Summary
Ultra-højfrekvente ultralyd er en kraftfuld levende billedbehandling værktøj til at undersøge hjerteanomalier i små dyr. Dens noninvasiveness tillader opretholde den fysiologiske tilstand af embryoner. Heri viser vi brug af M-mode ultralyd til at måle puls embryoner ved E18.5 i livmoderen.
Abstract
Medfødt hjertesygdom (CHD) er den hyppigste infektiøse dødsårsag ved fødslen. Forekomsten af CHD varierer fra 4 til 50/1, 000 fødsler (sygdomme og skader regionale skøn, World Health Organization, 2004). Kirurgiske indgreb, der ofte kompromittere livskvalitet er forpligtet til at rette hjertefejl, minder os om vigtigheden af at finde årsagerne til CHD. Mutant musemodeller og live imaging-teknologi er vigtige redskaber til at studere ætiologien af denne sygdom. Selv avancerede metoder tillader billeddannelse af unormale hjerter i embryoner er de fysiologiske og hæmodynamiske tilstande af sidstnævnte ofte kompromitteret på grund af kirurgiske og / eller langvarige procedurer. Noninvasiv ultralydsbilleddannelse dog kan anvendes uden kirurgisk udsætte fostre, og dermed bevare deres fysiologi. Heri, bruger vi simpel M-mode ultralyd til at vurdere hjerte satser embryoner ved E18.5 i livmoderen. Afsløringen af unormal hjerterytme satser er faktisk en god indicator af dysfunktion af hjertet, og dermed udgør et første skridt i identifikationen af udviklingsmæssige defekter, der kan føre til hjertesvigt.
Introduction
CHD er den mest almindelige infektiøse dødsårsag ved fødslen 1. Flere operationer er ofte nødvendige for at rette op på de strukturelle mangler i fag, hvis livskvalitet kan forblive kompromitteret 1. Børn med CHD ofte udvikler neurologiske forstyrrelser, selv om de ikke har gennemgået en operation, hvilket indikerer vigtig i livmoderen konsekvenser for udvikling 2,3. Både genetiske og miljømæssige faktorer, såsom udsættelse for vira eller kemikalier (alkohol) under graviditeten, årsag CHD. Studere de genetiske bidragydere er stadig i sin tidlige fase, men vokser hurtigt. At identificere disse bidragydere og forstå deres rolle i hjerte udvikling, fænotypebestemmelse mutant mus med et enkelt og effektivt værktøj vil være yderst gavnligt.
Mus er faktisk en dyremodel for valg for at studere CHD, og de fleste af de humane tilfælde kan gengives i mus 4,5. Derfor har føtal mus cardiac fænotypebestemmelse blive increasingly vigtigt at undersøge ætiologien af menneskelige CHD og kræver passende værktøjer. Selv histologiske undersøgelser af faste prøver er uvurderlig, real-time scanning af levende dyr er afgørende at forstå fysiologi hjertet. Video mikroskopi tilbyder levende billedbehandling. Men det kræver laparotomi at afsløre fostre og dermed at kompromittere deres fysiologiske og hæmodynamisk tilstand. For nylig har ekkokardiografi blevet standard imaging teknik for hjerte-vurderinger i klinikken samt i mus.
Mus føtal ekkokardiografi udføres ved hjælp af standard kliniske ultralyd systemer samt ultra-højfrekvente ultralyd-systemer. Sidstnævnte giver 30 MHz eller højere frekvens transducere, der genererer to-dimensionelle billeder og tillade vurdering af tidlige embryonale stadier. Disse transducere har en forholdsvis dårlig indtrængningsdybde (~ 13 mm), som er imidlertid tilstrækkeligt til at opnå tilstrækkelige billeddiagnostiske fly og bestemme grundlæggende hjerte paparametre, såsom puls, venstre og højre ventrikel indvendig diameter på diastole og systole og septum og vægtykkelse, uden at udføre laparotomi.
I vores undersøgelse har vi brugt en ultra-højfrekvente ultralyd system til at vurdere hjerte satser museembryoer på embryonal dag E18.5. Vi valgte en 30 MHz transducer, der giver et synsfelt på 20 mm x 20 mm, som er ideel betragtning af størrelsen af fostrene, med en brændvidde på 12,7 mm. Dog kan en højere frekvens transducer vælges til at analysere tidligere udviklingsstadier. Den valgte M-tilstand tillader visualisering af væv i bevægelse takket være en høj tidslig opløsning på 1.000 billeder / sek. Den fulde procedure er enkel og bør udføres så hurtigt som muligt for at undgå enhver forstyrrelse af den fysiologiske og hæmodynamiske tilstande af fosteret. Analysen af omkring 8 embryoer kræver ca 1 time.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle er vist i denne protokol procedurer er blevet godkendt af IRCM Animal Care udvalget.
1.. Ultrasound System og Station Forberedelse
- Start ultralyd billeddannende system og tilslut scanhovedet samt fysiologi styreenheden ifølge producentens anvisninger (figur 1). Vælg Hjertemåling Program og scanhovedet, der svarer til 30 MHz transducer.
- Fyld næsestykket af scanhovedet med deioniseret vand. Undgå luftbobler, da de griber ind i billedbehandling opløsning. Placer scanhovedet med håndtaget opad indehaveren nær imaging platform (figur 1A).
- Desinficer imaging platform og arbejdsområde.
- Fyld helt flaske ultralyd gel for at undgå dannelse af bobler og placere den på hovedet i sin foropvarmning container sæt til 37 ° C (figur 1B).
- Kontroller niveauet af oxygen og isofluran og rørsystemet til anæstesi. Et eksperiment med ~ 8 embryoner ville bruge ca 15-20 L ilt.
- Placer flasker af oftalmologiske balsam, hårfjerningsmiddel og elektrodegel nær imaging platform (figur 1B).
- Kontroller, at den infrarøde varme lampe funktioner. Under træningen indstille varmetrin, positionen af lampen og afstanden af lampen til mus med henblik på at opretholde en konstant kropstemperatur og puls.
Bemærk: Korrekt forberedelse af systemet og materialet er kritisk. Langvarige procedurer kan påvirke fysiologiske og hæmodynamiske egenskaber fostre så længe anæstesi nedtrykker hjertefunktion ved at sænke puls, blodtryk og blod-oxygenering plan. Sagsbehandlingstiden for ~ 8 fostre (gennemsnitlig kuldstørrelse hos C57BL / 6) bør være ca 1 time. Andre musestammer kan give en højere antal fostre, eventuelt med en større kvindelig størrelse. Uddannelse er afgørende for at optimere processing tid.
2. Mus Forberedelse
- Bedøver den gravide kvinde i et kammer med konstant forsyning af 2% isofluran i oxygen (200 ml / min), indtil det bliver nonresponsive.
- Placer musen på imaging platform i en liggende stilling, justere slangen til kontinuerlig inhalation af 1,5% isofluran i oxygen (200 ml / min), og fastsætte inhalationsrøret med tape (figur 2A). Tilstrækkelige anæstesi bør bekræftes under proceduren ved den afslappede kropsholdning af musen og ikke fik nogen reaktion på hale og tå trykker.
- Placer elektrode gel alene i venstre top og højre nederste elektrodepuder (højre forgrunden ben og venstre bagben, også kaldet bly II position) for elektrokardiografi. Bly II position giver bedre defineret opretstående positiv P-bølge og QRS-kompleks til at bestemme puls. Fastgør de fire poter til hver pude ved hjælp af tape (figur 2A). For at undgå tørhed i øjne, gælder 1 dråbeoftalmologiske balsam i hvert øje.
- Barbere maven fra brystet til at blære med en hårklipper. Så gælder hårfjerningsmiddel i 2 min og tørre det af med gaze og / eller vatpind til forsigtigt at fjerne eventuelle resterende hår. Vær forsigtig med ikke at skære brystvorterne.
- Termometret smurt med elektrodegel i kvindens endetarm at overvåge kropstemperaturen (bør holdes på 37 ± 0,5 ° C ved at justere en infrarød varmelampe placeret over platformen). Puls skal være 450 ± 50 slag / min (bpm). Både temperatur og puls vises fysiologi styreenheden (figur 1B).
Bemærk: Lang bedøvelse, hårtab og ultralyd gel (selvom forvarmet) kan føre til hypotermi, hvilket kan påvirke den kvindelige puls. Hvis kropstemperaturen falder til under 36,5 ° C, standser proceduren og ændre placeringen af varme lampe til at justere temperaturen og hjertefrekvensen. Vent et par minutter befmalm skrider igen.
3. Embryo Identifikation
- Tryk forsigtigt ned på den nøgne mave til at finde de embryoner. Langsomt og let sprede dem ud til at have de fleste af embryoner i et enkelt lag under den abdominale overflade. I hvert uterushorn er sække lineært forbundet med hinanden. Prøv at respektere denne rækkefølge, når at sprede sig.
- Mark hver foster på den nøgne mave af den kvindelige med en permanent markør med deres forreste / bageste og dorsale / ventrale retninger. Kendskab til orientering vil lette at lokalisere hjertet med sonden. Antal embryoner i højre og venstre horn startende fra livmoderhalsen (1, 2, 3 ... og 1 ', 2', 3 '... henholdsvis figur 2B).
Bemærk: (i) at undgå spredning af fostre med stor kraft. Skitse deres placeringer på et stykke papir for at spore dem (figur 2C). (Ii) C57BL / 6 tæver har ~ 8 fostre per kuld. Men 0-2 embryoner i hvert kuld er located under de andre, hvilket gør det umuligt deres billeddannelse. Udelukke disse embryoner fra analysen og vurdere flere kuld, hvis nødvendigt.
4.. Pulsmåling
- Placer en lille mængde af forvarmet ultralyd gel på den nøgne mave og sprede det jævnt. Undgå dannelse af luftbobler. Tilføj en større mængde gel (~ 5 ml) på det specifikke område af billedet.
- Hold sonden i kontakt med tyk gel lag (10 mm) og gradvist bevæge sonden mod huden, mens hun leder efter det bankende hjerte. Når det bankende hjerte visualiseres på skærmen, justere vinklen på sonden at have begge ventrikler i deres største størrelse i afbildningsplanet (Figur 2D).
- Begynd at erhverve billede. Med underarmen hvilende på stationen, skal du placere transduceren på ultralyd gel for at opnå et levende billede på TV-skærmen (Figur 2D). Opretholdelse højderyggen af transduceren på toppen og klikke scanhovedet ORIENTERINn markør (i øverste venstre hjørne af billedet) giver mulighed for koordination af hånd bevægelse og område visualiseret på skærmen.
- Startende fra livmoderhalsen, flytte til den nærmeste embryo mærket (1 eller 1 'i højre eller venstre livmoderhorn, henholdsvis) til at visualisere det bankende hjerte på skærmen. Fordi fokal dybde er fast, forsigtigt flytte sonden op / ned og sidelæns uden at miste kontakten med gel at opnå den ønskede billedplan.
- Placer det bankende hjerte i midten af skærmen i regionen angivet af den gule stiplet linje, der repræsenterer den centrale zone for bedre dataopsamling.
- Anskaf live optagelse. Anskaf spejder image og genoptage optagelsen (figur 3A). Når mindst 10 sek stabil optagelse er opnået, stoppe optagelsen og gemme.
- Fortsæt til næste foster.
- Når alle embryoner analyseres, tryk på "Gennemse" på tastaturet for at se listen over optagelser. Spil hver indspillede M-mode tracing og udføre flere målinger (mindst 5 pr sporing) af afstanden mellem tilstødende toppe (tid / flow cyklus) for at få den gennemsnitlige hjertefrekvens (figur 3B).
Bemærk: Nogle protokoller foreslår at bruge en stationær stativ til scanhovedet for at undgå rystelser. Men det fastholder den vinkel analyse til observation af laterale embryoner vanskelig. Det er også sinker analysen, da stativet skal justeres for hvert foster. Holding scanhovedet mens bilæggelse underarmen på stationen effektivt minimerer rystelser. Træning med 5-10 drægtige hunner anbefales at optimere resultatet.
5.. Genotypning
- Brug rene kirurgiske sakse og tænger incise længderetningen huden og musklen lag af maven. Find de sække i hver livmoderhornet og matche tallene. Skær blommesækken at eksponere foster i den rækkefølge anvendt ovenfor. Hvis det ikke i en lineær arrangement, skitse af embryo positioner på et stykkepapir vil være afgørende, når de mærker på huden ikke længere er synlige.
- Skær kun ~ 4 mm hale til genotypebestemmelse som genomisk DNA er meget effektivt udvundet embryonale haler.
Bemærk: (i) Den kirurgiske procedure skal muligvis udføres i et andet sted end det billeddannende rum. Men det er vigtigt ikke at bevæge musen og har den kirurgiske procedure på billeddannelse platform med henblik på at holde styr på de nummererede embryoner. Consult dyreanlægget manager til at optimere den kirurgiske procedure. (Ii) Den gravide kvinde hurtigt dør på grund af blodtab, da fostrene fjernes til genotypebestemmelse efter billeddannelse. Efter hale cut, bliver fostrene placeret 3 minutter på is til anæstesi ved hypotermi og derefter halshugget med en saks, som anbefalet af vores Animal Care udvalget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovennævnte metode blev anvendt til at vurdere virkningen af tilstedeværelsen eller fraværet af serin protease furin i endotelceller på hjerte satser for museembryoer på E18.5 i livmoderen. Furin hører til familien af proproteinet convertases (pc'er), som spalter proteinpræcursore efter basale rester. Furin og dets substrater er sekretoriske proteiner og spaltning kan forekomme i Golgi-apparatet, endosomer eller på celleoverfladen. Vigtige substrater af furin omfatter TGFb og TGFb-lignende faktorer, såsom de knoglemorfogenetiske proteiner (BMP'er), der spiller en vigtig rolle i hjertet udvikling. Andre medlemmer af pc-familien kan også aktivere typiske substrater af furin ved in vitro spaltning 6. Nøglen og unikke rolle furin under udvikling fremgår af den tidlige død Furin-mangel embryoner på embryonal dag 11 7.
Fordi mange af de fejl udstillet af Furin-mangel embryoner foreslog en vigtig funktion ifurin i endotelceller blev rollen af enzymet undersøgt i endotelcellespecifikt knockout (EcKo) mus. Furin FLOX / FLOX mus, der bærer betingede FLOX alleler af Furin gen 8, blev krydset med Furin FLOX / + mus, der bærer et transgen i hvor ekspression af Cre-rekombinase er drevet af endotelcellespecifikt Tie2 promotor 9. I endotelceller, ska rekombinerer to loxP-sites, der flankerer exon 2 af Furin genet, som koder for signalpeptidet og en del af prosegment og genererer dermed inaktiverede Furin alleler. Ecko nyfødte dør kort efter fødslen, hvilket bekræfter den væsentlige rolle furin i behandlingen af endotelceller forstadier.
I livmoderen analyse af hjerte satser i fostre hos E18.5 viste, at homozygote, men ikke heterozygote, Ecko embryoner lidt fra takykardi (forhøjede hjerte satser Figur 4 10.
Figur 1. Oversigt system set-up. (A) Ultra-højfrekvente ultralyd-system med scanhovedet i holderen vises. (B) Stationen omfatter et bedøvelsesmiddel system fysiologi styreenheden og materialer. Clic k her for at se større billede.
Figur 2. Mus set-up. (A) Den gravide mus anbringes i rygleje med isofluran forsyning og fastspændt på platformen med tape. (B) Efter abdominal hårfjerning, er placeringen af embryoner markeret på maven eller (C) skitseret på et stykke papir. (D) Den ønskede afbildningsplanet opnås ved at bevæge scanhovedet der forbliver i kontakt med ultralyd gel. Underarmen er sikkert placeret på stationen for at undgå at ryste. Klik her for at se større billede .
jpg "width =" 500px "/>
Figur 3. Repræsentativ vurdering af pulsen. (A) en todimensionalt ekkokardiografi billede af et embryonisk hjerte på E18.5 blev opnået ved at placere det i fokalzone centreret på den gule stiplet. De to ventrikler er angivet med pile. LV, venstre ventrikel, RV, højre ventrikel. (B) Pulsen beregnes ud fra gentagne målinger mellem tilstødende flow cykler i M-mode sporing. Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Repræsentant dataanalyse af hjertefrekvensen. In Utero ekkokardiografi (M-mode) af 9. WT og 7. Ecko embryo hjerter ved E18.5 blev udført ved hjælp af en 30 MHz transducer. Disse embryoner were opnået i tre uafhængige kuld. P <0.0005 (***) blev bestemt ved en to-halet Students t-test, og bjælker repræsenterer middelværdien + SEM. WT, transgen negativ Furin FLOX / + eller Furin FLOX / FLOX mus. Ecko, Furin FLOX / FLOX Tg (Tie2-CRE) + / 0 mus Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
M-mode ekkokardiografi er en effektiv og enkel metode til at måle i livmoderen hjerte satser for mus embryoner. Kommercielt tilgængelige transducere giver tilstrækkelig opløsning til at visualisere små bankende hjerter. Således, de tillader en meget præcis pulsmåling, i forhold til andre metoder såsom pulsmåling, og kan erstatte video i høj opløsning mikroskopi. Men de nuværende værktøjer ikke tillade den samtidige analyse af alle embryoner, hvilket indebærer en kedelig procedure at visualisere hver af embryoner. Hertil kommer, at relativt snævre synsfelt og fraværet af dybdeskarpheden (2D-billede) kræver en manuel justering kun opnås ved uddannede hænder. Faktisk kan en ordentlig uddannelse i høj grad maksimere effektiviteten af denne metode.
In vivo målinger af embryonale hjerte satser (E18.5) tilbyder en fysiologisk vurdering af hjertefunktionen ved en noninvasiv billeddannelse som, forskellig fra tidligere metoder, det gørikke kræve laparotomi. I stedet markerer placeringen af embryonerne på maven af den gravide kvinde sikrer en ordentlig sporing og bevarer deres fysiologiske tilstand. Således procedure overvinder den største svaghed ved andre billeddiagnostiske teknologier, såsom computertomografi og magnetisk resonans. Sidst men ikke mindst, er denne metode mindre omkostningskrævende.
Et par kritiske trin i denne fremgangsmåde indbefatter at holde kropstemperaturen og puls af den gravide mus stabilt ved at justere positionen af varmelampe og generere et ordentligt isofluran for at opretholde den fysiologiske tilstand af embryoner og erhverve pålidelige data. Fortsætter på en sammenhængende måde og på kortest mulig tid er afgørende. Derfor procedure enkel holde og øve forud for proceduren er stærkt anbefales.
Afslutningsvis M-mode ekkokardiografi er en effektiv metode til at vurdere embryonale hjerte satser i livmoderen. Abnormtmal hjertefrekvens er tegn på hjerte dysfunktion og den beskrevne fremgangsmåde vil give specialister, såvel som ikke-specialister, til at screene for udviklingsmæssige defekter, der fører til hjertesvigt i musemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikt deklareret.
Acknowledgments
Vi takker Manon Laprise til træning i ekkokardiografi og Ann Chamberland for at træffe de billeder vist i figur 1 og 2.. Dette arbejde blev støttet af canadiske Institutes of Health Research tilskud MOP 44363 og Canada Chair 950-216.684.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| Electrode gel | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| Ophthalmic gel | Novartis | Tear-Gel | |
| Depilatory cream | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| Hair clipper | |||
| Gauze/cotton swap | Q-tips | ||
| Permanent marker | |||
| High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz Transducer | Visual Sonics | RMV707B | |
| Imaging platform and physiology controller unit | Visual Sonics | ||
| Anesthetic System | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| Infrared heating lamp |
References
- Hoffman, J. I., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).
- Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and. 15, 165-176 (2003).
- Yu, Q., et al. ENU induced mutations causing congenital cardiovascular anomalies. Development. 131, 6211-6223 (2004).
- Seidah, N. G., Prat, A. The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 367-383 (2012).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Limited redundancy of the proprotein convertase furin in mouse liver. J. Biol. Chem. 279, 53442-53450 (2004).
- Kisanuki, Y. Y., et al. Tie2-Cre transgenic mice: a new model for endothelial cell-lineage analysis in vivo. Dev. Biol. 230, 230-242 (2001).
- Kim, W., et al. Loss of endothelial furin leads to cardiac malformation and early postnatal death. Mol. Cell Biol. 32, 3382-3391 (2012).
