Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека
Summary
За последние годы, живые клеточных анализов были успешно использованы для выявления антител против поверхностных и конформационных антигенов. Здесь мы опишем метод с использованием высокой пропускной проточной цитометрии позволяет анализ больших группах пациентов. Обнаружение новых антител улучшит диагностику и лечение расстройств иммуноопосредованных.
Abstract
За последние годы, антитела против поверхностных и конформационных белков, участвующих в синапсах были обнаружены в аутоиммунных заболеваний ЦНС у детей и взрослых. Эти антитела были использованы, чтобы направлять диагностику и лечение. Сотовые основе анализов улучшились обнаружение антител в сыворотке пациента. Они основаны на поверхностную экспрессию антигенов мозга на эукариотических клеток, которые затем инкубировали с разбавленной сывороткой пациента с последующим флуорохромом конъюгированные вторичные антитела. После промывки вторичное антитело связывания анализировали с помощью проточной цитометрии. Наша группа разработала поток высокой пропускной цитометрии живых клеток на основе анализа, чтобы надежно обнаружить антитела против специфических рецепторов нейромедиаторов. Этот метод проточной цитометрии является прямым, количественный, эффективной и использование системы отбора проб с высокой пропускной позволяет большие когорты пациентов, чтобы быть легко проанализированы в короткий промежуток времени. Кроме того, эта ячейка на основе каксказать можно легко адаптировать для выявления антител к различным антигенным целей, как из центральной нервной системы и периферии. Открывая дополнительные биомаркеров роман антител позволит быструю и точную диагностику и улучшить лечение нарушений иммуноопосредованных.
Introduction
За последние годы, аутоиммунные формы центральной нервной системы (ЦНС) заболеваний выявлено не было. Было показано, что эти заболевания связаны и определяется наличием аутоантител. Эти антитела связываются с нейронных рецепторов или синаптических белков, участвующих в нейротрансмиссии 1,2. Различные антигены были обнаружены, например, N-метил-D-аспартат рецепторов (NMDA-) 3-5, γ-аминомасляной кислоты рецептора ГАМК B (B) 6, рецептор α-амино-3-гидрокси-5-метил-4- изоксазолпропионовой кислоты (АМРА) рецептору 7, напряжения закрытого калиевых каналов (VGKC), связанные белки: лейцин-богатый глиома-активированный протеин 1 (LGL-1) и Contactin-ассоциированный белок 2 (capsr2) 8,9, глутамат рецептора 5,10 , и дофамин-2-рецептора (D2R) 11. В прошлом эти аутоиммунные расстройства ЦНС (в основном называемые энцефалит) часто диагностируется и не лечится. Эти новые биомаркеры антител, напримерNMDA-антитело или D2R антитела, существенно улучшились диагностика и осведомленности, и открыли возможности для лечения пациентов. Действительно, в начале лечения с иммунотерапии связано с улучшением результатов 11,12.
Традиционные методы для выявления антител, такие как иммуноферментного анализа (ELISA) и вестерн-блоттинга были использованы для выявления антител в сыворотках. Тем не менее, они не всегда позволяют признание внеклеточных или поверхностных эпитопов и, скорее, может выявить иммунореактивности к внутриклеточным эпитопа. Кроме того, антитела, которые связываются с внеклеточным доменом важных белков, участвующих в нейротрансмиссии, вероятно, будут патогенный 2,3,7,13,14. Таким образом, развитие точных и чувствительных анализов, чтобы обнаружить соответствующую поверхность клеток или внеклеточных антител цели у пациентов имеет первостепенное значение. Способ золотым стандартом в этой области основана на использовании живых клеток, в так называемом "клеток-баSED анализы ". Этот метод предполагает выражение антигена на поверхности клеток млекопитающих (чаще всего человеческие эмбриональные почечные 293 (НЕК293) клеток) в своей нативной форме по трансфекции векторов, содержащих полную последовательность кДНК представляющим интерес антигеном. Текущие nonpermeabilized Клетки затем инкубировали с Разведенные образцы сыворотки и последующей флуорохромом-конъюгированного антитела против человеческого иммуноглобулина (Ig) вторичных антител. Интенсивность или уровень флуоресценции затем обнаружены и связан с уровнем аутоантител связывания. Этот метод является специфическим, так как только один антиген избыточно экспрессируется в клетках. Наиболее широко используется "для чтения отъезде" был конфокальной микроскопии анализ после иммуноцитохимии 4,5,8-10. Тем не менее, проточной цитометрии клеточных анализов были успешно использованы для выявления антител у пациентов с демиелинизирующих заболеваний 15-17. В частности, Waters и соавт. 15 по сравнению обнаружение антител с использованием поддонэль из методов обнаружения антител в том числе клеточных анализов, после чего микроскопии или проточной цитометрии анализа и показал проточной цитометрии на основе клеток анализе наиболее чувствительными, точными, и надежный способ. Таким образом, проточной цитометрии клеток на основе анализа является предпочтительным, поскольку это количественный, не зависящих исследователь, и не включает в себя любое использование радиоактивного материала. Это также удобно, так как позволяет большие когорты пациентов для анализа в короткий промежуток времени.
Совсем недавно, мы оптимизировали поток высокой пропускной цитометрии клеток на основе анализа для обнаружения NMDAR антитела и D2R антитела у пациентов с аутоиммунными заболеваниями ЦНС 11. Наша группа недавно обнаружены NMDAR антитела в сыворотке пациента с помощью проточной цитометрии на основе клеток анализа. Эти NMDA-антитело-положительные сыворотки были предварительно проанализированы с помощью конфокальной микроскопии и также оказались положительными 11. Этот протокол описывает проточной цитометрии на основе клеток анализа для обнаружения сonformation чувствительных ЦНС антитела в сыворотке пациента с использованием автоматизированной высокой пропускной сэмплер.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта статья описывает новую применение проточной цитометрии живых клеток на основе анализа для выявления антител, направленных на конкретные белки нервных клеточной поверхности с помощью высокой пропускной сэмплер. Используя эту технику, мы сообщаем, что подгруппа пациентов, страдаю?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета, Star научного фонда (Австралия), синдром Туретта Ассоциации (США), Триш Рассеянный склероз исследовательский фонд и рассеянный склероз Исследование Австралия, Петре Фонд (Австралия), Ребекка Л. Купер Медицинский фонд исследований (Австралия). Мы благодарим всех пациентов и членов их семей, которые предоставили образцы для нашего исследования.
Materials
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
