Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם
Summary
במהלך השנים האחרונות, מבחני מבוססי תאים חיים כבר השתמשו בהצלחה כדי לזהות נוגדנים כנגד פני השטח ואנטיגנים קונפורמציה. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות זרימת cytometry תפוקה גבוהה המאפשר הניתוח של קבוצות גדולות של חולים. זיהוי של נוגדני רומן ישפר את האבחון וטיפול בהפרעות חיסונית בתיווך.
Abstract
במהלך השנים האחרונות, נוגדנים כנגד פני השטח וחלבונים המעורבים בקונפורמציה העצבית זוהו במחלות של מערכת העצבים המרכזית אוטואימונית בילדים ומבוגרים. נוגדנים אלה היו בשימוש כדי להדריך את האבחון וטיפול. מבחני מבוססי תאים שיפרו את זיהוי של נוגדנים בסרום חולה. הם מבוססים על הביטוי על פני השטח של מוח אנטיגנים על תאי אוקריוטים, אשר לאחר מכן מודגרת עם סרה מטופל מדוללת ואחריו נוגדנים משני fluorochrome-מצומדות. לאחר כביסה, נוגדנים משני מחייבים מנותחים לאחר מכן על ידי cytometry זרימה. הקבוצה שלנו פיתחה זרימת תפוקה גבוהה cytometry assay מבוסס תאים חיים כדי לזהות באופן מהימן נוגדנים כנגד קולטני הנוירוטרנסמיטר ספציפי. שיטת cytometry זרימה זו היא ישר קדימה, כמוני, יעיל, והשימוש במערכת סמפלר תפוקה גבוהה מאפשר למחזורי מטופל גדולים להיות assayed בקלות בפרק זמן קצר של זמן. בנוסף, זו המבוססת על תא כלומר ניתן להתאים בקלות לאיתור נוגדנים למטרות רבות ושונות אנטיגני, שניהם ממערכת העצבים המרכזית והפריפריה. גילוי סמנים ביולוגיים נוגדן רומן נוספים יאפשר אבחון מהיר ומדויק ולשפר את הטיפול בהפרעות חיסונית בתיווך.
Introduction
בשנים האחרונות, טפסים אוטואימונית של מערכת עצבים המרכזית מחלות (CNS) זוהו. הוכח כי מחלות אלה קשורים ומוגדרים על ידי הנוכחות של נוגדנים עצמיים. נוגדנים אלה נקשרים לקולטנים עצביים או חלבונים סינפטיים המעורבים ב1,2 העצבית. אנטיגנים שונים שכבר זוהו, כגון קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDAR) 3-5, חומצת B קולטן γ-aminobutyric (GABA-B) קולטן 6, α-אמינו-3-hydroxy-5-methyl-4- קולטן חומצת isoxazolepropionic (AMPA) 7, ערוץ אשלגן תלוי מתח (VGKC) חלבונים הקשורים: חלבון לאוצין עשיר מופעלת גליומה 1 (LGL-1) וקשורים contactin החלבון 2 (capsr2) קולטן 8,9, גלוטמט 5,10 , ודופאמין-2 קולטן (D2R) 11. בעבר, הפרעות אלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית (בעיקר בשם דלקת קרום המוח) היו לעתים קרובות לא מאובחנים ואינם מטופלים. סמנים ביולוגיים נוגדנים אלה רומן, למשלנוגדן NMDAR או נוגדן D2R, השתפר באופן משמעותי אבחנה ומודעות, ופתח אפשרויות טיפול בחולים. ואכן, טיפול מוקדם עם immunotherapies קשור בתוצאות משופרות 11,12.
שיטות מסורתיות לאיתור נוגדנים, כגון assay enzyme-linked immunosorbent (ELISA) וכתם מערבי שימשו לזיהוי של נוגדנים בסרום. עם זאת, הם לא בקלות יאפשר זיהוי של אפיטופים תאיים או משטח ו, ולא, עשוי לחשוף immunoreactivity כלפי epitope תאיים. יתר על כן, נוגדנים שנקשרים לתחום תאי של חלבונים חשובים המעורבים בהעברה עצבית עשויים להיות 2,3,7,13,14 פתוגניים. לכן, הפיתוח של מבחני מדויקים ורגישים כדי לגלות תא שטח רלוונטי או מטרות נוגדנים תאיים בחולים הוא בעל חשיבות עליונה. שיטת תקן זהב בתחום מתבססת על השימוש בתאים חיים, במה שמכונה "תא-baמבחני SED ". שיטה זו כרוכה בביטוי של אנטיגן על פני השטח של תאי יונקים (לרוב 293 תאים עובריים אנושיים בכליות (HEK293)) בצורה המקורית שלו על ידי transfection של וקטורים המכילים את רצף cDNA המלא של אנטיגן של עניין. לאחר מכן תאי nonpermeabilized בשידור חי מודגרת עם סרום מטופל מדולל ואחריו אימונוגלובולינים אנטי אנושיים fluorochrome מצומדות (איג) נוגדנים משני. העצמה או רמת הקרינה לאחר מכן זוהתה והיא קשורה לרמה של נוגדן מחייב. טכניקה זו היא ספציפית, אלא כאחד אנטיגן הוא ביטוי יתר בתאים. שימוש נרחב ביותר "לקריאה מתוך" כבר ניתוח מיקרוסקופיה confocal לאחר immunocytochemistry 4,5,8-10. עם זאת, cytometry זרימת מבחני מבוססי תאים שימשה בהצלחה לאיתור נוגדנים בחולים עם מחלות demyelinating 15-17. בפרט, ווטרס ואח'. 15 לעומת זיהוי של נוגדנים באמצעות מחבתאל של שיטות לזיהוי נוגדנים כוללים מבחני מבוססי תאים ואחריו במיקרוסקופ או cytometry זרימת מנתח, והוכיח cytometry זרימת assay מבוסס תאים להיות השיטה רגישה ביותר, מדויקת ואמינה. לכן, cytometry זרימת assay מבוסס תאים היא יתרון כפי שהיא כמוני, לא חוקר תלוי, ואינו כרוכים בשימוש בחומר רדיואקטיבי. זה גם נוח שכן היא מאפשרת מחזורי מטופל גדולים להיות מאושרים בפרק זמן קצר.
לאחרונה, יש לנו מותאם זרימת תפוקה גבוהה cytometry assay מבוסס תאים כדי לזהות נוגדני NMDAR ונוגדני D2R בחולים עם מחלות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית 11. הקבוצה שלנו לאחרונה זוהתה נוגדני NMDAR בסרה מטופל באמצעות cytometry זרימת assay מבוסס תאים. סרום הנוגדנים חיוביים NMDAR אלה נותחו בעבר באמצעות מיקרוסקופיה confocal ונמצא גם להיות חיובי 11. פרוטוקול זה מתאר cytometry זרימה assay מבוסס תאים לצורך זיהוי של גנוגדן onformation רגיש במערכת העצבים המרכזית בסרום חולה ניצול סמפלר תפוקה גבוהה אוטומטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר יישום רומן של cytometry זרימת assay מבוסס תאים חיים כדי לזהות נוגדני מיקוד חלבונים עצביים תא שטח ספציפיים באמצעות סמפלר תפוקה גבוהה. באמצעות טכניקה זו, אנו מדווחים כי תת קבוצה של חולים שנפגעו במחלות במערכת העצבים המרכזית אוטואימוניות יש נוגדנים בסרום על פני הש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה האוסטרלית הלאומית לבריאות והמחקר רפואי, קרן סטאר סיינטיפיק (אוסטרליה), תסמונת טורט האגודה (ארה"ב), הטרשת הנפוצה טריש קרן מחקר והטרשת הנפוצה אוסטרליה מחקר, קרן Petre (אוסטרליה), ל 'רבקה קרן קופר למחקר רפואית (אוסטרליה). אנו מודים לכל חולים ובני משפחה שסיפקו דגימות למחקר שלנו.
Materials
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
