Summary
Ультра-высокая УЗИ частота и мощным концертным инструментом визуализации для изучения сердечной патологии у мелких животных. Его неинвазивность позволяет поддерживать физиологическую состояние эмбрионов. Здесь мы покажем использование ультразвука М-режим, чтобы измерить частоту сердечных сокращений эмбрионов на E18.5 в период внутриутробного развития.
Abstract
Врожденные пороки сердца (ИБС) является наиболее частой неинфекционной причиной смерти при рождении. Заболеваемость ИБС колеблется от 4 до 50/1, 000 рождений (болезней и травм региональные оценки, Всемирной организации здравоохранения, 2004 г.). Операции, которые часто ставят под угрозу качество жизни обязаны исправить дефекты сердца, напоминая нам о важности нахождения причины ИБС. Мутант мышиные модели и технологии жить изображений стали важными инструментами для изучения этиологии этого заболевания. Хотя современные методы позволяют живого изображения аномальных сердцах у эмбрионов, физиологические и гемодинамические состояния последнего часто нарушена из-за хирургических и / или длительных процедур. Неинвазивной визуализации ультразвук, однако, могут быть использованы без хирургического подвергая эмбрионов, тем самым сохраняя их физиологии. При этом мы используем простой ультразвук М-режим, чтобы оценить сердца темпы эмбрионов на E18.5 в период внутриутробного развития. Обнаружение аномальных ЧСС, действительно, хороший индикатортор дисфункции сердца и, таким образом, представляет собой первый шаг в идентификации дефектов развития, которые могут привести к сердечной недостаточности.
Introduction
ИБС является наиболее распространенным неинфекционным причиной смерти при рождении 1. Несколько операций часто необходимы, чтобы исправить структурные дефекты в субъектов, качество жизни может оставаться под угрозой 1. Дети с ИБС часто развиваются неврологические расстройства, даже если они не перенес операцию, указывая важно в последствиях внутриутробно на развитие 2,3. Оба генетических и экологических факторов, таких как воздействие вирусов или химических веществ (алкоголь) во время беременности, вызывают ИБС. Изучение генетических вкладчиков все еще находится на ранней стадии, но быстро растет. Для идентификации этих вкладчиков и понимать свою роль в развитии сердца, фенотипирование мутантных мышей с простым и мощным инструментом будет очень полезно.
Мышь действительно животное модель выбора для изучения ИБС, и большинство случаев заболевания людей могут быть воспроизведены на мышах 4,5. Следовательно, плода мыши сердечной фенотипирование стал вклreasingly важно исследовать этиологию человека ИБС и требует адекватных инструментов. Хотя гистологические исследования на фиксированных экземпляров бесценны, в режиме реального времени изображения живых животных важно понять физиологию сердца. Видео микроскопия предлагает живую изображений. Однако, это требует лапаротомии выставить эмбрионов, тем самым ставя под угрозу их физиологическую и гемодинамики состояние. Недавно, эхокардиография стал стандартом метод визуализации для сердечных оценок в клинике, а также у мышей.
Мышь эхокардиография плода проводится с использованием стандартных клинических ультразвуковых систем, а также ультразвуковых систем сверхвысокой частоты. Последние обеспечивают 30 МГц или выше частоты преобразователи, которые генерируют двухмерные изображения и позволяют оценку ранних эмбриональных стадиях. Эти преобразователи имеют относительно плохое глубину проникновения (~ 13 мм), которое, однако, достаточно для получения адекватных плоскостей воспроизведения и определить фундаментальную сердца раметры, такие как частота сердечных сокращений, левого и правого желудочков внутренним диаметром в диастолу и систолу и перегородки и толщиной стенки, без выполнения лапаротомии.
В нашем исследовании мы использовали систему сверхвысокой частоты ультразвука для оценки сердечные показатели эмбрионов мыши на эмбриональной день E18.5. Мы выбрали преобразователь 30 МГц, что обеспечивает вид на поле размером 20 мм х 20 мм, который идеально подходит, учитывая размер плодов, с фокусным расстоянием 12,7 мм. Тем не менее, выше преобразователь частоты могут быть выбраны для анализа более ранние стадии развития. Выбранный М-режим позволяет визуализацию тканей в благодаря движения к высоким временным разрешением 1000 кадров / сек. Полная процедура проста и должна быть выполнена как можно быстрее, чтобы избежать возмущения физиологических и гемодинамических состояний плода. Анализ около 8 эмбрионов требует приблизительно 1 час.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, показанные в этом протоколе были одобрены Комитетом по IRCM уход за животными на.
1. Ультразвуковая система и подготовка станции
- Запустите систему ультразвукового изображения и подключите сканирующей головки, а также блок регулятора физиологии в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (рис. 1). Выбрать программу Сердечная измерения и сканирующей головки, соответствующий преобразователь 30 МГц.
- Заполните носовой наконечник в сканирующей головки с деионизированной водой. Избегайте воздушных пузырьков, как они мешают с разрешением изображения. Поместите сканирующей головки с ручкой стороной вверх на его владельца возле платформы визуализации (рис. 1А).
- Лечить платформу визуализации и рабочую зону.
- Заполните полностью бутылку ультразвукового геля, чтобы избежать образования пузырьков и поместить его с ног на голову в его prewarming контейнера набора до 37 ° C (рис. 1В).
- Проверьте уровни оксипоколения и изофлюран и система труб для анестезии. Один эксперимент с ~ 8 эмбрионов будут использовать около 15-20 L кислород.
- Поместите бутылки глазной бальзам, депиляции кремом и электрода геля возле изображений платформы (рис. 1В).
- Убедиться, что инфракрасный функции инфракрасной лампой. Во время обучения, установить уровень тепла, положение лампы и расстояние от лампы до мышей в целях поддержания постоянной температуры тела и частоты сердечных сокращений.
Примечание: Правильная подготовка системы и материала имеет решающее значение. Длительные процедуры может повлиять на физиологические и гемодинамические характеристики плодов до тех пор, анестезия угнетает сердечную функцию, снижая частоту сердечных сокращений, артериальное давление и уровень в крови оксигенации. Длительность процесса для ~ 8 плодов (средний размер помета в C57BL / 6) должна быть примерно 1 час. Другие штаммы мышей может обеспечить большее количество плодов, возможно, с большим женского размера. Обучение необходимо для оптимизации перерабонг время.
2. Подготовка Мышь
- Обезболить беременных женщин в камере с непрерывной подачи 2% изофлуран в кислороде (200 мл / мин), пока не станет нечувствительность.
- Наведите мышь на платформе изображений в лежачем положении, отрегулируйте трубки для непрерывного вдыхания 1,5% изофлуран в кислороде (200 мл / мин), и исправить ингаляции трубку с ленты (рис. 2А). Достаточные анестезия должна быть подтверждена в ходе процедуры по расслабленной позе мыши и отсутствие какой-либо реакции на хвост и ног пинчах.
- Место электрод гель только на левой верхней и правой нижней электродных пластин (справа передней ноге и левой задней ноги, которая также называется свинец II позиция) для электрокардиографии. Свинец II позиция обеспечивает лучшую определенный вертикальный положительное P-волны и QRS комплекс для определения частоты сердечных сокращений. Закрепите четыре лапы, чтобы каждый пэд с помощью ленты (рис. 2а). Чтобы предотвратить сухость глаз, нанесите 1 каплюофтальмологических бальзам в каждый глаз.
- Бритье живота от грудной клетки до мочевого пузыря с машинки для стрижки волос. Затем нанесите Крем для депиляции в течение 2 мин и протрите его марлей и / или ватным тампоном, чтобы аккуратно удалите оставшиеся волосы. Будьте осторожны, чтобы не порезать соски.
- Вставьте термометр смазанные с электродом геля в самки прямой кишки, чтобы контролировать температуру тела (должна поддерживаться на уровне 37 ± 0,5 ° С, регулируя инфракрасную нагревательную лампу, расположенном над платформой). Частота сердечных сокращений должна быть 450 ± 50 уд / мин (ударов в минуту). Оба температуры и частоты сердечных сокращений отображаются на блоке контроллера физиология (рис. 1В).
Примечание: Длинные обезболивание, выпадение волос и ультразвуковой гель (хотя нагретого) может привести к гипотермии, которая может повлиять на частоту сердечных сокращений самки. Если температура тела падает ниже 36,5 ° С, остановить процедуру и изменить положение нагревательного лампы для регулировки температуры и частоты сердечных сокращений. Подождите пару минут БЭФРуды исходя снова.
3. Эмбрион Идентификация
- Осторожно надавите на голой живота, чтобы найти эмбрионов. Медленно и слегка разведите их, чтобы иметь большинство эмбрионов в один слой под брюшной поверхности. В каждом роге матки, мешочки линейно соединены друг с другом. Попробуйте соблюдать этот порядок при распространении.
- Отметьте каждый эмбрион на голой живота самки с постоянным маркером с их передней / задней и спинной / вентральной стороны. Зная ориентацию будет способствовать локализации сердце с зондом. Количество эмбрионов в правой и левой рожки, начиная с шейки матки (1, 2, 3 ... и 1 ', 2', 3 ', ... соответственно, рис 2b).
Примечание: (я) Избегайте распространения эмбрионов с большим усилием. Эскиз их расположение на листе бумаги, чтобы отслеживать их (рис. 2С). (II) C57BL / 6 самок ~ 8 плодов в помете. Тем не менее, 0-2 эмбрионов в каждом помете являются лocated под другим, что делает их изображений невозможно. Исключить эти эмбрионы из анализа и оценки больше пометов в случае необходимости.
4. ЧСС Измерение
- Нанесите небольшое количество нагретого ультразвукового геля на невооруженным живота и равномерно распределите. Избегайте образования пузырьков. Добавить большее количество геля (~ 5 мл) от конкретной области в изображении.
- Удерживая датчик в контакте со слоем густой гель (10 мм) и постепенно перемещения зонда к коже при поиске биение сердца. После того, как бьющееся сердце визуализируется на экране, регулировать угол зонда иметь оба желудочка в их наибольшего размера в плоскости изображения (рис. 2D).
- Начните приобретения изображение. С предплечье лежит на станции, поместите датчик на ультразвукового геля, чтобы получить живое изображение на экране просмотра (рис. 2D). Поддержание хребет преобразователя на верхней и нажав сканирующей головки orientatioн Маркер (в левом верхнем углу изображения) позволяют координацию движений рук и области визуализируется на экране.
- Начиная с шейки матки, перемещается в ближайшее эмбриона отмечены (1 или 1 'в правом или левом роге матки соответственно) визуализировать бьющееся сердце на экране. Поскольку глубина очага фиксировано, осторожно перемещения зонда вверх / вниз и вбок без потери контакта с гелем, чтобы получить желаемую плоскость изображения.
- Установите биение сердца в центре экрана в пределах области, обозначенной желтой пунктирной линией, представляющей фокусное зону для лучшего сбора данных.
- Приобретать живая запись. Получите разведчик изображение и возобновить запись (рис. 3А). После того, как минимум 10 сек стабильного записи получается, остановить запись и сохранить.
- Переходите к следующему эмбриона.
- После того как все эмбрионы анализируются, нажмите "Browse" на клавиатуре, чтобы просмотреть список записей. Играть каждый записанный М-режим Трейсинг и выполнять несколько измерений (по крайней мере 5 за трассировки) от расстояния между соседними пиками (цикл времени / поток) для получения средней частоты сердечных сокращений (рис. 3б).
Примечание: Некоторые протоколы предлагают использовать стационарную подставку для сканирующей головки, чтобы не взболтать. Тем не менее, это ограничивает угол анализа, что делает наблюдение боковых эмбрионов трудно. Он также замедляет анализа, а стенд должен быть отрегулирован для каждого эмбриона. Держа сканирующей головки при решении предплечье на станции эффективно устраняется тряска. Обучение с 5-10 беременных рекомендуется оптимизировать результат.
5. Генотипирование
- Использование чистых хирургические ножницы и щипцы, надрезать продольно кожу и мышечный слой живота. Найдите мешочки в каждом матки рога и соответствуют номерам. Разрезать желточный мешок подвергать эмбрион в порядке, который используется выше. Если не в линейном расположении, эскиз позиций эмбриона на листебумаги не будет иметь важное значение, как только следы на коже больше не видны.
- Вырезать только ~ 4 мм, хвоста для генотипирования, как геномная ДНК очень эффективно извлекается из эмбриональных хвостами.
Примечание: (I) хирургическая процедура может должны быть выполнены в отдельном месте из комнаты изображения. Тем не менее, важно не перемещать мышь и имеют хирургические процедуры на платформе изображения для того, чтобы отслеживать из пронумерованных эмбрионов. Обратитесь к менеджеру за животными, чтобы оптимизировать хирургическую процедуру. (II) Беременная женщина быстро умирает из-за потери крови, поскольку плоды снимаются для генотипирования после съемки. После разреза хвостовой, зародыши помещаются 3 мин на льду в течение анестезии гипотермии, а затем обезглавлен с ножницами, как это было рекомендовано нашего Комитета по уходу за животными на.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данный метод был использован для оценки влияния наличия или отсутствия серин-протеазы фурина в эндотелиальных клетках на сердце темпов эмбрионов мыши на E18.5 в период внутриутробного развития. Фурин принадлежит к семейству proprotein конвертаз (ПК), которые расщепляют белковых предшественников после основных остатков. Furin и ее субстратами являются секреторные белки и расщепление может происходить в аппарат Гольджи, эндосомы или на поверхности клетки. Основные субстраты фурина включают TGFb и TGFb-как факторы, такие как костные морфогенетические белки (BMP), которые играют важную роль в развитии сердца. Другие члены семьи ПК также могут активировать типичные субстраты фурина расщеплением в пробирке 6. Ключ и уникальная роль фурина во время развития свидетельствует ранней смерти Furin-дефицитных эмбрионов в эмбриональный день 11 7.
Поскольку многие из дефектов, проявляемых Furin-дефицитных эмбрионов предложили важную функциюфурин в эндотелиальных клетках, роль фермента был рассмотрен в эндотелиальных клеток конкретных нокаутом (Ecko) мышей. Фурин Flox / Flox мышей, которые несут условные Flox аллелей гена Furin 8 были скрещены с Furin Flox / + мышей, несущих трансген в которой экспрессия рекомбиназы Cre приводится в действие эндотелиальных клеток конкретного промотора Tie-2 9. В эндотелиальных клетках, Cre рекомбинирует два LoxP сайты, которые фланкируют экзона 2 гена Furin, который кодирует сигнальный пептид и часть prosegment, и тем самым генерирует инактивированные аллели Furin. Ecko новорожденных умирают вскоре после рождения, что подтверждает важную роль фурина в обработке прекурсоров эндотелиальных клеток.
Внутриутробное анализа ЧСС у эмбрионов на E18.5 показали, что гомозиготные, но не гетерозиготных, эмбрионы Ecko пострадали от тахикардии (повышенные частоты сердечных сокращений; Рисунок 4 10.
Рисунок 1. Обзор настройки системы. (А) Ультра-высокая частота ультразвуковая система с сканирующей головки в ее держателя показано. (В) Станция включает обезболивающий системы, блок контроллера физиология и материалы. Clic К здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Мышь настройки. (А) Беременная Мышь помещают в положении лежа на спине с изофлурана питания и сдержанный на платформе с лентой. (B) После брюшной удаления волос, расположение эмбрионов отмечается на животе или (С) набросал на бумаге. (D) Желаемый самолет изображения получается путем перемещения сканирующей головки, которая остается в контакте с ультразвуковым гелем. Предплечья надежно закреплен на станции, чтобы не взболтать. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
JPG "ширина =" 500px "/>
Рисунок 3. Представитель оценка частоты сердечных сокращений. (А) двумерная эхокардиография образ зачаточном сердца у E18.5 был получен путем установки его в фокальной зоны с центром в желтой пунктирной линией. Два желудочки указаны стрелками. Л.В., левого желудочка; Р.В., правый желудочек. (В) Частота сердечных сокращений рассчитывается из повторных измерений между соседними циклами потока в отслеживании М-режиме. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Представитель анализ данных частоты сердечных сокращений. Внутриутробное эхокардиографии (М-режим) от 9 WT и 7 Ecko эмбриона сердцах на E18.5 проводили с использованием датчика 30 МГц. Эти эмбрионы жпрежде чем получить в 3-х независимых пометов. Р <0,0005 (***) определялась Т-тест и баров в две Стьюдента представляют собой среднее + SEM. WT, трансген отрицательный Фурин Flox / + или Furin Flox / Flox мышей;. Ecko, Фурин Flox / Flox Tg (Tie-2-CRE) + / 0 мышей Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
М-режим эхокардиография является эффективным и простым методом для измерения внутриутробному ЧСС эмбрионов мыши. Коммерчески доступные преобразователи обеспечивают достаточное разрешение для визуализации небольших бьющимся сердцем. Таким образом, они позволяют очень точное измерение частоты сердечных сокращений, по сравнению с другими методами, такими как измерение импульса, и может заменить видео высокого разрешения микроскопии. Тем не менее, текущие средства не позволяют одновременный анализ всех эмбрионов, подразумевая утомительной процедуры для визуализации каждой из эмбрионов. Кроме того, относительно узкое поле зрения и отсутствие глубины резкости (2D-изображение) требуют ручной регулировки только достигнутый обученным руках. Действительно, надлежащее обучение может значительно увеличить эффективность этого метода.
При измерениях естественных условиях эмбриональных ЧСС (E18.5) предлагает физиологическую оценку функции сердца с помощью неинвазивной живого изображения, как, отличается от предыдущих методов, он делаетне требуют лапаротомии. Вместо этого, маркировка положение эмбрионов на животе беременной женщины обеспечивает надлежащего контроля и сохраняет их физиологическое состояние. Таким образом, процедура преодолевает главную слабость других технологий обработки изображения, таких как компьютерная томография и магнитно-резонансной томографии. И последнее, но не менее важно, этот метод является менее дорогостоящим.
Несколько важных шагов в этом способе, включают поддержание температуры тела и частоты сердечных сокращений беременной мыши стабильной, регулируя положение нагревательного лампы и генерирования надлежащего скорость изофлуран для поддержания физиологического состояния эмбрионов и получить достоверные данные. Исходя в согласованном порядке и в кратчайшие сроки является существенным. Поэтому, сохраняя процедуру простой и практикующих до разбирательства настоятельно рекомендуется.
В заключение, М-режим эхокардиография является эффективным методом для оценки эмбриональные сердечные нормы в период внутриутробного развития. НенормальноMal ЧСС свидетельствуют о сердечной дисфункции и метод, описанный позволит специалистов, а также неспециалистов, для выявления пороков развития, ведущих к сердечной недостаточности на мышах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Манон Laprise для обучения в эхокардиографии и Энн Chamberland для принятия фотографий, показанных на рисунках 1 и 2. Эта работа была поддержана канадскими Институты Исследования Здоровья грант СС 44363 и Канада кафедры 950-216684.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| Electrode gel | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| Ophthalmic gel | Novartis | Tear-Gel | |
| Depilatory cream | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| Hair clipper | |||
| Gauze/cotton swap | Q-tips | ||
| Permanent marker | |||
| High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz Transducer | Visual Sonics | RMV707B | |
| Imaging platform and physiology controller unit | Visual Sonics | ||
| Anesthetic System | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| Infrared heating lamp |
References
- Hoffman, J. I., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).
- Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and. 15, 165-176 (2003).
- Yu, Q., et al. ENU induced mutations causing congenital cardiovascular anomalies. Development. 131, 6211-6223 (2004).
- Seidah, N. G., Prat, A. The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 367-383 (2012).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Limited redundancy of the proprotein convertase furin in mouse liver. J. Biol. Chem. 279, 53442-53450 (2004).
- Kisanuki, Y. Y., et al. Tie2-Cre transgenic mice: a new model for endothelial cell-lineage analysis in vivo. Dev. Biol. 230, 230-242 (2001).
- Kim, W., et al. Loss of endothelial furin leads to cardiac malformation and early postnatal death. Mol. Cell Biol. 32, 3382-3391 (2012).
