बहुत अधिक है, तो समानता निरंतर तह खुलासा equilibriums के बराबर है जिससे (EX2) मनाया दर कश्मीर चर्चा करने के लिए आनुपातिक है लगातार कश्मीर यू = कश्मीर सेशन सीएल. समस्थानिक वितरण मोटे तौर पर एक ही रहता है, जबकि इन शर्तों के तहत, कई उद्घाटन और समापन घटनाओं औसत मास में एक क्रमिक वृद्धि के लिए अग्रणी deuterons के लिए सभी एमाइड प्रोटॉन विनिमय से पहले आवश्यक हैं. EX2 शासन ΔG यू खुलासा से मुक्त ऊर्जा का दृढ़ संकल्प और एक संरचनात्मक तत्व की इसलिए स्थिरता की अनुमति देता है. देशी राज्य की स्थिति के अंतर्गत EX2 शासन सबसे आम है. पीएच और chaotropic एजेंटों के अलावा की वृद्धि EX1 करने के लिए विनिमय तंत्र बदलाव कर सकते हैं. इसलिए, सेमी एमएस thermodynamic का पता लगाने के साथ ही प्रोटीन तह और गठनात्मक परिवर्तन की गतिज मापदंडों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

सेमी ऊपर उल्लेख किया है आंतरिक रूप से पीएच और तापमान पर निर्भर है और रीढ़ की हड्डी एमाइड समूह की एक पूरी तरह से विलायक उजागर प्रोटॉन की विनिमय आधा जीवन> को शारीरिक पीएच पर 5-400 मिसे (पीएच 7.6) और 30 डिग्री सेल्सियस, लेकिन 10 मिनट के बीच है एक पीएच 2.9 पर> 2 घंटा की औसत और 0 डिग्री के साथ 15 घंटे(सीए की एक आधा जीवन. 1-2 मिनट के साथ आदान प्रदान जो एक पॉलीपेप्टाइड, के पहले रीढ़ एमाइड बांड की प्रोटॉन के लिए छोड़कर) सी. जैसे धीमी गति से आदान प्रदान शर्तों के तहत इसे बाहर शामिल deuterons में निहित सभी जानकारी को खोने के साथ, इन परिस्थितियों में सक्रिय हैं कि proteases (जैसे पेप्सिन) का उपयोग नमूना पचाने के लिए संभव है. धीमी गति से आदान प्रदान परिस्थितियों में पेप्टिक पाचन की शुरूआत के बाद से, पूर्ण लंबाई प्रोटीन के समग्र सेमी कैनेटीक्स न केवल विश्लेषण किया जा सकता है लेकिन सेमी विशिष्ट क्षेत्रों 8,9 के लिए स्थानीयकृत किया जा सकता है. स्थानिक संकल्प वर्तमान में 10-30 अवशेषों के बीच सामान्य रूप में है, जो उत्पन्न पेप्टिक टुकड़े, के आकार तक सीमित है. हालांकि, पेप्सिन द्वारा की वजह से दरार की अविशिष्ट प्रकृति के लिए बनाई गई अतिव्यापी टुकड़े स्थानिक संकल्प में वृद्धि करने के लिए ले जा सकता है. इसके अलावा, कई अन्य proteases, बुझाना परिस्थितियों में हालांकि, बहुत कम कुशल 10 पेप्सिन से सक्रिय होना पाया गया है. इसके अलावा increaस्थानिक संकल्प के एसई जैसे इलेक्ट्रॉन कब्जा हदबंदी (ईसीडी), इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण हदबंदी (ETD) और अवरक्त multiphoton हदबंदी (IRMPD) 11-13 रूप deuteration पैटर्न संरक्षित कि तरीकों से गैस चरण में पेप्टाइड्स के विखंडन से पहुंचा जा सकता है. इन तकनीकों के कारण टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) द्वारा मनाया जाता है जो intramolecular प्रोटॉन माइग्रेशन ("पांव मार"), सबसे अधिक इस्तेमाल किया विखंडन तकनीक को स्थानिक संकल्प के नुकसान को रोकने. हालांकि, इन तरीकों हर व्यक्ति पेप्टाइड के लिए अनुकूलन की आवश्यकता है और अभी भी इस प्रकार काफी चुनौतीपूर्ण है.

सेमी एमएस वायरल capsid विधानसभा 14-17 सहित प्रोटीन ligand और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. प्रोटीन खुलासा और तापमान प्रेरित गठनात्मक परिवर्तन 7,18,19 की जांच की गई और साथ ही refolding. Phosphorylation और एकल एमिनो एसिड उत्परिवर्तन से संबंधित गठनात्मक 16,20 और nucleot परिवर्तनआईडीई प्रेरित परिवर्तन 21,22 विश्लेषण किया गया. इसलिए, इस विधि विधानसभा और आणविक मशीनों की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए आदर्श रूप से उपयुक्त लगता है. जिसका तंत्र महान सामान्य ब्याज की है एक आकर्षक उम्मीदवार, Hsp90 निगरानी जटिल है.

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Protocol

1. बफ़र की तैयारी और प्रोटीन के नमूने

  1. एच 2 ओ बफर तैयार करें. इस्तेमाल की Hsp90 मानक बफर (40 मिमी HEPES / KOH, 7.5 पीएच, 50 मिमी KCl, 5 मिमी 2 MgCl, 10% ग्लिसरॉल) एच 2 हे बफर.
    नोट: नमूना विश्लेषण से पहले dialyzed गया था, तो एच 2 ओ बफर के रूप में डायलिसिस बफर का उपयोग करें. यह डी 2 हे बफर केवल हाइड्रोजन आइसोटोप में एच 2 ओ बफर से अलग है कि आवश्यक है. एनएच 4 की तरह अस्थिर बफ़र्स सीओ 3 या राष्ट्रीय राजमार्ग 4-एसीटेट या बफर घटकों उपयुक्त नहीं हैं!
  2. एक वैक्यूम concentrator का उपयोग Hsp90 मानक बफर के lyophilization द्वारा डी 2 हे बफर तैयार करें. एच 2 ओ का पूरा वाष्पीकरण के बाद प्रारंभिक कुल मात्रा (जैसे 1 850 μl डी ओ 2 के अलावा आवश्यकता 15% ग्लिसरॉल के साथ बफर एमएल) तक पहुँचने के लिए ट्यूब को शुद्ध डी 2 हे जोड़ें. बफर का पूरा वाष्पीकरण दोहराएँ और बफर / नमक कॉम redissolveडी 2 हे 2x में ponents.
  3. (0.4 एम के.एच. 2 पीओ 4 / एच 3 4 पीओ पीएच 2.2) बुझाना बफर तैयार करें.
    नोट: 4 एम guanidine हाइड्रोक्लोराइड और 0.5 एम Tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP-एचसीएल) के साथ जोड़ा जा सकता है बहुत स्थिर प्रोटीन की पेप्टिक डाइजेस्ट की दक्षता में सुधार.
  4. 100% नियंत्रण नमूना (6 एम guanidine हाइड्रोक्लोराइड, डी 2 हे) तैयार करें. पूरी तरह से नमूना से एच 2 ओ लुप्त हो और 10% ग्लिसरॉल के साथ प्रारंभिक कुल मात्रा (जैसे 100 μl नमूना तक पहुँचने के लिए ट्यूब के लिए डी 2 हे अलावा आवश्यकता जोड़ने 6 एम. के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए एक Hsp90 विभाज्य guanidine हाइड्रोक्लोराइड जोड़ें 90 μl डी 2 हे). बफर का पूरा वाष्पीकरण दोहराएँ और डी 2 ओ में बफर / नमक घटकों redissolve
    नोट: नमूना के 20-100 pmol प्रत्येक इंजेक्शन के लिए आवश्यक हैं. सेमी एमएस प्रयोगों के हर दिन के लिए एक 100% नियंत्रण करने के लिए पर्याप्त नमूना तैयार करें.
  5. 5 μl Hsp90 मानक बफर में 50 pmol Hsp90 तैयार करें.
    नोट: नमूना के 20-100 pmol की राशि कच्चे डेटा के प्रत्येक बिंदु के लिए आवश्यक है. प्रतिक्रिया में नमूने की मात्रा आदर्श 1-5 μl है. इन आवश्यकताओं को फिट करने के लिए एकाग्रता समायोजित करें. कोई बफर जब तक यह डिटर्जेंट या अस्थिर घटकों को शामिल नहीं करता है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

2. एल्डिहाइड पर स्थिर पेप्सिन की तैयारी मोती सक्रिय

  1. 2 मिलीलीटर 50 मिमी सोडियम साइट्रेट (पीएच 5) में 80 मिलीग्राम ताजा पेप्सिन भंग.
  2. , सोडियम cyanoborohydride के 20 मिलीग्राम भंग 1 मिलीलीटर 2 एम ना 2 अतः 4 में जॉब (बहुत विषाक्त!) के साथ संभाल और पेप्सिन समाधान करने के लिए जोड़ें.
  3. धीरे (जैसे ओवरहेड हिलनेवाला) आंदोलनकारी जबकि कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं.
  4. मिश्रण को immobilized एल्डिहाइड समूहों के साथ 600 मिलीग्राम मोती जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. 2 एम ना 2 की 2.2 मिलीलीटर जोड़ें एसओ100 μl aliquots में 4 (पीएच 5) एक घंटे से अधिक समय हर 3 मिनट में धीरे धीरे पेप्सिन बाहर नमक के लिए. धीरे कमरे के तापमान पर एक ओवरहेड प्रकार के बरतन में परिवर्धन के बीच नमूना मिश्रण.
  6. एक ओवरहेड प्रकार के बरतन में 14-16 घंटा / रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पेप्सिन मोती सेते हैं.
  7. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 1 एमएल 1 एम ethanolamine और ऊष्मायन के जोड़कर प्रतिक्रिया बुझाने.
  8. , 500 rpm पर एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूब में मोती स्पिन सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 0.1% चींटी एसिड में मोती resuspend. इस कदम 2x दोहराएँ. पिछले centrifugation कदम के बाद, सतह पर तैरनेवाला और मोती का अनुमान मात्रा त्यागें. 0.1% चींटी एसिड के एक बराबर मात्रा में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

3. Amide हाइड्रोजन विनिमय के लिए कॉलम की तैयारी

  1. कॉलम को फँसाने के लिए 1 मिमी की एक आंतरिक व्यास के साथ और पेप्सिन स्तंभों के लिए 2 मिमी के साथ गार्ड स्तंभों का प्रयोग करें.
  2. गार्ड स्तंभ के एक तरफ खोल देना और फिल्टर हटा दें. कसकर Funn पैकिंग पेंचस्तंभ के खुले अंत पर एल. स्तंभ के नीचे दुकान के लिए एक खाली सिरिंज (5 एमएल) संलग्न करने के लिए एक 1/16 इंच अनुकूलक और ट्यूबिंग का प्रयोग करें. गार्ड स्तंभ को गैस तंग इसे ठीक करने के लिए सुनिश्चित करें.
  3. कीप के शीर्ष पर घोल मनका सामग्री की कुछ बूँदें लागू करें. गार्ड स्तंभ में कीप के माध्यम से घोल चूसना सिरिंज के सवार खींचो. कीप पर अधिक घोल मनका सामग्री लागू करें और गार्ड स्तंभ पूरी तरह से मनका सामग्री से भर जाता है जब तक प्रक्रिया जारी है. कीप निकालें और खुले अंत पर फिल्टर और फिल्टर अंगूठी जगह है. कसकर गार्ड स्तंभ पर स्तंभ कैप भाड़ और दूसरी तरफ से सिरिंज हटा दें. स्तंभ सामग्री के बाहर सुखाने से बचने के लिए प्लग के साथ गार्ड स्तंभों के दोनों सिरों को बंद करें.

4. हाइड्रोजन विनिमय मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सेमी एमएस) के लिए प्रणाली स्थापित

  1. HPLC प्रणाली के साथ जाल स्तंभ (चित्रा 1) कनेक्ट. के प्रवाह की दर निर्धारित करके स्तंभ संतुलित करनाविलायक के रूप में 0.1% चींटी एसिड के साथ 0.4 मिलीग्राम / मिनट के लिए एक पंप. अभी तक पेप्सिन स्तंभ और न ही विश्लेषणात्मक स्तंभ कनेक्ट न करें.
  2. मास स्पेक्ट्रोमीटर जांचना और मास स्पेक्ट्रोमीटर के स्रोत के लिए HPLC के आउटलेट कनेक्ट.

5. एक्सचेंज के गतिशील रेंज का निर्धारण

  1. Ultrapure विलायक ए (पानी में 0.1% चींटी एसिड) और ultrapure विलायक बी (acetonitrile में 0.1% चींटी एसिड) तैयार, तैयार मिश्रित विलायकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. HPLC पंप पर्ज. एक छोटी desalting कदम के बाद एक कदम ढाल के साथ एक कार्यक्रम चुनकर क्रोमैटोग्राफी और नियंत्रण सॉफ्टवेयर में मास स्पेक्ट्रोमेट्री तरीकों की स्थापना की. पूर्ण लंबाई के लिए Hsp90 5% विलायक A/95% विलायक करने के लिए 90% विलायक A/10% विलायक बी से elute को फीका बनाना / लोड से 6 बंदरगाह वाल्व और एक कदम ढाल स्विचन के बाद 1-2 मिनट desalting कदम का उपयोग बी इंजेक्शन से पहले / लदान स्थिति फीका बनाना करने के लिए लोड करने के लिए इंजेक्शन वाल्व और 6 बंदरगाह वाल्व सेट.
    नोटइस प्रयोग के दौरान एक पेप्सिन या विश्लेषणात्मक स्तंभ का उपयोग न करें.
  2. 1-10 μl एच 2 ओ बफर में Hsp90 की 100-200 pmol को तैयार है और 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते 100 μl अप करने के लिए नमूना मात्रा लाने के लिए और समय का एक निर्धारित अवधि (जैसे 10 सेकंड, 100 सेकंड, 1000 सेकंड) के लिए बिल्कुल सेते तापमान समायोजित डी 2 हे बफर जोड़ें. 100 μl बुझाना बफर जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting और से मिश्रण. एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ इंजेक्शन वाल्व के इंजेक्शन बंदरगाह में 200 μl नमूना इंजेक्षन. क्रोमैटोग्राफी कार्यक्रम शुरू करने और इंजेक्षन स्थिति में इंजेक्शन वाल्व स्विच. 2 मिनट elute को फीका बनाना / लोड होने से 6 बंदरगाह वाल्व स्विच के बाद. कम से कम तीन बार के अंक के लिए इस दोहराएँ.
  3. दोहराएँ कदम 5.2 लेकिन पिछले 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए incubating को Hsp90 नमूना करने Sti1 के 2-3X अतिरिक्त जोड़
  4. मास स्पेक्ट्रोमेट्री सॉफ्टवेयर में स्पेक्ट्रा की deconvolution द्वारा पूर्ण लंबाई प्रोटीन जनता का निर्धारण करते हैं. Incorporat की संख्या की गणनाप्रत्येक रन (जैसे 10 सेकंड, 100 सेकंड, 1000 सेकंड) के बाद मनाया जन के साथ पूर्ण लंबाई Hsp90 की आणविक वजन की तुलना द्वारा deuterons एड.
  5. अभाव और समय (एक्स अक्ष) बनाम Sti1 (Y-अक्ष) की उपस्थिति में Hsp90 के लिए शामिल deuterons प्लॉट. दोनों घटता के बीच अंतर अधिक से अधिक है, जहां गतिशील रेंज में समय बिंदु निर्धारित करते हैं. Hsp90-Sti1 इंटरफेस और पेप्टाइड स्तर पर गतिशीलता की पहचान जब डी ओ 2 में ऊष्मायन समय के लिए इस मान का उपयोग करें.

6. एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा का प्रयोग पेप्टिक पेप्टाइड्स का निर्धारण

  1. प्रणाली को पेप्सिन स्तंभ और विश्लेषणात्मक स्तंभ कनेक्ट करें.
  2. ढाल प्रकार और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि का चयन करके नियंत्रण सॉफ्टवेयर में क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए मानकों सेट. अच्छा chromatographic संकल्प सुनिश्चित करने के लिए एक लंबे ढाल (जैसे 90 से अधिक मिनट) चुनें. मास स्पेक्ट्रोमीटर पर एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा सक्षम करें.
    नोट: अच्छा प्रस्तावHPLC और उच्च जन सटीकता पर tion इस चरण में सर्वोच्च प्राथमिकता है.
  3. 100 μl एच 2 ओ बफर में Hsp90 की 100-200 pmol तैयार करें. 100 μl बुझाना बफर जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting और से मिश्रण. एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ इंजेक्शन वाल्व के इंजेक्शन बंदरगाह में 200 μl नमूना इंजेक्षन. क्रोमैटोग्राफी कार्यक्रम शुरू करने और इंजेक्षन स्थिति में इंजेक्शन वाल्व स्विच. 2 मिनट स्थिति elute को फीका बनाना / लोड होने से 6 बंदरगाह वाल्व स्विच के बाद.
    नोट: एक से अधिक प्रोटीन सेमी एमएस (यानी प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत इंटरफेस) में विश्लेषण किया जा रहा है, तो प्रत्येक प्रोटीन के लिए पेप्टाइड्स व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना है.
  4. परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स के लिए एक डेटाबेस (यानी शुभंकर) खोज के द्वारा Hsp90 की पेप्टिक पेप्टाइड्स पहचानें.
    नोट: उद्देश्य के लिए संभव के रूप में कई पेप्टिक पेप्टाइड्स निर्धारित करने के लिए है और विश्लेषण शुद्ध प्रोटीन के साथ किया जाता है के रूप में यह एक कस्टम डेटाबेस का उपयोग करना संभव है. नमूना पवित्रता होगा जध्यान में रखा जाना करने के लिए एवेन्यू.
  5. एमएस / एमएस के बिना और वास्तविक सेमी प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि ढाल के साथ इस चरण को दोहराएँ. Hsp90 और Sti1 45% विलायक A/55% विलायक बी के लिए 90% विलायक A/10% विलायक बी से एक 10 मिनट ढाल का उपयोग करें
    नोट: अनुपात में 5-15 मिनट के बीच और अत्यधिक नमूना जटिलता और सेमी प्रणाली की विशेषताओं पर निर्भर सामान्य रूप से कर रहे हैं.
  6. 6.5 में इस्तेमाल ढाल में 6.4 में पहचान पेप्टिक पेप्टाइड्स की अवधारण समय निर्धारित और 1 जिसमें एक सूची बनाते हैं.) पेप्टाइड अनुक्रम 2.) पेप्टाइड प्रभारी राज्य और 3.) प्रतिधारण समय. इस सेमी प्रयोगों के बाद एक पेप्टाइड की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    नोट: छोटे मी / z मतभेद, समान प्रभारी राज्य और समान प्रतिधारण समय के साथ पेप्टाइड्स अस्पष्टता का एक स्रोत हो सकता है जागरूक बनो.

7. प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत इंटरफेस की पहचान

  1. नियंत्रण softwar में ढाल और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि की स्थापनाई. , 300-1,500 मी / z के बीच जनता का पता लगाने के लिए अनुकूलित है कि एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि लोड 45% विलायक A/55% विलायक बी के लिए 90% विलायक A/10% विलायक बी से एक 10 मिनट रैखिक ढाल का प्रयोग हालांकि के सबसे पेप्टाइड्स 1000 मी / z नीचे हो जाएगा. लोड स्थिति, लोडिंग / desalting स्थिति में 6 बंदरगाह वाल्व में इंजेक्शन वाल्व सेट करें. 0.4 मिलीग्राम / मिनट के लिए लदान पंप के प्रवाह की दर निर्धारित करें.
    नोट: लंबाई और ढाल के प्रकार नमूना निर्भर हैं और अनुकूलित किया जा सकता है. लंबे समय तक ढ़ाल क्रोमैटोग्राफी के संकल्प में सुधार, लेकिन वापस मुद्रा की वजह से प्रोटीन में deuterons का समावेश कमी. चुना तरीकों सभी प्रयोगों तुलना करने के लिए एक ही होना चाहिए.
  2. Unexchanged संदर्भ के लिए 100 μl एच 2 ओ बफर में Hsp90 की 20-100 pmol तैयार करते हैं. दो बार नीचे 100 μl ठंडा बुझाना बफर, पिपेट ऊपर और जोड़ें और HPLC इंजेक्शन वाल्व में नमूना इंजेक्षन. तुरंत क्रोमैटोग्राफी कार्यक्रम और दप शुरूइंजेक्षन स्थिति में इंजेक्शन वाल्व खुजली. 2 मिनट स्थिति elute को फीका बनाना / लोड होने से 6 बंदरगाह वाल्व स्विच के बाद. Hsp90 और Sti1 व्यक्तिगत और प्रोटीन के मिश्रण के लिए के लिए यह करो.
  3. 1-5 μl की एक मात्रा में Hsp90 की 20-100 pmol तैयार करें. (; गठनात्मक गतिशीलता नोट देखने के लिए जैसे 30 सेकंड) 100 μl अप करने के लिए नमूना मात्रा लाने के लिए और समय का एक निर्धारित अवधि के लिए बिल्कुल सेते तापमान समायोजित डी 2 हे बफर जोड़ें. दो बार नीचे ठंडा बुझाना बफर, पिपेट ऊपर और के 100 μl जोड़ें और जल्दी से HPLC इंजेक्शन वाल्व में 200 μl इंजेक्षन. तुरंत क्रोमैटोग्राफी कार्यक्रम शुरू करने और इंजेक्षन स्थिति में इंजेक्शन वाल्व स्विच. 2 मिनट स्थिति elute को फीका बनाना / लोड होने से 6 बंदरगाह वाल्व स्विच के बाद. बातचीत के दौरान प्रोटीन के अभाव में प्रत्येक पेप्टाइड में ड्यूटरान समावेश निर्धारित करने के लिए, व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक प्रोटीन के लिए यह करो.
    नोट: confor की गतिशीलता का अध्ययन, परिवर्तन mational डी 2 हे बफर में Hsp90 की अलग ऊष्मायन समय के साथ प्रयोग दोहराने. (उदाहरण के लिए 10 सेकंड, 30 सेकंड, 100 सेकंड, 300 सेकंड, 1000 सेकंड, आदि) logarithmically ऊष्मायन बार चुनकर एक विस्तृत timescale कवर करने की कोशिश. डी 2 हे बफर और नमूना बफर हाइड्रोजन आइसोटोप के लिए छोड़कर बिल्कुल समान होना चाहिए.
  4. 100% नियंत्रण नमूना (20-100 pmol) के बराबर राशि को तैयार है और 100 μl अप करने के लिए नमूना मात्रा लाने के लिए डी 2 हे बफर जोड़ें. दो बार नीचे ठंडा बुझाना बफर, पिपेट ऊपर और के 100 μl जोड़ें और जल्दी से HPLC इंजेक्शन वाल्व में 200 μl इंजेक्षन. तुरंत क्रोमैटोग्राफी कार्यक्रम शुरू करने और इंजेक्षन स्थिति में इंजेक्शन वाल्व स्विच. 2 मिनट स्थिति elute को फीका बनाना / लोड होने से 6 बंदरगाह वाल्व स्विच के बाद.
  5. बातचीत सतह निर्धारित करने के लिए (नोट देखें) बाध्य राज्य को संतुलन में बदलाव और सेते Sti1 का कम से कम 2 गुना अधिक से Hsp90 मिश्रणवांछित तापमान में जटिल गठन तक संतुलन पर है. 100 μl अप करने के लिए नमूना मात्रा लाने और समय (उदाहरण के लिए 30 सेकंड) का एक निर्धारित अवधि के लिए बिल्कुल सेते तापमान समायोजित डी 2 हे बफर जोड़ें. दो बार और जल्दी HPLC इंजेक्शन वाल्व में सुई नीचे ठंडा बुझाना बफर, पिपेट ऊपर और के 100 μl जोड़ें. 2 मिनट स्थिति elute को फीका बनाना / लोड होने से 6 बंदरगाह वाल्व स्विच के बाद. 20-100 Sti1 की pmol और HSP90 के अतिरिक्त के साथ इस प्रयोग को दोहराएँ.
    नोट: निरपेक्ष सांद्रता बातचीत की हदबंदी संतुलन निरंतर पर निर्भर करते हैं. आदर्श रूप में, डी 2 ओ में कमजोर पड़ने के बाद प्रोटीन की एकाग्रता (बाध्य कम केंद्रित प्रोटीन की> 85% करने के लिए इसी) में कम से कम 10x कश्मीर विकास होना चाहिए अतिरिक्त में जोड़ा.
  6. उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त डेटा का विश्लेषण और विश्लेषण में प्रत्येक पेप्टाइड खोजने के लिए कदम 6.5 में निर्धारित अवधारण समय का उपयोग करें. Calculaते unexchanged प्रोटीन (कदम 7.2) के लिए और सेमी प्रयोगों (कदम 7.3) के लिए आइसोटोप वितरण के केन्द्रक.
    नोट: विमर्श पेप्टाइड्स के आइसोटोप पैटर्न पेप्टाइड का आरोप राज्य के बारे में ज्ञान और centroids की आसान दृढ़ संकल्प के लिए अनुमति देता है मास स्पेक्ट्रोमीटर के उच्च जन सटीकता दोनों, उनके unexchanged समकक्षों से अलग लग रही है.
  7. लक्ष्य प्रोटीन की deuterons अकेले और साथी बंधन से अधिक के साथ के समावेश से तुलना कर लें. यह एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम के साथ स्वयं वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर या साथ स्वचालित रूप से किया जा सकता है. 100% नियंत्रण नमूना मान प्रत्येक पेप्टाइड के लिए अधिक से अधिक विनिमय निरूपित और ओ लेबल के कारण वापस विनिमय प्रयोग के दौरान खो डी 2 की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Representative Results

HSP90 खमीर और HSP90 निगरानी परिवार के सदस्य में एक आणविक निगरानी है. एक जटिल ATPase चक्र के माध्यम से जा रहा द्वारा कई प्रोटीन ग्राहकों की देर तह कदम मदद करता है. कुशल तह Hsp70 से ग्राहकों के हस्तांतरण और सह निगरानी Sti1/Hop की बातचीत की आवश्यकता है. Sti1 सीधे Hsp90 को बांधता है और HSP90 के ATPase गतिविधि के निषेध से बाध्यकारी ग्राहक की सुविधा. Sti1 साथ Hsp90 की बातचीत हाल ही में सेमी एमएस 23 अध्ययन कर रहा था. यहाँ हम ऊपर प्रोटोकॉल के बाद अंतर्निहित प्रयोगों के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं.

प्रत्यक्ष प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत डी ओ 2 के साथ संतुलन में प्रोटीन जटिल लेबलिंग और Hsp90.The परिणामस्वरूप अंतर साजिश की अनुपस्थिति और उपस्थिति में Sti1 पेप्टाइड स्पेक्ट्रा की तुलना चित्रा 5A (23 से डेटा) में देखा जा सकता द्वारा परीक्षण किया गया था. पेप्टाइड्स एन टर्मिनस पर शुरू ऊपर से नीचे तक उन्मुख होते हैं. अधिकतर पेप्टाइड्स मेंइन क्षेत्रों Hsp90 के साथ बातचीत का संकेत है कि - TPR2a और TPR2b Hsp90 (डी Hsp90 डी + Hsp90 के लिए नकारात्मक मान) की उपस्थिति में एक मजबूत सुरक्षा दिखा. TPR2a में सुरक्षा आसानी Hsp90 की सी टर्मिनल MEEVD-आकृति (चित्रा 5 ब) का प्रतिनिधित्व एक पेप्टाइड के साथ परिसर में Sti1-TPR2a-TPR2b की क्रिस्टल संरचना से युक्तिसंगत बनाया जा सकता है. प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में इस तरह के एक स्पष्ट सुरक्षा हमेशा नहीं मनाया जाता है. Sti1 की उपस्थिति में Hsp90 में सुरक्षा Sti1 (आंकड़े 5C और 5D) में के रूप में स्थानीय रूप में के रूप में स्पष्ट नहीं है और नहीं है. सभी पेप्टाइड्स Sti1 की उपस्थिति में ड्यूटरान समावेश से थोड़ी वृद्धि हुई सुरक्षा दिखा. प्रोटीन का कोई क्षेत्र Sti1 की उपस्थिति में अधिक लचीलापन दिखाता है Sti1 जाहिर विश्व स्तर पर Hsp90 स्थिर. यह कम ड्यूटरान समावेश Sti1 साथ या रचना पर allosteric प्रभाव के माध्यम से सीधी बातचीत से निकलती है, तो हम फिर भी, भेद नहीं कर सकतेHsp90 की. प्राप्त जानकारी के कुछ पेप्टाइड्स (NBD की जैसे पेप्टाइड 43-62) के लिए ख्यात बातचीत साइट कम कर देता है. ऐसे crosslinking के रूप में अतिरिक्त प्रयोगों सामान्यतः सेमी एमएस 23 के बाद बाध्यकारी साइटों पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जाता है. Hsp90-Sti1 जटिल मापने जब ध्यान से, Hsp90 की अनुक्रम कवरेज में कमी आई है. Sti1 3.5 गुना अधिक में जोड़ा गया है के बाद से विश्लेषण में पेप्टाइड्स के सैद्धांतिक कुल राशि कुछ अकेले Hsp90 के साथ की तुलना में चार गुना अधिक था. इस विश्लेषण के दौरान Hsp90 पेप्टाइड्स पड़ या ओवरलैपिंग Sti1 पेप्टाइड्स का खतरा बढ़ जाता है. उच्च अनुक्रम कवरेज बेहतर chromatographic जुदाई के लिए अनुकूलन की सबसे आशाजनक दृष्टिकोण हो रहा है.

विभिन्न प्रोटीन क्षेत्रों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक संभावना निरंतर लेबलिंग सेमी एमएस का इस्तेमाल होता है. यह समय के विभिन्न अवधियों के लिए डी ओ 2 में equilibrated प्रोटीन के नमूने की ऊष्मायन शामिल है और इसलिए अनुमति देता है की स्थिरता के बारे में भविष्यवाणीव्यक्तिगत प्रोटीन क्षेत्रों. चित्रा 6 उपस्थिति और Sti1 के 3.5 गुना अधिक के अभाव में Hsp90 की NBD से पेप्टाइड 43-62 की स्पेक्ट्रा दिखाता है. ऊष्मायन बार एक विस्तृत समय खिड़की पर अच्छा कवरेज पाने के लिए एक लघुगणक स्केल (10 सेकंड, 100 सेकंड, और 1000 सेकंड) पर चुने गए हैं. पेप्टाइड स्पेक्ट्रा अब ऊष्मायन समय के लिए बढ़ जाती है कि प्रोटीन में ड्यूटेरियम की एक समय निर्भर समावेश दिखा. पेप्टाइड के लिए 43-62 विनिमय EX2 तंत्र जहां कश्मीर INT << कश्मीर सीएल निम्नानुसार है. सुरक्षा की डिग्री सबसे लंबे समय के बिंदु पर कम ऊष्मायन समय और लगभग इसी तरह की विनिमय दर में बड़ा अंतर दिखा, ऊष्मायन समय में बदलाव. यह एक डिग्री कम स्थिरीकरण या अक्सर हदबंदी और reassociation साथ गतिशील बातचीत के एक क्षेत्र से पता चलता है. मनाया संरक्षण पेप्टाइड या प्रभाव में एमाइड प्रोटॉन की एक समग्र कम विनिमय दर की वजह से है तो एक या दो को सौंपा जा सकता हैSti1 की उपस्थिति में और अधिक धीरे आदान प्रदान कि विशिष्ट एमाइड प्रोटॉन. Hsp90 क्रिस्टल संरचना एक उजागर पाश के बजाय α-हेलिसिस या β पत्र की तरह एक नियमित माध्यमिक संरचना होने के लिए इस क्षेत्र का पता चला के रूप में इस मामले में बाद और अधिक संभावित है.

यह वापस विनिमय मनाया प्रभाव 100% नियंत्रण करने के लिए एक बार सामान्यीकृत और अधिक स्पष्ट हो जाएगा जिसका अर्थ है कि दिखाया गया डेटा से घटाया नहीं गया है उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है.

चित्रा 1
चित्रा 1. सेमी एमएस के लिए HPLC सेटअप. एक सेमी एमएस की एक) विशिष्ट विन्यास की स्थापना की. अलग अलग रंग क्षेत्रों में अलग तापमान पर बनाए रखा वर्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं. नमूना इंजेक्शन वाल्व (लोड मोड में, सियान) का नमूना पाश में इंजेक्शन और में वाल्व स्विचन के बाद "मोड इंजेक्षन" है (काला) के माध्यम से पंप6 बंदरगाह वाल्व में पेप्सिन स्तंभ. पेप्सिन स्तंभ पेप्सिन के enzymatic गतिविधि में सुधार करने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पर मोटे तौर पर बनाए रखा है. 6 बंदरगाह वाल्व दो मोड, "लोड / desalting मोड" और "क्षालन मोड" (ख देखें). नमूना के desalting बाद पेप्टाइड्स chromatographically एक विश्लेषणात्मक उलट चरण स्तंभ पर एक acetonitrile ढाल के साथ अलग हो रहे हैं. पेप्टाइड्स तो एक ईएसआई स्रोत के साथ मास स्पेक्ट्रोमीटर में स्प्रे कर रहे हैं. 6 बंदरगाह वाल्व बी) मोड. सीधे सेमी के बाद 6 बंदरगाह वाल्व फंसाने के लिए "लोड / desalting स्थिति" जाल स्तंभ पर पेप्टिक पेप्टाइड्स में है. इस मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ हस्तक्षेप कर सकता है कि प्रतिक्रिया बफ़र्स के किसी लवण या यौगिकों को दूर करने के लिए तीन मिनट के लिए जारी रखा है. इस के बाद "क्षालन मोड" में 6 बंदरगाह वाल्व स्विच ढाल पंप और विश्लेषणात्मक स्तंभ के बीच प्रवाह पथ में लोड जाल स्तंभ लगा. फंस पेप्टिक पेप्टाइड्स अब जाल Colu से eluteएम.एन. और acetonitrile में 0.1% चींटी acid/0.1% चींटी एसिड की एक ढाल में अलग हो जाते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक सेमी प्रयोग की योजना प्रवाह. 1) लक्ष्य प्रोटीन डिटर्जेंट बिना शुद्ध और मानक बफ़र्स में आपूर्ति की है. 2) प्रोटीन enzymatically पेप्सिन साथ पच जाता है और पेप्टिक पेप्टाइड्स पहचान और अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) की विशेषता है. केवल अनुक्रम प्राप्त करने के बाद, संभव के रूप में सेमी एमएस सफलतापूर्वक किया जा सकता है के रूप में कई पेप्टाइड्स के राज्य और अवधारण समय चार्ज. 3) प्रयोगात्मक शर्तों के ऐसे विशिष्ट शर्तों (ligand / रासायनिक यौगिक या तापमान या पीएच में बदलाव के अलावा तहत प्रोटीन की ऊष्मायन के रूप में स्थापित कर रहे हैं. 4) सेमी नमूना गिराए द्वारा किया जाता है डी 2 हे बफर में 01:10 या उच्चतर . डी 2 हे बफर avo करने के लिए नमूना बफर करने के लिए समान होना चाहिएआईडी बफर प्रभाव. तब नमूना समय का एक निर्धारित अवधि के लिए बिल्कुल incubated है. 5) ऊष्मायन के बाद प्रतिक्रिया बुझती है और HPLC एमएस प्रणाली में इंजेक्ट किया. नमूना enzymatically cleaved है और जिसके परिणामस्वरूप पेप्टिक पेप्टाइड्स एक कार्बनिक विलायक ढाल में अलग और मास स्पेक्ट्रोमीटर में इंजेक्ट कर रहे हैं. प्राप्त पेप्टाइड स्पेक्ट्रा 6) विश्लेषण. पेप्टाइड स्पेक्ट्रा की centroids अलग प्रतिक्रिया परिस्थितियों में तुलना कर रहे हैं. यह एक सेमी विश्लेषण कार्यक्रम द्वारा स्वचालित रूप से उपयुक्त सॉफ्टवेयर या के साथ मैन्युअल रूप से किया जा सकता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. हाइड्रोजन विनिमय तंत्र. हाइड्रोजन विनिमय की प्रतिक्रिया आधार या एसिड द्वारा उत्प्रेरित किया जा सकता है और इसलिए एमाइड बांड 6 flanking अवशेषों के पक्ष श्रृंखला के आधार पर पीएच 2.5 और 3 के बीच एक न्यूनतम विनिमय दर के साथ निर्भर पीएच है. दूरिंग desalting और एच 2 में किया जाता है जो पेप्टाइड्स के chromatographic जुदाई, हे युक्त सॉल्वैंट्स शामिल deuterons ही व्यवस्था ("वापस मुद्रा") के अनुसार प्रोटॉनों के लिए वापस विमर्श कर रहे हैं. इसलिए, सिस्टम और इस्तेमाल विलायकों का अनुकूलन शामिल deuterons के नुकसान को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है.

चित्रा 4
चित्रा 4. सेमी एमएस के सिद्धांत. एमाइड रीढ़ की सुरक्षा में प्रोटीन परिणाम के लिए एक ligand के बंधन आसपास विलायक से बाध्यकारी साइट पर hydrogens. इस प्रभावित प्रोटॉन की विनिमय दरें कम हो जाती है और deuterons का समावेश कम हो जाती है. प्रोटॉन और ड्यूटरान के बीच वजन का अंतर 1 दा है, क्योंकि प्रोटीन के इस क्षेत्र से व्युत्पन्न पेप्टाइड्स मास स्पेक्ट्रोमेट्री में एक कम मी / z दिखाएगा. प्रयोगों की पेप्टाइड स्पेक्ट्रा की तुलनाअभाव और बाध्यकारी साथी की उपस्थिति में एम / Z मूल्यों (सुरक्षा घटना) को कम करने के स्पेक्ट्रा के केन्द्रक की एक पारी खोलेगा. साथी बंधन के बाद इसके अलावा प्रमुख सुरक्षा है कि प्रदर्शन के क्षेत्र में संभावित बाध्यकारी साइटों रहे हैं. अनुक्रम कवरेज और बाध्यकारी साइटों पेप्टाइड्स ओवरलैपिंग की उपलब्धता के आधार पर कुछ अमीनो एसिड के लिए नीचे संकुचित किया जा सकता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. Hsp90 और Sti1 की बातचीत. Hsp90 (23 से डाटा) के अभाव में Sti1 में साथी Hsp90 शून्य से ड्यूटरान समावेश बंधन की उपस्थिति में Sti1 में ड्यूटरान समावेश की एक, अंतर साजिश. बी, कार्टून TPR2a और TPR2b (पीडीबी कोड 3UQ3) शामिल Sti1 का एक टुकड़ा का प्रतिनिधित्व Hsp90 की सी टर्मिनल MEEVD-आकृति का प्रतिनिधित्व करता है जो एक पेप्टाइड के साथ परिसर में. कार्टून एक्कोर रंग का हैडिंग संकेत के रूप में ड्यूटरान समावेश से संरक्षित एमाइड प्रोटॉनों की संख्या को. सी, साथी Sti1 बंधन की उपस्थिति में Hsp90 की अंतर साजिश. उसी के तापमान पर सेमी, 30 डिग्री सेल्सियस और 30 सेकंड में 3.5 अतिरिक्त Sti1 साथ 10 मिनट preincubation बाद Hsp90 में मनाया ड्यूटरान समावेश. प्रयोग तीन प्रतियों में बाहर किया गया था और मतलब की मानक त्रुटि प्रत्येक पेप्टाइड के लिए दिखाया गया है. ग्लोबल नकारात्मक मूल्यों deuterons के कम समावेश और Sti1 की उपस्थिति में Hsp90 की इसलिए उच्चतर समग्र स्थिरता निरूपित. पीछे विनिमय इस प्रयोग में नहीं माना जाता था. डी, खमीर Hsp90 (पीडीबी कोड 2CG9) बी में संकेत के रूप में ड्यूटरान समावेश से संरक्षित एमाइड प्रोटॉन की संख्या के हिसाब से रंग का कार्टून प्रतिनिधित्व. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6. Sti1 की अनुपस्थिति और उपस्थिति में खमीर Hsp90 में ड्यूटरान समावेश के समय के पाठ्यक्रम. एक, निरंतर लेबलिंग हाइड्रोजन विनिमय के बाद Hsp90 की न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी डोमेन से पेप्टाइड 43-62 की unprocessed पेप्टाइड स्पेक्ट्रा. 20 माइक्रोन Hsp90 संतुलन और डी 2 तक पहुंचने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 70 माइक्रोन Sti1 साथ incubated रहे थे हे लेबलिंग 10 सेकंड, 100 सेकंड, और 1,000 सेकंड के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया था. लाल तुच्छ मार्करों प्रत्येक पेप्टाइड के लिए गणना की centroids संकेत मिलता है. बी, उपस्थिति और 3.5 अतिरिक्त Sti1 के अभाव में पेप्टाइड 43-62 की विनिमय कैनेटीक्स. पीछे विनिमय इस प्रयोग में विचार नहीं किया गया.

चित्रा 7
चित्रा 7. Bimodal distribut के साथ पेप्टाइड स्पेक्ट्रा के लिए उदाहरणआयन. ई. में एक, ड्यूटरान समावेश अभाव और एटीपी की उपस्थिति में कोली Hsp90 (22 suppl से लिया डेटा. चित्रा 3). पेप्टाइड अवशेषों 192-206 के स्पेक्ट्रा 30 सेकंड, 5 मिनट, 10 मिनट, और डी ओ 2 में 30 मिनट ऊष्मायन, और 100% नियंत्रण (100% डी) के बाद, डी 2 ओ (0% डी) में ऊष्मायन से पहले दिखाए जाते हैं . एटीपी (एटीपी) के अभाव में एक ठेठ EX2 विनिमय व्यवहार मनाया जाता है. एटीपी की उपस्थिति में (+ एटीपी) एक मजबूत सुरक्षा 30 सेकंड पर और प्रोटीन की दो आबादी का संकेत 5 मिनट और 10 मिनट के समस्थानिक चोटियों की bimodal वितरण, पर मनाया जाता है, एक एटीपी बाध्य राज्य के समान जनसंख्या और करने के लिए एक दूसरे के समान न्यूक्लियोटाइड मुक्त राज्य. 30 मिनट में अभाव और एटीपी की उपस्थिति के बीच कोई अंतर नहीं मनाया जाता है. bimodal वितरण सबसे अधिक संभावना है कि इस प्रोटीन के क्षेत्र में उच्च लचीलेपन के साथ एटीपी hydrolysis और न्यूक्लियोटाइड मुक्त राज्य के माध्यम से संक्रमण के कारण होता है. ये स्पेक्ट्रा एक शास्त्रीय EX1 विनिमय regi के सदृशमुझे. बी, पल्स लेबलिंग सेमी प्रयोगों में समस्थानिक चोटियों की bimodal वितरण. ई. कोली Hsp90 10-300 सेकंड के लिए एटीपी के अभाव में या एटीपी की उपस्थिति में incubated और बाद में संकेत के रूप में डी ओ 2 में 10 सेकंड के लिए पल्स लेबल (22 चित्रा -4 ए से लिया डेटा) किया गया था. bimodal वितरण फिर से अणुओं के दो coexisting आबादी, अन्य की तुलना में deuterons के लिए और अधिक तेजी से एमाइड प्रोटॉन का आदान प्रदान करते है. एटीपी धीमी आदान प्रदान रचना में आदान प्रदान के लिए तेजी से एक धीमी गति से संक्रमण को प्रेरित करता है.

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Discussion

एक प्रोटीन के लिए एक बातचीत साथी की बाइंडिंग अनिवार्य रूप से बाध्यकारी साइट पर विलायक पहुँच में परिवर्तन का कारण बनता है. साथ ही, कई प्रोटीन वास्तविक बाध्यकारी इंटरफेस के अलावा अन्य क्षेत्रों को प्रभावित जो बंधन पर गतिशील गठनात्मक परिवर्तन से गुजरना. सेमी एमएस इन परिवर्तनों पर नजर रखने के लिए एक मजबूत विधि है और अन्य तरीकों को कवर नहीं कर सकते हैं कि timescales पर प्रोटीन में गठनात्मक परिवर्तन खुलासा भी सक्षम है.

सफलतापूर्वक सेमी एमएस प्रदर्शन करने के लिए तीन अंक महत्वपूर्ण हैं: 1) एक इष्टतम प्रणाली सेटअप, नमूना प्रसंस्करण के 2) सटीक निष्पादन और 3) सावधान डेटा विश्लेषण पेप्टाइड स्पेक्ट्रा बताए और परिणामों की व्याख्या करते हैं.

सिस्टम सेटअप

मास स्पेक्ट्रोमेट्री पेप्टाइड में ड्यूटरान निगमन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, नमूना तैयार करने के बारे में एक ही सावधानियों सेमी एमएस के लिए लागू होते हैं. मास स्पेक्ट्रोमेट्री थानेदार के साथ हस्तक्षेप है कि डिटर्जेंट, लवण और अन्य यौगिकोंuld विश्लेषण से पहले बचा या हटाया जा. सेमी एमएस बड़े प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण की अनुमति देता है, जबकि उच्च जटिलता पेप्टाइड जुदाई और मास स्पेक्ट्रोमेट्री की वृद्धि की गुणवत्ता की मांग. Chromatographic शर्तों का अनुकूलन अच्छी गुणवत्ता डेटा प्राप्त करने की कुंजी है. यह उच्च गुणवत्ता कार्बनिक विलायकों का चुनाव उलट चरण सामग्री के रूप में भी ढ़ाल और विलायकों का अनुकूलन शामिल है. कार्बनिक विलायकों के साथ स्तंभों की धुलाई पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए प्रयोगों और रात के बीच किया जा सकता है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री के तरीके (300-1,200 मी / z के बीच) पेप्टिक पेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. अलग पेप्टाइड्स से होने वाले आंशिक रूप से अतिव्यापी समस्थानिक शिखर समूहों प्रतिष्ठित किया जा सकता है क्योंकि उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर बहुत डेटा विश्लेषण की सुविधा.

नमूने के प्रसंस्करण सेमी एमएस के लिए महत्वपूर्ण है. आमतौर पर हमारे buffers और नमूने समुच्चय और पार्टी को दूर करने के लिए 13,000 आरपीएम (microfuge) पर 10 मिनट के लिए नीचे घूमती हैcles. इसके अलावा, कई इनलाइन फिल्टर स्तंभों के clogging रोकने के लिए HPLC प्रणाली में स्थापित किया जा सकता है. डी में मामूली विचलन 2 हे ऊष्मायन बार बड़ा प्रभाव हो सकता है. बहुत लचीला प्रोटीन क्षेत्रों के लिए केवल कुछ सेकंड के लिए एक अंतर नहीं ड्यूटरान सब में समावेश और पूर्ण deuteration के बीच फर्क कर सकते हैं. प्रोटीन की गतिशीलता के साथ ही आंतरिक विनिमय दर तापमान के एक समारोह कर रहे हैं, नमूना और buffers की ऊष्मायन कसकर तापमान नियंत्रित कर रहे हैं. यह हमेशा हर प्रयोग के लिए कदम का सही अनुक्रम दोहराने के लिए फायदेमंद है. सही ढंग से क्रियान्वित तो दो प्रयोगों के बीच त्रुटि अपेक्षाकृत छोटा हो जाएगा. आज, सेमी एमएस के लिए स्वचालित प्रणाली व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और नमूना प्रसंस्करण की चुनौतियों को कम.

डेटा का विश्लेषण

सेमी एमएस में सबसे महत्वपूर्ण कदम डेटा का विश्लेषण, पेप्टाइड स्पेक्ट्रा का विशेष रूप से काम और deuteration स्तरों के दृढ़ संकल्प है. गुसेमी एमएस की ई उत्पादन पेप्टाइड स्पेक्ट्रा की एक बड़ी संख्या से युक्त chromatographic ढाल की एक क्षालन प्रोफ़ाइल है. ऑपरेटरों कार्य प्रोटोकॉल के चरण 6 में एमएस / एमएस द्वारा की पहचान पेप्टाइड) को इन स्पेक्ट्रा आवंटित करने के लिए है. स्पेक्ट्रा काफी सेमी बाद उच्च मी / z दिशा में बदलाव कर सकते हैं के रूप में यह कुछ हद तक मुश्किल हो सकता है. इसके अलावा स्पेक्ट्रा का आंशिक अतिव्यापी पेप्टाइड्स के काम को मुश्किल हो सकती है. वे अक्सर अतिव्यापी पेप्टाइड्स हल कर सकते हैं, क्योंकि इस मामले में उच्च जन सटीकता के साथ उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर के उपयोग से भुगतान करता है. ड्यूटरान समावेश में अंतर पेप्टाइड स्पेक्ट्रा की centroids के आधार पर गणना कर रहे हैं. centroids निर्धारित किया जा सकता है: 1) स्वयं एक पेप्टाइड स्पेक्ट्रम के प्रत्येक समस्थानिक शिखर अंकन और एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम (जैसे एक्सेल, माइक्रोसॉफ्ट) में तीव्रता और मी / z के लिए अपने मूल्यों के हस्तांतरण और केन्द्रक की गणना के द्वारा या 2) आवंटित करने के लिए डिजाइन सॉफ्टवेयर के साथ समस्थानिक चोटियों एक पहचान पेप्टाइड से संबंधित और गणना करने के लिएcentroids स्वतः (जैसे HDExaminer, सिएरा विश्लेषिकी या HeXicon 24,25).

सेमी एमएस का अनुकूलन

1) क्रोमैटोग्राफी के अनुकूलन (ढाल की विलायकों, लंबाई / आकार, विभिन्न उलट चरण सामग्री का उपयोग) या 2) एंजाइमी दरार की बदलती: मूल्यांकित पेप्टाइड्स की संख्या बहुत कम है, प्रयोग का अनुकूलन करने के लिए कई अन्य संभावनाएं हैं प्रोटीन (वैकल्पिक प्रोटीज, पेप्सिन के साथ लंबे समय तक / कम ऊष्मायन समय, बुझाना बफर करने के लिए एजेंटों denaturing के अलावा). वे या तो पेप्टाइड पूल में ही या HPLC जुदाई बदल के रूप में दोनों मानकों पेप्टाइड्स के क्षालन व्यवहार बदल जाते हैं. दोनों अनुकूलन दृष्टिकोण पेप्टाइड्स recharacterize करने की आवश्यकता की कीमत पर आते हैं. अन्य proteases एमएस / एमएस द्वारा की पहचान की और कदम 6.6 में वर्णित के रूप में होती जा है कि अलग पेप्टाइड) का उत्पादन होगा. क्रोमैटोग्राफी स्थितियों को बदलने पेप्टाइड पूल लेकिन अवधारण तिवारी को बदल नहीं जाएगाव्यक्तिगत पेप्टाइड्स के एमईएस. प्रतिधारण बार फिर) कदम 6.5 में के रूप में redetermined किया जाना है. यह उच्च प्रतिधारण समय हमेशा अब अवधारण समय पर ही वापस विनिमय बढ़ जाती है पता लगाने योग्य लेबल की मात्रा को कम करेगा कि उल्लेख किया जाना चाहिए. 100% नियंत्रण करने के लिए डेटा को सामान्य वापस मुद्रा के साथ सौदा करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है. उच्च वापस विनिमय शामिल deuterons का नुकसान और इसलिए संकेत की ओर जाता है. यह दृढ़ता से एक न्यूनतम करने के लिए वापस मुद्रा की मात्रा को कम करने के लिए सिफारिश की है. यह अलग सेमी एमएस setups हार्डवेयर, इस्तेमाल किया buffers और विलायकों की रचना और 26 उपयोग किया जाता है कि ढ़ाल के प्रकार पर निर्भर करता है, वापस एक्सचेंज का अपसारी दरों होगा कि ध्यान दिया जाना चाहिए.

डेटा की व्याख्या

डेटा का विश्लेषण, समस्थानिक चोटियों की तीव्रता वितरण यह विनिमय तंत्र को संकेत दे सकता है क्योंकि सावधानी से मूल्यांकन किया जाना चाहिए. कम से एक जन के साथ पेप्टाइड्स के लिएunexchanged नमूना के समस्थानिक चोटियों के 2,000 दा तीव्रता monoisotope या पहली उच्च आइसोटोप शिखर के लिए उच्च तीव्रता के साथ आम तौर पर असममित है से. EX2 विनिमय शासन के लिए इस असममित तीव्रता वितरण डी ओ 2 में बढ़ती समय और उच्च मी / z और के बारे में 50% से समस्थानिक क्लस्टर वृद्धि (चित्रा 7) की चौड़ाई के लिए बढ़ती बदलाव के साथ गाऊसी की तरह हो जाता है. परिचय EX2 में कहा गया है सबसे अधिक देशी परिस्थितियों में सेमी एमएस में मनाया और विनिमय की दर मनाया प्रोटीन के thermodynamic स्थिरता को इसलिए लगातार कश्मीर यू और खुलासा संतुलन के लिए आनुपातिक है. इसके विपरीत, EX1 विनिमय शासन के लिए काफी समस्थानिक क्लस्टर बढ़ जाती है और bimodal या बहुविध तीव्रता वितरण की चौड़ाई वितरण 25,27 (7 चित्र देखें) मनाया जाता है. Bimodal आइसोटोप वितरण हमेशा दो या अधिक अलग अणु प्रजातियों का संकेतविश्लेषण में, संभावित दिलचस्प हैं. हालांकि, नुकसान के दो प्रकार के होते हैं. सबसे पहले, आइसोटोप क्लस्टर दो अलग पेप्टाइड्स से होने वाले चोटियों से बना हो सकता है. यह भी इसी मी / z और समान प्रभारी के साथ पेप्टाइड्स के लिए unexchanged नमूना की स्पेक्ट्रा की जांच करने के लिए इसलिए अनिवार्य है. पेप्टाइड्स आमतौर पर अवधारण समय में से थोड़ा भिन्न है और समस्थानिक चोटियों की तीव्रता वितरण क्षालन समय के साथ बदलता रहता है. उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर, एक ही पेप्टाइड का सदस्य नहीं है कि समस्थानिक चोटियों भी मी / z मूल्यों के दशमलव के द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है. दूसरा, पिछले एक HPLC एमएस रन से carryover 28 मनाया जाता है. इस तरह के carryover रूप nonexchanged प्रजातियों प्रकट होता है और विश्लेषण रन के बीच रिक्त HPLC ढाल रन से समाप्त किया जा सकता है. स्पष्ट है EX1 विनिमय शासन के लिए कई कारण हैं. 1) denaturants EX1 की उपस्थिति में सेमी प्रयोगों में अक्सर 29 मनाया जाता है. 2) सहज या प्रेरित, प्रतिवर्ती या अपरिवर्तनीय नियंत्रण रेखाअल या प्रोटीन का खुलासा वैश्विक EX1 व्यवहार 7,30,31 का कारण बनता है. 3) जैसे सब्सट्रेट कारोबार की वजह से सेमी की तुलना में धीमी गति से कर रहे हैं कि गठनात्मक बदलाव, एटीपी hydrolysis के कारण EX1 विनिमय शासन (चित्रा 7A) 22 जैसी bimodal आइसोटोप वितरण. 4) पल्स लेबलिंग प्रयोगों में ligand प्रेरित धीमी गठनात्मक बदलाव भी एक EX1 की तरह हस्ताक्षर (चित्रा 7B) 22 दिखा रहे हैं.

प्राप्त आंकड़ों की व्याख्या सेमी एमएस एक ऐसी चुनौती है लेकिन यह भी शक्तिशाली तकनीक है जो बनाता है अंततः है. प्रोटीन गतिशीलता का एक व्यापक ज्ञान प्रोटीन की गतिशीलता का एक यंत्रवत मॉडल को मनाया संरक्षण / deprotection पैटर्न से सभी तरह से प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. बहरहाल, उत्पादन उच्च गुणवत्ता सेमी एमएस डेटा अपेक्षाकृत कम समय के भीतर किया और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है किया जा सकता है. डेटा की व्याख्या स्पष्ट रूप से प्रोटीन निवेश की संरचना पर कोई अतिरिक्त जानकारी से लाभigated. दूसरी ओर, सेमी एमएस संरचना निर्धारण के लिए क्रिस्टलीकरण की सुविधा के लिए हटा दिया जाना पड़ सकता है, जो एक प्रोटीन के कुछ हिस्सों लचीला कर रहे हैं, जो संकेत कर सकते हैं.

सेमी एमएस बहुत मास स्पेक्ट्रोमेट्री और क्रोमैटोग्राफी में नवाचारों से लाभ है कि एक विधि है. सेमी एमएस में हाल ही में एक अग्रिम आगे इस तकनीक 32 के उपयोग broadens कि झिल्ली प्रोटीन के विश्लेषण के लिए लिपिड nanodiscs का इस्तेमाल होता है. इसके अलावा इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण हदबंदी (ETD) और इलेक्ट्रॉन कब्जा हदबंदी (ईसीडी) का उपयोग यह एक एमिनो एसिड 11,12 33 के स्तर को शामिल किया ड्यूटरान का संकल्प बढ़ जाती है के रूप में सेमी एमएस के लिए मजबूत क्षमता दिखा.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए एम. Boysen धन्यवाद. इस परियोजना (: CellNetworks EXC 81/1 उत्कृष्टता के SFB638 और एमए एम पी एम को 1278/4-1, और क्लस्टर) ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा वित्त पोषित किया गया. एम पी एम उत्कृष्टता के क्लस्टर के अन्वेषक है: CellNetworks.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
maXis QTOF Bruker
nanoAcquity UPLC Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator Valco #EPC6W
Injection valve (manual) Rheodyne #7725
Poros AL20 media Applied Biosystems #1-6029-06
Poros R2 Applied Biosystems #1-1118-02
Pepsin Sigma #P6887 use fresh pepsin
Microbore (1 mm) IDEX #C-128
Microbore (2 mm) IDEX #C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column Waters Corp. #186002876
Thermomixer Eppendorf #5355000.011
Tubing (various diameters) IDEX
Fittings IDEX #PK-110 with PK-100

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References

  1. Saibil, H. R. Conformational changes studied by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).
  2. Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
  3. Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).
  6. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  7. Rist, W., Jørgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange. The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).
  8. Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).
  9. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
  10. Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins. Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).
  11. Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., Jørgensen, T. J. D. Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).
  12. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements. J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).
  13. Yamada, N., Suzuki, E. -I., Hirayama, K. Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).
  14. Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry. Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).
  15. Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange. Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).
  16. Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).
  17. Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry. Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).
  18. Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry. J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).
  19. Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry. Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).
  20. Lanman, J., Lam, T. T., et al. Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry. J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).
  21. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  22. Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine. EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).
  23. Lee, C. -T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1. EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).
  24. Lou, X., Kirchner, M., et al. Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments. Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).
  25. Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon. Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).
  26. Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).
  27. Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).
  28. Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses. Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).
  29. Deng, Y., Smith, D. L. Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates. Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).
  30. Wales, T. E., Engen, J. R. Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale. J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).
  31. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator. J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).
  32. Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  33. Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).

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रसायन विज्ञान अंक 81 आणविक संरक्षिकाओं मास स्पेक्ट्रोमीटर अमीनो एसिड पेप्टाइड्स प्रोटीन एंजाइमों Coenzymes प्रोटीन गतिशीलता गठनात्मक परिवर्तन allostery प्रोटीन तह माध्यमिक संरचना मास स्पेक्ट्रोमेट्री
हाइड्रोजन विनिमय मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग प्रोटीन गतिशीलता का विश्लेषण करना
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Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing… More

Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (81), e50839, doi:10.3791/50839 (2013).

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