Summary
Protein yapı ve dinamikleri protein yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi anlamak için anahtardır. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte hidrojen alış veriş proteinlerin konformasyonel dinamiklerini incelemek ve temas arayüzler ve allosterik etkileri de dahil olmak üzere protein-ligand ve protein-protein etkileşimleri, karakterize için çok yönlü bir yöntemdir.
Abstract
Bütün hücresel süreçleri proteinlerin işlevselliğine bağlıdır. Verilen bir proteinin işlevselliğini eşsiz amino asit dizisinin doğrudan bir sonucu olmasına rağmen, bu sadece bir tek tanımlanmış üç boyutlu bir düzenleme ya da daha yaygın da birbirine konformasyonlarının bir topluluk olarak içine polipeptid zincirinin katlanması ile gerçekleştirilir. Protein yapısında ve fonksiyonunda arasındaki bağlantıyı araştıran proteinlerin görevleri onların büyük çeşitliliği yerine edebiliyoruz nasıl anlaşılması için elzemdir. Fonksiyonel döngüsü boyunca ilerlerken, bir protein maruz yapısal değişiklikleri incelemek için bir olanak, hidrojen-1 yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HX-MS) ile kombinasyon halinde H / 2, H-değişimidir. HX-MS örneğin kristalografisiyle elde edilen yapısal bilgilere yeni bir boyut ekler çok yönlü ve sağlam bir yöntemdir. Bu küçük mol bağlayıcı, katlama ve açılımı proteini incelemek için kullanılırecule ligandlar, protein-protein etkileşimleri, enzim katalizi ile bağlantılı konformasyonel değişiklikleri ve allostery. Protein miktarı çok sınırlıdır ya da proteinin kristalizasyon mümkün değildir Buna ek olarak, HX-MS sıklıkla kullanılmaktadır. Burada HX-MS ile protein dinamiğini çalışmak için genel bir protokol sağlar ve nasıl bir kompleks içinde iki proteinin etkileşim arayüz ortaya çıkarmak için bir örnek olarak tarif eder.
Introduction
Proteinler ve protein komplekslerinin kristal yapılarının sayısı son yıllarda hızla artmıştır. Bunlar, bu proteinlerin yapısal organizasyon çok değerli anlık mevcut ve yapı-fonksiyon analizi için bir temel sağlar. Ancak, proteinlerin ve bunların fonksiyonları için gerekli olan yapısal değişiklikler, dinamikleri, nadiren X-ışını kristalografisi ile ortaya çıkar. Cryo-elektronmikroskop, diğer taraftan, farklı yapıda protein ve protein kompleksleri yakalamak mümkün ama genellikle ikincil yapı seviye 1 şekilsel değişiklikleri aşağı çözemez. Atomik ayrıntıları, çözelti içinde proteinlerin konformasyonel dinamiği sadece NMR ile çözülebilir, ancak bu yöntem halen göreceli olarak küçük boyutlarda (genellikle ≤ 30 kDa) proteinlere sınırlı ile deneyler engellemektedir proteinlerin yüksek konsantrasyonlarda (≥ 100 uM), ihtiyacı var oligomerizasyon ya da toplama eğilimli proteinler 2. Bir yöntem, kiyüksek çözünürlüklü X-ışını kristalografisi ve kriyo-elektronmikroskop arasında olan ve köprü edebilmektedir protein boyut veya konsantrasyonu ile sınırlı değildir amid hidrojen-1 kütle spektrometrisi (MS) ile bir arada H / 2 H-değişim (HX) 'dir. Son yıllarda bu yöntem, protein dinamiği, protein katlanmasına, protein stabilitesi ve bu şekilsel değişikliklere 3-5 analizi için değerli bir analitik araç geliştirmiştir. Bu yöntemin moleküler temeli protein D 2 O çözeltisi yerleştirildiği zaman, döteryum atomları ile yer değiştirmeye doyurmaya proteinlerde omurga amid hidrojenlerin arasında kararsız doğasıdır. , Zaman içinde protein kütlesindeki artış, daha sonra yüksek çözünürlüklü MS ile ölçülür.
Kısa peptitler yapısal olmayan sadece sıcaklık, katalizör konsantrasyonuna bağlı HX (OH - Şekil 3, 3 H + O, yani pH) ve endüktif, kedi nedeniyle komşu artıkların amino asit yan zincirlerialytic ve sterik etkiler. Iç kimyasal kuru k kanal üzerindeki bu etkiler zarif Bai et al. 6 ile nicelleştirilmiştir edilmiş ve bir program pH ve sıcaklığa bağlı olarak bir polipeptid içinde her bir amino asit için k kanal hesaplar (izniyle Z. Zhang) mevcuttur. Nötr pH ve ortam sıcaklıklarında k ch 10 1 -10 saniye 3 -1 sırasına göre olan. Sıkı bir şekilde katlanmış proteinin iç iyonları kapandı - proteinlerinde HX temel olarak ikincil yapı içinde hidrojen bağı ve OH sulu sınırlı erişimi nedeniyle düşük derecede daha düşük büyüklükte 2-9 emir olabilir. Doğal protein HX bu nedenle kısmen ya da küresel açılımı, kimyasal değişimi ve denkleme göre yerel durumuna yeniden katlama etkisi altına (1) ve k obs açılış hızı k op, kapatma hızı k cl ve içsel kimyasal değişimi bağlıdır gözlenen kur rate k ch denkleme göre (2).
Yerli hal koşullarında k op k ch çok daha küçüktür ve paydada ihmal edilebilir. EX1 ve EX2 denilen iki uç döviz rejimleri vardır. K cl k kanal (EX1) daha küçük ise, gözlenen oranı açma hızına hemen hemen eşit olduğunu ve HX, bir yapı elemanının açılımı hemen gözlem sağlar. , Yapısal elemanın açılması üzerine bir kerede amid proton değişimi, izotop tepe 7 bir bimodal dağılım ile MS kolayca gözlemlenebilir böyle bir değişim rejimi,. K cl k ch çok daha büyük olduğu takdirde orantı sabit katlama açılımı dengesinin eşittir burada, (EX2) gözlenen oranı k ch ile orantılıdır sabiti K u = k op cl. Izotopik dağılımı yaklaşık olarak aynı kalırken, bu koşullar altında, bir çok açılış ve kapanış etkinlik ortalama kütlesi tedrici bir artışa yol açan, döteronların seyahati amid proton değişim önce gereklidir. EX2 rejimi ΔG u açılımı serbest enerji belirlenmesini ve bir yapı elemanının bu nedenle stabilitesini sağlar. Yerli devlet koşul altında EX2 rejimi en yaygın olanıdır. PH ve kaotropik ajanların eklenmesi artış EX1 için değişim mekanizmasını değiştirebilir. Bu nedenle, HX-MS termodinamiği keşfetmek hem de protein katlanma ve yapısal değişikliklerin kinetik parametreler için kullanılabilir.
HX yukarıda belirtildiği gibi doğal olarak pH ve sıcaklığa bağlıdır ve omurga amid grubu bir solvent tamamen açık proton değişim yarılanma ömrü> fizyolojik pH'da 5-400 ms (pH 7.6) ve 30 ° C, fakat 10 dakika arasında olduğu bir pH 2,9> 2 saat ortalama ve 0 ° ile 15 saat(Ca bir yarı ömür. 1-2 dakika ile alışverişi bir polipeptidin, ilk omurga amid bağının proton hariç) C. Bu tür değiş tokuş koşulları altında, yavaş dışarı dahil döteronların içerdiği tüm bilgileri kaybetme ile, bu koşullar altında aktif olan proteazlar (örneğin, pepsin) kullanılarak örnek sindirimi mümkündür. Yavaş alışverişi koşullar altında peptik sindirim tanıtılmasından bu yana, tam uzunlukta proteinlerin genel HX kinetik değil, sadece analiz edilebilir ama HX belirli bölgelerde 8,9 lokalize olabilir. Uzamsal çözünme anda 10-30 kalıntıları arasındaki genel olarak üretilen peptik parçalarının, büyüklüğü ile sınırlıdır. Bununla birlikte, pepsin ile bölünmesi nedeniyle spesifik olmayan doğası oluşturulan üst üste binen parçaları, uzamsal çözünürlük bir artışa neden olabilir. Buna ek olarak, çeşitli başka proteazlar, söndürme koşullar altında, ancak, daha az verimli 10 pepsin daha aktif olduğu bulunmuştur. Dahası increauzamsal çözünürlük se gibi elektron yakalama ayrışma (ECD), elektron transfer ayrılma (ETD) ve kızıl ötesi multiphoton ayrılma (IRMPD) 11-13 gibi döteryumlanma desen korunmuş yöntemler ile, gaz fazında peptitlerin parçalanması ile ulaşılabilir. Bu teknikler nedeniyle çarpışma kaynaklı ayrılma (CID) tarafından görülmektedir intramoleküler proton göçü ("karıştırma"), en yaygın olarak kullanılan parçalama tekniği bir uzamsal çözünürlük kaybını önler. Ancak, bu yöntemler her bir peptit için optimizasyon ve yine bu nedenle oldukça zordur.
HX-MS viral kapsid montaj 14-17 dahil olmak üzere protein-ligand ve protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için kullanılmıştır. Protein açılımı ve sıcaklık kaynaklı konformasyonel değişiklikler 7,18,19 incelenmiştir hem de yeniden katlama. Fosforilasyonu ve tek bir amino asit mutasyon-ilişkili şekilsel değişiklikleri 16,20 ve nükleotidlerinide kaynaklı değişimler 21,22 analiz edilmiştir. Bu nedenle, bu yöntem derleme ve moleküler makineleri dinamiklerini analiz etmek için ideal uygun görünüyor. Kimin mekanizması büyük genel ilgi çekici biri aday, Hsp90 şaperon karmaşıktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Tamponlar hazırlanması ve Protein Örnekleri
- H 2 O tampon hazırlayın. Kullanım Hsp90 standart tampon (40 mM HEPES / KOH, pH 7.5, 50 mM KCI, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol) H 2 olarak O tamponu.
Not: Numune analizinden önce diyaliz edilmiştir ise H, 2 O tampon olarak diyaliz tampon kullanın. Bu, D 2 O tampon, sadece hidrojen izotop H 2 O tampon farklıdır esastır. NH4 gibi uçucu tampon CO 3 ya da NH 4-asetat ya da tampon bileşenleri uygun değildir! - Bir vakum konsantratör kullanılarak Hsp90 standart tampon maddesi liyofilizasyon ile D 2 O tamponu hazırlayın. H 2 O tam buharlaştırılmasından sonra, başlangıç toplam hacmi (örneğin 1 850 ul D 2 O eklenmesini gerektiren% 15 gliserol ile tampon ml) ulaşmak için tüp saf D 2 O ekleyin. Tamponun tam buharlaşma tekrar ve tampon / tuz com yeniden çözünmesineD 2 O 2x batıklar.
- (0.4 M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 pH 2,2) söndürme tampon hazırlayın.
Not: 4 M guanidin hidroklorür ve 0.5 M Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP-HCI) ilave edilebilir çok kararlı proteinlerin peptik sindiriminin verimliliğini artırmak için. - % 100 kontrol numunesi (6 M guanidin hidroklorid, D 2 O) hazırlayın. Tamamen örnek H 2 O buharlaşır ve% 10 gliserol ile ilk toplam hacmi (örneğin, 100 ul numune ulaşmak için tüp D 2 O ilave edilmesini gerektirebilir eklemek 6 M. bir son konsantrasyon elde etmek üzere bir Hsp90 kana guanidin hidroklorid ekleyin 90 ul D 2 O). Tamponun tam buharlaşma tekrar edin ve D 2 O'da tampon / tuz bileşenleri yeniden çözünmesine
Not: Örnek 20-100 pmol her bir enjeksiyon için gereklidir. HX-MS deneyleri her gün için% 100 kontrol için yeterli örnek hazırlayın. - 5 ul Hsp90 standart tampon içinde 50 pmol Hsp90 hazırlayın.
Not: Örnek 20-100 pmol bir miktarı ham her veri noktası için gereklidir. Reaksiyonda numunenin hacmi ideal olarak 1-5 ul. Bu gereksinimleri uygun konsantrasyonu ayarlayın. Herhangi bir tampon, sürece deterjan ya da uçucu bileşenler içermez olarak kullanılabilir.
2. Aldehite üzerinde Hareketsizlestirilmis Pepsin hazırlanması Boncuk Aktif
- 2 ml 50 mM sodyum sitrat (pH 5) içinde 80 mg taze pepsin çözülür.
- , Sodyum siyanoborohidrit, 20 mg çözülür 1 ml 2 M Na 2 SO 4 bakım (çok toksik!) Ile ele almak ve pepsin çözeltisine ekleyin.
- Yavaşça (örneğin, tavan çalkalayıcı) çalkalanarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin karışımı.
- Karışıma hareketsiz aldehid grupları ile 600 mg boncuk ilave edin ve oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca inkübe edin.
- 2 M Na 2 2.2 ml ekleyin SO100 ul alikolar içinde 4 (pH 5) bir saat boyunca her 3 dakika yavaşça pepsin dışarı tuzuna. Yavaşça oda sıcaklığında bir havai çalkalayıcıda eklemeler arasındaki örnek karıştırın.
- Bir üst bir çalkalayıcı içinde 14-16 saat / gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin pepsin boncuklar.
- 2 saat boyunca oda sıcaklığında 1 ml 1 M etanolamin ve inkübasyon ekleyerek reaksiyonu söndürün.
- , 500 rpm'de bir 50 ml Falcon tüpüne boncuk aşağı Spin süpernatantı atmak ve% 0.1 formik asit içinde yeniden süspanse boncuklar. Bu adım 2x tekrarlayın. Son santrifüj aşamasından sonra, süpernatan ve boncuk tahmini ses atın. % 0.1 'lik formik asidin eşdeğer bir hacim ilave edin ve 4 ° C'de saklayın
3. Amid Hidrojen-değişimi için Kolonların hazırlanması
- Sütun bindirme için 1 mm'lik bir iç çapa sahip ve pepsin sütunlar için 2 mm sütun kullanarak koruma.
- Bekçi kolonunun bir tarafını sökün ve filtreyi kaldırmak. Sıkıca funn ambalaj vidaSütunun açık ucu üzerine el. Sütunun alt çıkış için boş bir şırınga (5 mi) takmak için bir 1/16 inç ve boru adaptörü kullanarak. Bekçi sütun gaz geçirmez bunu düzeltmek için emin olun.
- Huni üstünde boncuk harç madde bir kaç damla uygulanır. Koruma sütuna huniden bulamacı emmek için şırınga pistonu çekin. Huni üzerine daha bulamaç boncuk malzemesi uygulayın ve koruma sütunu tamamen boncuk malzeme ile dolana kadar işlemi devam edin. Huni çıkarın ve açık ucuna filtre ve filtre halkası yerleştirin. Sıkıca koruma kolonu üzerine sütun kapağı vida ve diğer taraftan şırınga çıkarın. Sütun malzeme kurumasını önlemek için fişler ile koruma sütunların iki ucunu kapatın.
4. Hidrojen Borsası Kütle Spektrometre (HX-MS) için Sistemini Kurmak
- HPLC sistemi ile tuzak kolonu (Şekil 1) takın. Akış hızını ayarlayarak sütun dengelenmesiçözücü madde olarak% 0.1 formik asit ile 0.4 ml / dk bir pompa. Henüz pepsin sütunu ne analitik kolon bağlamayın.
- Kütle spektrometresi kalibre ve kütle spektrometresi kaynağına HPLC çıkış takılabilir.
5. Exchange Dynamic Range Belirlenmesi
- Aşırı saf Çözücü A (su içinde% 0.1 formik asit) ve ultra saf solvent B (asetonitril içinde% 0.1 formik asit) hazırlanması; hazır karışık solventler ticari olarak mevcuttur. HPLC pompaları temizleyin. Kısa bir tuz giderme adımından sonra oluşan basamaklı bir derece ile bir program seçerek kromatografisi ile kontrol yazılımı kütle spektrometresi yöntemleri ayarlayın. Tam boy için Hsp90% 5 solvent A/95% çözücüye% 90 solvent A/10% çözücü B'den elüt edilmesi için desalt / yükten 6-yollu vana ve oluşan basamaklı bir derece geçiş, ardından 1-2 dakika bir tuzunu giderme basamağını kullanımı B. Enjeksiyon öncesinde / YÜKLENİYOR pozisyon desalt YÜKLEMEY için enjeksiyon valfi ve 6-yollu vana ayarlayın.
Not: Bu deney sırasında pepsin veya analitik kolon etmeyin. - 1-10 ul H2O tamponu içinde Hsp90 100-200 pmol hazırlayın ve 30 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe 100 ul kadar örnek hacmini getirmek ve zaman tanımlanmış bir süre (örneğin 10 sn, 100 sn, 1.000 sn) için tam olarak kuluçkaya sıcaklık ayarlanır D 2 O tampon ekleyin. 100 ul söndürme tamponunu ekleyin ve aşağı yukarı pipetleme karıştırın. Bir Hamilton şırınga ile enjeksiyon valfının enjeksiyon portuna 200 ul numune enjekte edilir. Kromatografi programını başlatın ve INJECT pozisyona enjeksiyon valfi açın. 2 dk eluteye Desalt / YÜKLEMENİN den 6-yollu vana açıldıktan sonra. En az üç zaman noktaları için bu işlemi tekrarlayın.
- Adımı tekrar 5.2 ama önceden 30 ° C de 10 dakika boyunca kuluçka için Hsp90 örnek Sti1 2-3x aşırı eklemek
- Kütle spektrometrisi yazılım spektrumlarının deconvolution ile tam boyda bir protein kütleleri belirler. Incorporat sayısını hesaplamakHer bir çalışma (örneğin 10 saniye, 100 saniye, 1000 saniye sonra) gözlenen kütle ile tam uzunlukta HSP90'ın molekül ağırlığı karşılaştırarak döteronlar ed.
- Ve yokluğunda bir süre (x-ekseni) karşı Sti1 (y-ekseni) varlığında Hsp90 için dahil döteronlar çizilir. Her iki eğri arasındaki farkın maksimum olan bir dinamik aralık zaman noktasını belirler. Hsp90-Sti1 arayüzü ve peptid düzeyinde dinamiklerini tanımlamak zaman D 2 O inkübasyon süresi için bu değeri kullanın.
6. MS / MS spektra kullanarak Peptik Peptitlerin Belirlenmesi
- Sisteme pepsin sütun ve analitik sütun bağlayın.
- Degrade türü ve kütle spektrometresi yöntemi seçerek kontrol yazılımı kromatografisi ve kütle spektrometresi için parametrelerini ayarlamak. Iyi kromatografik çözünürlük sağlamak için uzun degrade (örneğin fazla 90 dk) seçin. Kütle spektrometresi üzerinde MS / MS spektrumları etkinleştirir.
Not: İyi çözüHPLC ve yüksek kitle doğruluğu tion bu aşamada en yüksek önceliğe sahiptir. - 100 ul H 2 O tampon Hsp90 100-200 pmol hazırlayın. 100 ul söndürme tamponunu ekleyin ve aşağı yukarı pipetleme karıştırın. Bir Hamilton şırınga ile enjeksiyon valfının enjeksiyon portuna 200 ul numune enjekte edilir. Kromatografi programını başlatın ve INJECT pozisyona enjeksiyon valfi açın. 2 dk konumunu eluteye Desalt / YÜKLEMENİN den 6-yollu vana açıldıktan sonra.
Not: Birden fazla protein HX-MS (örneğin protein-protein etkileşimi arayüzler) analiz edilecek olması halinde, her bir protein için, peptidler ayrı ayrı belirlenmelidir. - Çıkan peptidler için bir veritabanı (yani Maskot) arayarak Hsp90 peptik peptidler belirlemek.
Not: amacı mümkün olduğu kadar çok peptik peptidleri belirlemek ve analiz saflaştırılmış protein ile yapılır gibi özel bir veritabanı kullanmak mümkündür. Örnek saflık olacak hdikkate alınması için ave. - MS / MS olmadan ve fiili HX deney için kullanılacak degrade ile bu adımı tekrarlayın. Hsp90 ve Sti1% 45 solvent A/55% çözücü B. 90% çözücü A/10% solvent B 10 dk degrade kullanmak için
Not: Gradients 5-15 dakika arasında son derece örnek karmaşıklığı ve HX sistem özelliklerine bağlıdır normalde. - 6.5 'de kullanılan gradyanı içinde 6.4 tanımlanan peptik peptidlerin tutma süreleri belirlemek 1 içeren bir liste oluşturmak.) Peptid dizisi, 2). Peptid şarj durumu ve 3). Tutma süresi. Bu deneyler HX sonra her bir peptid tanımlamak için kullanılacaktır.
Not: küçük m / z farklılıklar, aynı şarj durumuna ve aynı tutma süresi ile peptitler belirsizlik kaynağı olabilir farkında olun.
7. Protein-protein etkileşim Arayüz Tanıtımı
- Kontrol softwar de degrade ve kütle spektrometresi yöntemi kurmake. , 300-1,500 m / z arasında kitlelerin tespiti için optimize edilmiş bir kütle spektrometresi yöntemi yükleyin% 45 çözücü A/55% çözücü B'ye% 90 solvent A/10% solvent B 10 dk doğrusal bir degrade kullanmak rağmen çoğu peptidler 1,000 m / z altında olacaktır. YÜK pozisyonda, YÜKLEME / tuzsuzlaştırma Pozisyonu 6 yollu vana içine enjeksiyon vanasını ayarlayın. 0.4 ml / dk için yükleme pompasının akış hızını ayarlayın.
Not: Uzunluk ve degrade türü örnek bağımlı olan ve optimize edilmesi gerekebilir. Daha uzun geçişlerini kromatografisi çözünürlüğü artırmak ama arka değişimi nedeniyle proteinlerin içine döteronların birleşme azaltmak. Seçilen yöntem, tüm deneyler için karşılaştırılabilir aynı olması gerekir. - Değişime uğramamış bir referans için 100 ul H2O tamponu içinde HSP90'ın 20-100 pmol hazırlar. Aşağı iki kez 100 ul buz söndürme tampon, pipet yukarı ve ekleme ve HPLC enjeksiyon valfi içine numune enjekte. Hemen kromatografi program ve sw başlangıçINJECT pozisyona enjeksiyon valfi kaşıntı. 2 dk konumunu eluteye Desalt / YÜKLEMENİN den 6-yollu vana açıldıktan sonra. Hsp90 ve Sti1 bireysel ve proteinlerin karışımı için için bunu yapın.
- 1-5 ul bir hacimde HSP90'ın 20-100 pmol hazırlayın. (; Yapısal dinamikleri Not görmek için örneğin 30 saniye) 100 ul kadar örnek ses getirmek ve zaman belirli bir süre için tam olarak kuluçkaya sıcaklık ayarlanır D 2 O tampon ekleyin. Iki aşağı buz gibi soğuk tampon maddesi söndürme, pipet yukarı ve 100 ul eklenir ve hızlı bir şekilde HPLC enjeksiyon valfı içine 200 ul enjekte edilir. Hemen kromatografi programını başlatmak ve INJECT pozisyona enjeksiyon valfi açın. 2 dk konumunu eluteye Desalt / YÜKLEMENİN den 6-yollu vana açıldıktan sonra. Etkileşen protein yokluğunda her bir peptidin içine dahil edilmesini deuteron belirlemek için, her bir protein için yapın.
Not: confor dinamiklerini inceleyerek zamanDeğişiklikleri mational D 2 O tamponu içinde Hsp90 farklı inkübasyon süreleri ile deney tekrar. (Örneğin 10 sn, 30 sn, 100 sn, 300 sn, 1.000 sn, vb) logaritmik inkübasyon sürelerini seçerek geniş bir zaman ölçeği örtbas etmeye çalışın. D 2 O tampon ve örnek tampon hidrojen izotopu hariç tam olarak aynı olmalıdır. - % 100 kontrol örneğinde (20-100 pmol) eşit miktarda hazırlayın ve 100 ul kadar örnek hacmi getirmek için D 2 O tampon ekleyin. Iki aşağı buz gibi soğuk tampon maddesi söndürme, pipet yukarı ve 100 ul eklenir ve hızlı bir şekilde HPLC enjeksiyon valfı içine 200 ul enjekte edilir. Hemen kromatografi programını başlatmak ve INJECT pozisyona enjeksiyon valfi açın. 2 dk konumunu eluteye Desalt / YÜKLEMENİN den 6-yollu vana açıldıktan sonra.
- Etkileşim yüzeyi belirlemek için (Not) bağlı devlet dengeyi ve kuluçkaya Sti1 bir en az 2 kat fazla Hsp90 mixİstenen sıcaklıkta bir kompleks oluşumuna kadar dengededir. 100 ul kadar örnek ses getirmek ve bir süre (örneğin 30 saniye) belirli bir süre için tam olarak kuluçkaya sıcaklık ayarlanır D 2 O tampon ekleyin. Iki ve hızlı HPLC enjeksiyon valfi enjekte aşağı buz gibi soğuk söndürme tampon, pipet yukarı ve 100 ul ekleyin. 2 dk konumunu eluteye Desalt / YÜKLEMENİN den 6-yollu vana açıldıktan sonra. 20-100 Sti1 ve pmol ve Hsp90 aşan bu deneyi tekrarlayın.
Not: mutlak konsantrasyonları etkileşiminin ayrılma sabitine denge bağlıdır. İdeal olarak, D 2 O içine seyreltildikten sonra protein konsantrasyonu (ilişkili alt konsantre edilmiş proteinin>% 85 tekabül etmektedir), en az 10x K D olmalıdır aşan ilave edildi. - Uygun yazılım ile edinilen verileri analiz ve analiz her peptid bulmak için adım 6.5 belirlenen tutma kez kullanın. Hesaplamate değişime uğramamış proteinin (adım 7.2) ve HX deneyler (adım 7.3) için izotop dağılımının ağırlık merkezi.
Not: alışverişinde peptitler izotop desenleri peptid şarj durumu hakkında bilgi ve centroids kolay belirlenmesini sağlayan kütle spektrometresi, yüksek kütle doğruluğu, onların unexchanged benzerlerinden farklı görünseler de. - Hedef proteinin tek başına döteronların bağlanma partneri fazla olan bir birleşme karşılaştır. Bu bir elektronik tablo programı ile el ticari yazılım veya otomatik olarak yapılabilir. % 100 kontrol numunesi değerleri, her bir peptit için maksimum değişimini temsil ettiği ve O etiket nedeniyle geri değişimi için, deney esnasında kaybedilen D 2 miktarını belirlemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hsp90 maya ve Hsp90 hastabakıcı ailesinin üyesi bir moleküler şaperonudur. Karmaşık bir ATPaz döngüsü geçerek birçok protein müşterilerin geç katlanan adımları yardımcı olur. Verimli katlanır Hsp70 gelen müşterilerin transferi ve ortak hastabakıcı Sti1/Hop etkileşimi gerektirir. Hsp90 Sti1 doğrudan bağlanan ve HSP90'ın ATPaz en aktivitesinin inhibisyonu bağlama istemci kolaylaştırır. Sti1 ile Hsp90 etkileşimi son zamanlarda HX-MS 23 kullanılarak incelenmiştir. Burada, yukarıdaki protokole göre, temel deneylerin temsili sonuçlar sunulmaktadır.
Direkt protein-protein etkileşimi D 2 O ile dengede olan protein kompleksi etiketleme ve Hsp90.The edilen fark arsa yokluğunda ve varlığında Sti1 peptid spektrumlarının karşılaştırılması Şekil 5A'da (23 verileri) görülebilir ile test edilmiştir. Peptidler, N-terminalinde başlayan yukarıdan aşağıya doğru yönlendirilmiştir. Çoğunlukla peptidleriBu bölgeler Hsp90 ile etkileşim gösteren - TPR2a ve TPR2b Hsp90 (D-D Hsp90 + Hsp90 için negatif değerler) varlığında güçlü bir koruma gösterir. TPR2a in koruma kolayca HSP90'ın C-terminal MEEVD-motifi (Şekil 5B) temsil eden bir peptit ile kompleks içinde Sti1-TPR2a-TPR2b kristal yapısından rasyonalize edilebilir. Protein-protein etkileşimleri bu tür açık bir koruma zaman gözlenmemiştir. Sti1 mevcudiyetinde Hsp90, en koruma Sti1 (Şekiller 5C ve 5D) olarak lokalize olarak belirgin olup değildir. Tüm peptitler Sti1 varlığında deuteron dahil biraz daha fazla koruma gösterir. Proteinin bir bölge Sti1 varlığında, daha fazla esneklik gösterdiği gibi Sti1 global olarak HSP90 dengeler. Bu indirgenmiş Döteron kuruluş Sti1 veya yapısı üzerinde allosterik etkileri ile doğrudan etkileşim kaynaklanıyorsa Biz ancak, ayırt edemezHSP90'ın. Elde edilen bilgiler bir kaç peptidler (NBD örneğin peptit 43-62) için varsayılan etkileşim siteyi azaltır. Bu tür çapraz bağlama gibi ek deneyler genellikle HX-MS 23 sonra bağlanma siteleri doğrulamak için kullanılır. Hsp90-Sti1 kompleksi ölçerken notun, Hsp90 sırası kapsama azalır. Sti1 3.5 kat fazla ilave edildi yana analizinde peptidlerin teorik toplam miktarı, tek başına bir Hsp90 ile dört kat daha yüksekti. Bu, analiz sırasında Hsp90 peptidler gölgede ya da üst üste Sti1 peptidlerin riskini artırır. Yüksek sıra kapsama iyi kromatografik ayırma için optimize etmek için en umut verici yaklaşım gibi görünüyor.
Farklı protein bölgelerinin dinamiklerini incelemek için bir olanak, sürekli etiketleme HX-MS kullanılmasıdır. O zaman farklı dönemler için D 2 O dengelenmiş protein örnek inkübasyon içerir ve bu nedenle olanak istikrarı hakkında tahminlerbireysel protein kesimleri. Şekil 6, varlığı ve Sti1 bir 3.5-kat fazla yokluğunda HSP90'ın NBD gelen peptit 43-62 arasında spektrumunu göstermektedir. Kuluçka süreleri geniş bir zaman pencere üzerinde iyi kapsama almak için bir logaritmik ölçek (10 sn, 100 sn ve 1.000 sn) seçilmiştir. Peptit spektrumu uzun inkübasyon süreleri için artar protein içine döteryum bir zaman bağımlı birleşme gösterir. Peptid için 43-62 değişimi EX2 mekanizmasını k int << k cl izler. Koruma derecesi en uzun bir zaman noktasında kısa bir kuluçkalama süresinde ve hemen hemen benzer bir değişim oranında önemli farklılık gösteren, kuluçka süresi boyunca değişir. Bu düşük bir derece istikrar veya sık ayrışma ve tekrar birleşme ile dinamik etkileşimlerin bir bölgesini göstermektedir. Gözlenen koruma peptit veya amit etkisi proton genel bir düşük kur nedeniyle ya bir ya da iki atanabilirSti1 varlığında daha yavaş değişim spesifik amit proton. Hsp90 kristal yapısı bir açık döngü yerine α-helisleri ya da β-tabakalar gibi normal bir ikincil yapı olarak bu bölgeyi ortaya koyduğu gibi, bu durumda, ikinci çok daha muhtemeldir.
Bu geri değişim gözlenen etkilerinin% 100 kontrol için bir kez daha belirgin normalize olacağını ima gösterilen verilerden çıkartılmaktadır olmamıştır belirtmek önemlidir.
Şekil 1. HX-MS için HPLC kurulum. Bir HX-MS a) Tipik yapılandırma kurmak. Farklı renkli alanlar, farklı sıcaklıklarda muhafaza bölümleri temsil eder. Numune, enjeksiyon valfi (YÜK modunda, mavi) ve numune döngüsü içine enjekte edilmiş ve içine vana açıldıktan sonra "modunda enjekte" (siyah) pompalandı6-yollu vana içine pepsin sütun. Pepsin kolon pepsin enzimatik aktiviteyi artırmak için, 10 ° C 'de yaklaşık muhafaza edilir. 6-portlu vana iki mod, "Yükleme / Tuzsuzlaştırma Mode" ve "sıyrılması Mode" (b bakınız). Numunenin tuz giderme sonra, peptidler kromatografik analitik bir ters-fazlı sütun üzerinde bir asetonitril gradyanı ile ayrılır. Peptitler daha sonra bir ESI-kaynağı ile kütle spektrometreye püskürtülür. 6-bağlantı vana b) Modu. Doğrudan HX sonra 6-portlu vana tuzak "Yükleme / Tuzsuzlaştırma Pozisyonu" tuzak sütununda peptik peptidler bulunmaktadır. Bu kütle spektrometrisi engelleyebilir reaksiyon tampon herhangi tuzlar veya bileşiklerin bertaraf edilmesi için en fazla üç dakika devam edilir. Bundan sonra "sıyrılması Mode" içine 6-portlu vana anahtarları gradyan pompası ve analitik sütun arasındaki akış yoluna yüklenen tuzak sütunu koyarak. Sıkışıp peptik peptitler artık tuzak Colu eluteninmn ve asetonitril içinde% 0.1 formik acid/0.1% formik asit gradyanı içinde ayrılmış olur.
Şekil 2. HX bir deney düzeni akış. 1) Hedef protein deterjansız arıtıldı ve standart tamponlar temin edilir. 2) protein enzimatik pepsin ile sindirilir ve peptik peptidler belirlenmiştir ve tandem kütle spektrometrisi (MS / MS) ile karakterize edilir. Sadece dizisi alındıktan sonra, mümkün olduğunca HX-MS başarıyla yapılabilir gibi birçok peptidler devlet ve saklama şarj süresi. 3) Deney koşulları gibi özel koşullar altında (ligand / kimyasal bileşik ya da sıcaklık ya da pH kayması ilavesi altında proteininin inkübe olarak ayarlanır. 4) HX numunenin seyreltilmesi ile gerçekleştirilir D 2 O tamponu içinde 1:10 ya da daha fazla . D 2 O tampon avo için örnek tampon maddesi ile aynı olması gerekirid tampon etkiler. Daha sonra numune zaman belirli bir süre için tam inkübe edilir. 5) inkübe edildikten sonra, reaksiyon söndürülmüş ve HPLC-MS sistemine enjekte edilir. Numune, enzimatik klevaj edilir ve sonuçta elde edilen peptitler, peptik bir organik çözücü gradyanı içinde ayrıldı ve kütle spektrometresi içine enjekte edilir. Elde edilen peptid spektrumları 6) analizi. Peptid spektrumları sentroidler farklı reaksiyon koşulları altında karşılaştırılmıştır. Bu HX analiz programı tarafından otomatik olarak uygun bir yazılım veya el ile yapılabilir.
Şekil 3,. Hidrojen değişimi mekanizması. Hidrojen değişimi reaksiyonu bir baz ya da asit ile katalize edilebilir ve bu nedenle, amid bağı 6 komşu tortuların yan zincirlerinin bağlı olarak, pH 2.5 ile 3 arasında bir minimal değişim oranı ile pH bağımlıdır. Duhalka tuzsuzlaştırma ve H 2 yapılır peptidler kromatografik ayrılması, O içeren solventler, dahil döteronlar aynı mekanizma (back "değişim") göre protonlar için geri değiştirilir. Bu yüzden, sistem ve kullanılan çözücülerin optimizasyonu dahil döteronların kaybını azaltmak için çok önemlidir.
Şekil 4. HX-MS Prensibi. Amid omurgasının korunmasında protein sonuçlarına bir ligandın bağlanması çevreleyen çözücüden bağlanma sitesinde hidrojen. Bu etkilenen proton değişim oranları azalır ve döteronların birleşme azalır. Proton ve DEUTERON arasındaki ağırlık farkı 1 Da olduğu için, proteinin bu bölgeden türetilmiş peptitler, kütle spektrometrisi, daha düşük m / z gösterecektir. Deneylerin peptid spektrumları karşılaştırmave yokluğunda bağlanma partnerinin varlığında, m / z değerleri (koruyucu etkinlik) düşürmek için spektrumlarının sentroid kayması ortaya çıkaracaktır. Birleştirici ajanın ilave edilmesinden sonra belirgin bir koruma gösterirler bölgeler bağlayıcı siteler, potansiyel bulunmaktadır. Dizisi kapsamı ve bağlayıcı siteleri çakışan peptidler mevcudiyetine bağlı birkaç amino asitlere kadar daralmış olabilir.
Şekil 5,. Hsp90 ve Sti1 etkileşimi. Hsp90 (23 verileri) yokluğunda Sti1 içine ortağı Hsp90 eksi Döteron birleşme bağlanma varlığında Sti1 içine Döteron esas bir, Fark arsa. b Karikatür TPR2a ve TPR2b (PDB kodu 3UQ3) içeren Sti1 bir fragmanının gösterimi HSP90'ın C-terminal MEEVD-motifi temsil eden bir peptit ile kompleks olarak. Karikatür Accor renkliDing belirtildiği gibi deuteron dahil korunmaktadır amid proton sayısı. c, ortak Sti1 bağlayıcı varlığında, HSP90'ın fark çizimi. Aynı sıcaklıkta HX, 30 ° C ve 30 sn 3.5 x fazla Sti1 ile 10 dakikalık bir ön kuluçka sonrasında gözlenen deuteron Hsp90 içine dahil edilmesi. Deney üç kez gerçekleştirilmiştir ve ortalamanın standart hatası, her peptit için gösterilmiştir. Küresel negatif değerler döteronların azaltılmış birleşme ve Sti1 varlığında HSP90'ın bu yüzden daha yüksek genel stabilite göstermektedir. Geri değişimi bu deneyde kabul edildi. D, maya Hsp90 (PDB kodu 2CG9 b) belirtildiği gibi Döteron dahil korunmaktadır amid proton sayısına göre renkli Karikatür temsilidir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 7. Bimodal distribut peptid spektrumları için örnekleriyon. E. içine, Deuteron kuruluş ve yokluğunda, ATP varlığında coli Hsp90 (Sayı 22 alınan verileri. Şekil 3). Peptit tortuları 192-206 ve Spectra 30 saniye, 5 dakika, 10 dakika ve D 2 O 30 dakika inkübasyon, ve% 100 kontrol (% 100 D) sonra, D 2 O (0% D) ile inkübasyondan önce gösterilmiştir . ATP (-ATP) yokluğunda tipik EX2 davranış değişimi görülmektedir. ATP varlığında (+ ATP), güçlü bir koruma, 30 saniye at ve proteinlerin iki popülasyonlarının gösteren, 5 dakika, 10 dakika ve izotopik tepe bimodal dağılımları, en görülmektedir, bir ATP bağlı duruma benzer nüfus ve ikinci bir benzer nükleotid özgür bir devlet. 30 dakika az olmaması ve ATP mevcudiyetinde arasında bir fark görülmektedir. Bimodal dağılım büyük olasılıkla bu protein segmentte daha fazla esneklik ATP hidroliz ve nükleotid içermeyen bir hal boyunca geçiş neden olur. Bu spektrumlar klasik EX1 değişimi regi benzeyebilirben. b, darbe-etiketleme HX deneylerde izotopik zirvelerinden Bimodlu dağılım. E. coli Hsp90 10-300 saniye boyunca ATP yokluğunda veya ATP varlığında kuluçkalandı ve daha sonra belirtildiği gibi D 2 O, 10 saniye boyunca darbe-işaretli (22, Şekil 4A'da alınan verileri) eklenmiştir. Bimodal dağılım daha iki molekül birlikte bulunan nüfusu, diğer daha döteronların için daha hızlı bir şekilde amit protonlarının bir göstermektedir. ATP yavaş alışverişi konformasyona alışverişi hızlı yavaş bir geçiş neden olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir protein için bir bağlanma ortağının etkileşim kaçınılmaz olarak bağlanma sitesinde solvent erişilebilirlik değişikliklere neden olur. Buna ek olarak, pek çok protein, gerçek bağlama arayüzü başka bölgeleri etkileyen bağlanması üzerine dinamik bir konformasyonal değişiklik geçirmektedir. HX-MS bu değişiklikleri izlemek için sağlam bir yöntem ve diğer yöntemler örtemez o zaman ölçekleri proteinlerin yapısal değişimleri ortaya bile yeteneğine sahiptir.
Başarıyla HX-MS gerçekleştirmek için üç puan önemlidir: 1), optimal sistem kurulum; örnek işleme 2) kesin yürütme ve 3) dikkatli veri analizi peptid spektrumları atama ve sonuçlarını yorumlama.
Sistem kurulumu
Kütle spektrometrisi peptidler içine dahil edilmesini deuteron tespit etmek için kullanıldığı için, numune hazırlanması ile ilgili aynı önlemler HX-MS için geçerlidir. Kütle spektrometrisi sho müdahale deterjanlar, tuzlar ve diğer bileşikleruld analizden önce önlenebilir veya kaldırılabilir. HX-MS büyük protein komplekslerinin analizini sağlar iken, yüksek karmaşıklık peptit ayrılması ve kütle spektrometresi kalitesinin yükseltilmesini talep ediyor. Kromatografik koşulların optimizasyonu kaliteli veri elde anahtarıdır. Bu da, yüksek kaliteli, organik çözücülerin seçimi, ters-faz malzemesi olarak gradyanlar ve çözücülerin optimizasyonu içerir. Organik çözücüler ile sütun yıkama arka plan sinyali azaltmak için deney ve gece boyunca arasında yapılabilir. Kütle spektrometrisi yöntemleri (300-1,200 m / z arasında) peptik peptidlerin tespit edilmesi için optimize edilmelidir. Farklı peptitler kaynaklanan kısmen örtüşen izotop pik kümeleri ayırt edilebilir, çünkü yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ölçüde veri analizi kolaylaştırır.
Numunelerinin işlenmesi, HX-MS için çok önemlidir. Genellikle eden tamponlar ve örnekler agrega ve Parti'yi kaldırmak için 13,000 rpm'de (mikrofüj) de 10 dakika boyunca santrifüjden geçirilmekteCLES. Buna ek olarak, çok sayıda satır sütun filtresi tıkanmasını önlemek için HPLC sistemine monte edilebilir. D Minor sapmalar 2 O kuluçka süreleri büyük etkileri olabilir. Çok esnek protein bölgeler için sadece birkaç saniyelik bir fark yok Döteron hiç Kuruluş ve tam döteryumlanma arasındaki fark yaratabilir. Protein dinamik hem de iç kur sıcaklığın bir fonksiyonu olduğu için, örnek tamponların ve inkübasyon ısısı sıkıca kontrol edilir. Bu, her zaman, her bir deney için adımların tekrar tam sırası avantajlıdır. Eğer doğru şekilde uygulanırsa iki deneyler arasındaki hata nispeten küçük olacaktır. Bugün, HX-MS için otomatik sistemleri ticari olarak temin edilebilir ve örnek işleme zorlukları azaltır.
Verilerin analizi
HX-MS ilgili en önemli verilerin analizi, peptid spektrumları, özellikle atama ve döteryumlanma seviyelerinin belirlenmesidir. ThHX-MS e çıkış peptid spektrumları büyük bir sayı içeren kromatografik gradyan elusyon profilidir. Operatörler görev protokolün adım 6'da MS / MS ile tespit edilen peptidler) bu spektrumları atamak etmektir. Spektrumları önemli ölçüde HX sonra yüksek m / z doğru kayması gibi bu biraz zor olabilir. Ayrıca spektrumları kısmi üstüste binen peptitlerin atama karmaşıklaştırabilir. Genellikle örtüşen peptitler çözebilirsiniz çünkü bu durumda yüksek kütle hassasiyeti ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometre kullanımı kapalı öder. Döteron birleşme farklılıklar peptid spektrumlarının centroids göre hesaplanır. Sentroidler tespit edilebilir: 1) el bir peptid yelpazenin her izotop zirve işaretleme ve bir elektronik tablo programı (örneğin Excel, Microsoft) içine yoğunluğu ve m / z değerleri aktarma ve merkezini hesaplayarak veya 2) atamak için tasarlanmış yazılım ile izotopik tepe belirlenmiş bir peptide ait ve hesaplamaksentroidler otomatik olarak (örneğin HDExaminer, Sierra Çözümleyici veya HeXicon 24,25).
HX-MS optimizasyonu
1) kromatografiye optimize (gradyan çözücüler, uzunluk / şekli, farklı bir ters fazlı malzeme için) ya da 2) enzimatik bölünme değişen: değerlendirilebilen peptidlerin sayısı çok düşük ise, deney optimize etmek için birçok olasılık vardır protein (alternatif bir proteaz, pepsin ile uzun / kısa inkübasyon süresi, söndürme tampon denatüre edici maddeler eklenmesi). Bu iki peptit havuz kendisi ya da HPLC ayırma değiştirebilir olarak iki parametre peptidlerin elüsyonu davranışını değiştirebilir. Hem optimizasyonu yaklaşımları peptidler recharacterize için ihtiyaç fiyata geliyor. Diğer proteazlar MS / MS ile tespit ve aşama 6.6 'da tarif edildiği gibi, özelliği olması gereken farklı peptitler) üretecektir. Kromatografi değişen koşullara peptid havuz ama tutma ti değiştirmezbireysel peptidlerin mes. Tutma süreleri sonra) aşama 6.5 'te olduğu gibi yeniden tespit edilmesi gerekir. Bu, daha yüksek bir tutma süreleri her zaman daha uzun bekleme sürelerinde de geri değişimi artar saptanabilir etiketin miktarı azalacak olduğu belirtilmelidir. % 100 kontrol verilerin Normalleşme değişimi ile başa çıkmak için en iyi yoldur. Yüksek geri değişimi dahil döteronların kaybı ve bu nedenle sinyal yol açar. Kuvvetle az geri değişimi miktarını azaltmak için tavsiye edilir. Farklı HX-MS kurulumları donanım, kullanılan tampon ve solvent bileşimine ve 26 kullanılan gradyanlar türüne bağlı olarak, geri değişimi birbirinden farklı oranlarına sahip olacağı unutulmamalıdır.
Veri Yorumlama
Verileri analiz ederken, izotop piklerin şiddeti dağılımı, değişim mekanizması işaretlere verebilir beri dikkatle değerlendirilmesi gerekir. Daha küçük bir kütleye sahip peptidler içindeğişime uğramamış numunenin izotopik tepe 2000 Da yoğunluklar monoisotope veya ilk izotop yüksek tepe daha yüksek yoğunlukları ile, genellikle asimetrik bir daha. EX2 değişim rejimi için, bu asimetrik yoğunluk dağılımı D 2 O, artan süre ve daha yüksek m / z ve yaklaşık% 50 ile izotopik küme artış (Şekil 7) 'nin genişliğine artan değişim ile Gauss-gibi olur. Giriş EX2 belirtildiği gibi, en yaygın doğal koşullar altında, HX-MS gözlenen ve değişim gözlenen oranı proteinin termodinamik stabilitesine bu nedenle sürekli K u ve açılımı denge ile orantılıdır. Bunun aksine, EX1 değişim rejimi için önemli ölçüde artar ve izotopik küme bimodal veya multimodal yoğunluk dağılımlarının genişlik dağılımı 25,27 (bakınız Şekil 7) görülmektedir. Bimodal izotop dağılımları her zaman iki veya daha fazla farklı molekül türü belirtmekAnalizde, potansiyel olarak ilginç olan. Ancak, tuzaklar iki türü vardır. İlk olarak, izotop küme iki farklı peptitlerden kaynaklanan tepe imal edilebilir. Bu benzer m / z ve aynı ücret ile peptitler için değişime uğramamış numunenin spektrumunu kontrol etmek için belirlenmelidir. Bu gibi peptidler, genellikle tutma süresi biraz farklıdır ve izotopik tepe yoğunluk dağılımı elüsyon zamanla değişir. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi, aynı peptide ait olmayan izotop pikler de m / z değerlerinin ondalık ile ayırt edilebilir. İkinci olarak, daha önceki bir HPLC-MS çalışmadan elde ertelenmiş 28 görülmektedir. Böyle taşınmasını olarak nonexchanged türleri görünür ve analiz çalışmalar arasında boş HPLC gradyan çalışan tarafından ortadan kaldırılabilir. Belirgin EX1 kur rejimi için pek çok nedeni vardır. 1) denatüranlar EX1 mevcudiyetinde HX deneylerde 29, sıklıkla gözlenir. 2) Spontan veya uyarılmış, geri dönüşümlü veya dönüşümsüz local veya proteinlerin çıkması küresel EX1 davranışı 7,30,31 neden olur. 3) örneğin tabaka ciro neden HX kıyasla yavaş Konformasyonal geçişler, ATP hidroliz neden EX1 kur rejimini (Şekil 7a) 22 benzeyen iki modlu dağılımlar izotop. 4) darbe-işaretli deneylerinde Ligand ile uyarılan yavaş konformasyonel geçişler de EX1 benzeri bir imza (Şekil 7b) 22 sergiler.
Elde edilen verilerin yorumlanması HX-MS böyle bir zorlu ama aynı zamanda güçlü bir tekniktir kılan sonunda olduğunu. Protein dinamiği Geniş bilgi protein dinamiği bir mekanik model gözlenen koruma / koruma bozma desen tüm yol almak için gereklidir. Bununla birlikte, üreten yüksek kaliteli HX-MS verileri nispeten kısa bir süre içinde yapılan ve son derece tekrarlanabilir olabilir. Verilerin yorumlanması açıkça protein yatırım yapısına herhangi bir ek bilgi yararlanırigated. Öte yandan, HX-MS yapı tayini için kristalleşmeyi sağlamak için kaldırılması gerekebilir, hangi bir proteinin parçaları esnek olan gösterebilir.
HX-MS ölçüde kütle spektrometresi ve kromatografi yenilikler ile kar bir yöntemdir. HX-MS yeni bir önceden başka, bu tekniğin 32 kullanımını genişletmektedir zar proteinlerinin analizi için lipid nanodiscs kullanılmasıdır. Ayrıca, elektron transfer ayrışma (ETD) ve elektron yakalama ayrışma (ECD) kullanımı da, tek bir amino asit 11,12 33 seviyesine dahil DEUTERON çözünürlüğünü arttırır olarak HX-MS için güçlü bir potansiyel göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz yazının yorumları için M. Boysen teşekkür ederim. Bu proje (: CellNetworks EXC 81/1 Mükemmellik SFB638 ve MA MPM 1278/4-1 ve Kümede) Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından finanse edildi. MPM Mükemmeliyet Kümesi araştırmacı: CellNetworks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| maXis QTOF | Bruker | ||
| nanoAcquity UPLC | Waters Corp. | ||
| Shimadzu 10AD-VP | Shimadzu | ||
| 6-port Valve EPC6W with microelectric actuator | Valco | #EPC6W | |
| Injection valve (manual) | Rheodyne | #7725 | |
| Poros AL20 media | Applied Biosystems | #1-6029-06 | |
| Poros R2 | Applied Biosystems | #1-1118-02 | |
| Pepsin | Sigma | #P6887 | use fresh pepsin |
| Microbore (1 mm) | IDEX | #C-128 | |
| Microbore (2 mm) | IDEX | #C-130B | |
| Acquity UPLC BEH C8 Column | Waters Corp. | #186002876 | |
| Thermomixer | Eppendorf | #5355000.011 | |
| Tubing (various diameters) | IDEX | ||
| Fittings | IDEX | #PK-110 with PK-100 |
References
- Saibil, H. R. Conformational changes studied by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
- Rist, W., Jørgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange. The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).
- Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).
- Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
- Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins. Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).
- Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., Jørgensen, T. J. D. Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements. J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).
- Yamada, N., Suzuki, E. -I., Hirayama, K. Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).
- Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry. Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).
- Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange. Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).
- Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).
- Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry. Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).
- Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry. J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).
- Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry. Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).
- Lanman, J., Lam, T. T., et al. Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry. J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).
- Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).
- Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine. EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).
- Lee, C. -T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1. EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).
- Lou, X., Kirchner, M., et al. Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments. Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).
- Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon. Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).
- Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).
- Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).
- Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses. Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).
- Deng, Y., Smith, D. L. Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates. Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale. J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).
- Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator. J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).
- Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).
- Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).
