Summary
Ultra-hoge frequentie echografie is een krachtige live-imaging tool om cardiale afwijkingen in kleine proefdieren. Zijn noninvasiveness maakt het handhaven van de fysiologische toestand van de embryo's. Hierin tonen we het gebruik van M-mode echo om de hartslag van embryo meten E18.5 in de baarmoeder.
Abstract
Aangeboren hartziekte (CHZ) is de meest voorkomende niet-infectieuze oorzaak van overlijden bij de geboorte. De incidentie van CHD varieert van 4 tot 50/1, 000 geboorten (Ziekte en verwondingen regionale schattingen, World Health Organization, 2004). Operaties die vaak afbreuk doen aan de kwaliteit van het leven nodig zijn om hartafwijkingen corrigeren, herinnert ons aan het belang van het vinden van de oorzaken van hart-en vaatziekten. Mutant muismodellen en live imaging technologie zijn geworden essentiële instrumenten om de etiologie van deze ziekte te bestuderen. Hoewel geavanceerde methoden is het mogelijk live-beeldvorming van abnormale harten in embryo's, worden de fysiologische en hemodynamische toestanden van de laatste vaak aangetast als gevolg van chirurgische en / of langdurige procedures. Invasieve echografie, kan echter zonder chirurgisch bloot het embryo, waardoor hun fysiologie handhaven gebruikt. Hierin maken we gebruik van eenvoudige M-mode echo om hartslag van embryo's beoordelen op E18.5 in de baarmoeder. De detectie van abnormale hartslag is inderdaad een goede indicator van dysfunctie van het hart en vormt dus een eerste stap in het identificeren van defecten in de ontwikkeling die kan leiden tot hartfalen.
Introduction
CHD is de meest voorkomende niet-infectieuze oorzaak van overlijden bij de geboorte 1. Meerdere operaties zijn vaak nodig om de structurele gebreken bij patiënten van wie de kwaliteit van leven kan gecompromitteerd 1 blijven corrigeren. Kinderen met CHD ontwikkelen vaak neurologische aandoeningen, zelfs als ze niet een operatie hebben ondergaan, met vermelding van belang in de baarmoeder gevolgen voor ontwikkeling 2,3. Zowel genetische als omgevingsfactoren, zoals blootstelling aan virussen of chemische stoffen (alcohol) tijdens de zwangerschap, oorzaak CHD. Het bestuderen van de genetische medewerkers zich nog in een vroeg stadium, maar groeit snel. Om deze medewerkers te identificeren en begrijpen van hun rol in de ontwikkeling van het hart, fenotyperen mutante muizen met een eenvoudig en krachtig hulpmiddel zal zijn zeer gunstig.
Mouse is inderdaad een diermodel keuze CHD bestuderen, en de meeste menselijke gevallen kan worden gereproduceerd bij muizen 4,5. Bijgevolg heeft foetale cardiale fenotypering inc gewordenreasingly belangrijk om de etiologie van menselijke CHD onderzoeken en vereist passende instrumenten. Hoewel histologische studies op vaste exemplaren zijn van onschatbare waarde, real-time beeldvorming van levende dieren is cruciaal voor de fysiologie van het hart te begrijpen. Videomicroscopie biedt live beeldvorming. Het vereist echter laparotomie om embryo bloot, waardoor hun fysiologische en hemodynamische toestand compromitteren. Onlangs is echocardiografie de standaard geworden beeldvormende techniek om cardiale evaluaties in de kliniek en in muizen.
Muis foetale echocardiografie wordt uitgevoerd onder normale klinische ultrasound systemen en ultra-hoge frequentie ultrasone systemen. Deze bieden 30 MHz of hogere frequentie transducers dat twee-dimensionale beelden te genereren en kan de evaluatie van vroege embryonale stadia. Deze sensoren hebben een betrekkelijk slechte penetratiediepte (~ 13 mm), die echter voldoende om voldoende beeldvlakken verkrijgen en bepalen fundamentele hart paparameters, zoals hartslag, linker en rechter ventrikel inwendige diameter bij diastole en systole en septum en de wanddikte, zonder het uitvoeren van laparotomie.
In ons onderzoek hebben we een ultra-hoge frequentie ultrasoon systeem om hartslag van muizenembryo's beoordelen op embryonale dag E18.5 gebruikt. We kozen voor een 30 MHz transducer die een gezichtsveld van 20 mm x 20 mm, wat ideaal is gezien de omvang van de foetussen, met een brandpuntsafstand van 12,7 mm biedt. Echter, een hogere frequentie omzetter worden gekozen eerdere ontwikkelingsstadia analyseren. De geselecteerde M-modus kan de visualisatie van weefsels in beweging dankzij een hoge temporele resolutie van 1000 frames / sec. De volledige procedure is eenvoudig en zou zo snel mogelijk worden uitgevoerd om elke verstoring van de fysiologische en hemodynamische toestanden van de foetus te voorkomen. De analyse van ongeveer 8 embryo vereist ongeveer 1 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in dit protocol procedures zijn goedgekeurd door de IRCM Animal Care Comite.
1. Ultrasound System en Station Voorbereiding
- Start het ultrasone beeldvormingssysteem en sluit de aftastkop en de fysiologie controller eenheid volgens aanwijzingen van de fabrikant (figuur 1). Kies Cardiale meetprogramma en de aftastkop die overeenkomt met de 30 MHz transducer.
- Vul het neusstuk van de aftastkop met gedemineraliseerd water. Vermijd luchtbellen als ze interfereren met beeldvorming resolutie. Plaats de scankop met het handvat naar boven aan de houder ervan in de buurt van de imaging platform (Figuur 1A).
- Ontsmet de imaging platform en werkgebied.
- Invullen van de fles van ultrageluid gel om de vorming van luchtbellen te vermijden en leg hem ondersteboven in haar voorverwar container ingesteld op 37 ° C (Figuur 1B).
- Controleer de niveaus van oxygen en isofluraan en de slang systeem voor anesthesie. Een experiment met ~ 8 embryo's zou ongeveer 15-20 L zuurstof te gebruiken.
- Plaats de flessen oogheelkundige balsem, ontharingscrème en elektrode-gel in de buurt van de imaging platform (Figuur 1B).
- Controleer dat de infrarood warmte lamp functies. Tijdens de training set warmte niveau de positie van de lamp en de afstand van de lamp muizen om constante lichaamstemperatuur en hartslag handhaven.
Opmerking: Een goede voorbereiding van het systeem en materiaal kritisch. Langdurige procedures kunnen invloed hebben op de fysiologische en hemodynamische kenmerken van foetussen zolang anesthesie deprimeert hartfunctie door een verlaging van de hartslag, bloeddruk en bloed-oxygenatie niveau. De doorlooptijd voor ~ 8 foetussen (gemiddelde worpgrootte in C57BL / 6) een ongeveer 1 uur zijn. Andere muizenstammen kunnen een hoger aantal foetussen, eventueel voor grotere vrouwelijke formaat. Training is essentieel om de processi optimaliserenng tijd.
2. Muis Voorbereiding
- Verdoven de zwangere vrouw in een kamer met continue aanvoer van 2% isofluraan in zuurstof (200 ml / min) tot het reageert niet wordt.
- Plaats de muis op de imaging platform in liggende positie, passen de slangen voor continue inademing van 1,5% isofluraan in zuurstof (200 ml / min), en bevestig de inhalatie buis met tape (Figuur 2A). Voldoende verdoving moet tijdens de procedure worden bevestigd door de ontspannen houding van de muis en het ontbreken van enige reactie op de staart en teen wringt.
- Plaats elektrode gel alleen aan de linker boven-en rechter onderkant elektroden (rechter voorbeen en linker achterbeen, ook wel lead II positie) voor elektrocardiografie. Lead II opstelplaats beter gedefinieerd rechtop positieve P-top en QRS complex om de hartslag te bepalen. Bevestig de vier poten aan elke pad met tape (Figuur 2A). Om droogheid van de ogen te voorkomen, toepassen 1 druppeloogheelkundige balsem in elk oog.
- Scheer de buik van borst tot blaas met een tondeuse. Dan gelden ontharingscrème voor 2 min en veeg het af met gaas en / of wattenstaafje om alle resterende haren voorzichtig verwijderen. Wees voorzichtig dat u de tepels te snijden.
- Plaats de thermometer gesmeerd met elektrode-gel in het rectum van het vrouwtje om de lichaamstemperatuur te controleren (moet bij 37 ± 0,5 ° C worden gehandhaafd door het aanpassen van een infrarood warmtelamp boven het platform geplaatst). De hartslag moet 450 ± 50 slagen / min (bpm) zijn. Zowel temperatuur en hartslag worden op de fysiologie controller unit (Figuur 1B).
Opmerking: Lange verdoving, haaruitval en ultrasone gel (hoewel voorverwarmde) kan leiden tot onderkoeling, die de hartslag beïnvloeden van het vrouwtje. Indien de lichaamstemperatuur beneden 36,5 ° C, stop de procedure en de positie van de warmtelamp om de temperatuur en hartslag passen passen. Wacht een paar minuten beferts weer verder gaat.
3. Embryo Identificatie
- Druk licht op de blote buik om de embryo's te lokaliseren. Langzaam en licht verspreid ze de meeste embryo's in een laag onder het buikoppervlak. In elke uterushoorn, zijn zakken lineair met elkaar verbonden. Probeer om deze volgorde te respecteren bij het uitrijden.
- Mark elk embryo over de blote buik van de vrouw met een permanent marker met hun voorste / achterste en dorsale / ventrale richtingen. Het kennen van de oriëntatie vergemakkelijkt het lokaliseren van het hart met de sonde. Nummer de embryo's in de rechter en linker hoorns vanuit de cervix (1, 2, 3 ... en 1 ', 2', 3 '... respectievelijk Figuur 2B).
Opmerking: (i) Vermijd het verspreiden van de embryo's met grote kracht. Schetsen hun locaties op een stuk papier om ze op te sporen (figuur 2C). (Ii) C57BL / 6 vrouwtjes hebben ~ 8 foetussen per worp. Echter, 0-2 embryo's in elk nest zijn located onder de anderen, het maken van hun beeldvorming onmogelijk. Uitsluiten deze embryo's uit de analyse en meer nesten te beoordelen als dat nodig is.
4. HARTSLAGMETING
- Plaats een kleine hoeveelheid voorverwarmd ultrasone gel op het blote buik en verdeel het gelijkmatig. Vermijd schuimvorming. Voeg een grotere hoeveelheid gel (~ 5 ml) van het specifieke gebied om de afbeelding.
- Houd de sonde in contact met het dikke gellaag (10 mm) en geleidelijk de sonde naar de huid terwijl het kloppende hart. Zodra het kloppend hart wordt gevisualiseerd op het scherm, stel de hoek van de sonde aan beide ventrikels hebben in hun grootste maat in het beeldvlak (figuur 2D).
- Begin verwerven afbeelding. Met de onderarm rust op het station, plaats de transducer op de echo gel om een live-beeld te verkrijgen op het beeldscherm (figuur 2D). Handhaving van de nok van de transducer op de bovenkant en op de scankop geaardheidn marker (in de linker bovenhoek van de afbeelding) kan de coördinatie van de handbeweging en omgeving gevisualiseerd op het scherm.
- Vanaf de baarmoederhals naar de dichtstbijzijnde embryo aangegeven (1 of 1 'in rechter of linker uterushoorn, respectievelijk) het kloppend hart zichtbaar op het scherm. Omdat scherptediepte is vast, beweeg de sonde omhoog / omlaag en zijwaarts zonder verlies van contact met gel om het gewenste beeldvlak te verkrijgen.
- Plaats het kloppend hart in het midden van het scherm binnen de regio aangegeven door de gele gestreepte lijn die de focale zone voor een betere data-acquisitie.
- Het verwerven van de live-opname. Verkrijgen imago van de verkenner en opnemen (figuur 3A) te hervatten. Zodra een minimum van 10 seconden van stabiele opname wordt verkregen, stoppen met opnemen en opslaan.
- Ga verder naar de volgende embryo.
- Zodra alle embryo's worden geanalyseerd, drukt u op "Bladeren" op het toetsenbord om de lijst van de opnamen te bekijken. Speel elk opgenomen M-modus Tracing en meerdere metingen (minimaal 5 per tracing) van de afstand tussen naburige pieken (tijd / circulatiecyclus) uitvoeren om de gemiddelde hartslag (figuur 3B) te verkrijgen.
Opmerking: Sommige protocollen suggereren met behulp van een stationaire stand voor de scankop te vermijden schudden. Toch weerhoudt de hoek van de analyse, waardoor de waarneming van laterale embryo moeilijk. Het vertraagt ook de analyse als de stand moet worden aangepast voor elke embryo. Houd de scankop terwijl de afwikkeling van de onderarm op het station efficiënt minimaliseert schudden. Trainen met 5-10 drachtige vrouwtjes wordt aanbevolen om het resultaat te optimaliseren.
5. Genotypering
- Met schone chirurgische schaar en forceps, incisie lengterichting huid en spierlaag van de buik. Zoek de zakken in elke baarmoeder hoorn en overeenkomen met de nummers. Opengesneden de dooierzak naar het embryo in de volgorde bovenstaande gebruikte bloot. Indien niet in een lineaire opstelling, de schets van het embryo posities op een stukpapier zal essentieel zijn als de markeringen op de huid niet meer zichtbaar.
- Snijd alleen ~ 4 mm van de staart voor genotypering als genomische DNA wordt heel efficiënt gewonnen uit embryonale staarten.
Opmerking: (i) De chirurgische procedure moet worden uitgevoerd op een andere locatie dan de beeldvormende kamer. Het is echter belangrijk om niet om de muis te bewegen en de chirurgische ingreep op de imaging platform om bij te houden van de genummerde embryo. Raadpleeg het dier facility manager aan de chirurgische procedure te optimaliseren. (Ii) De zwangere vrouw snel overlijdt door bloedverlies als de foetussen worden verwijderd voor genotypering na beeldvorming. Na staart knippen, worden de foetussen geplaatst 3 min op ijs voor anesthesie door onderkoeling en vervolgens onthoofd met een schaar, zoals aanbevolen door onze Animal Care Comite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bovenstaande methode werd gebruikt om het effect van de aanwezigheid of afwezigheid van de serine protease furine endotheelcellen hartslag van muizenembryo's op E18.5 in utero beoordelen. Furine behoort tot de familie van proproteïne convertases (PC's) die aanhangen eiwitvoorlopers na basische residuen. Furine en zijn substraten zijn secretoire eiwitten en splitsing kan in het Golgi-apparaat, endosomen of op het celoppervlak. Belangrijke furine substraten omvatten TGFb en TGFb-achtige factoren, zoals het bot morfogenetische eiwitten (BMPs) die een belangrijke rol spelen bij hart ontwikkeling. Andere leden van de PC-familie kan ook activeren typische substraten van furine door in vitro splitsing 6. De belangrijke en unieke rol van furine tijdens de ontwikkeling blijkt uit de vroege dood van furine-deficiënte embryo's in embryonale dag 11 7.
Omdat veel van de gebreken vertoond door furine-deficiënte embryo's zonder een belangrijke functie vanfurine in endotheelcellen, de rol van het enzym in endotheelcel-specifieke knockout (EcKo) muizen onderzocht. Furine flox / flox muizen die voorwaardelijke flox allelen van het gen Furin 8 dragen gekruist met Furine flox / + muizen die een transgen in die de expressie van het Cre recombinase gedreven door de endotheelcel-specifieke promoter Tie2 9. In endotheelcellen, Cre recombineert twee loxP sites die exon 2 van furine gen, die de signaalpeptide en een deel van prosegment codeert en aldus genereert geïnactiveerde allelen Furine flankeren. Ecko pasgeborenen sterven kort na de geboorte, bevestigt de essentiële rol van furine in de verwerking van endotheelcellen voorlopers.
In utero analyse van de hartslag in embryo's in E18.5 bleek dat homozygote, maar niet heterozygote, Ecko embryo last van tachycardie (verhoogde hartslag; Figuur 4 10.
Figuur 1. Overzicht van het systeem set-up. (A) Ultra-hoge frequentie ultrasoon systeem met de aftastkop in de houder wordt getoond. (B) Het station omvat een anesthesiesysteem, de fysiologie controllerunit en materialen. Clic k hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Muis set-up. (A) De zwangere muis is geplaatst in rugligging met isofluraan aanbod en ingetogen op het platform met tape. (B) Na abdominale ontharing, de locatie van embryo's is aangegeven op de buik of (C) geschetst op een papier. (D) De gewenste beeldvlak wordt verkregen door het verplaatsen van de aftastkop die in contact met de ultrasone gel blijft. De onderarm is stevig geplaatst op het station om te schudden. Klik hier voor grotere afbeelding .
jpg "width =" 500px "/>
Figuur 3. Representatieve beoordeling van de hartslag. (A) Een twee-dimensionale echocardiografie beeld van een embryonale hart op E18.5 werd verkregen door het plaatsen van het binnen de focale zone gecentreerd op de gele gestreepte lijn. De twee ventrikels zijn aangegeven met pijlen. LV, linkerventrikel, RV, rechterventrikel. (B) De hartslag wordt berekend op basis van herhaalde metingen tussen aangrenzende stroom cycli in de M-modus tracing. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. Representatieve gegevensanalyse van de hartslag. In utero echocardiografie (M-modus) van 9 WT en 7 Ecko embryo hartjes in E18.5 werd uitgevoerd met een 30 MHz transducer. Deze embryo were in 3 onafhankelijke nesten verkregen. P <0,0005 (***) werd bepaald door een tweezijdige Student's t-test en staven stellen het gemiddelde + SEM. WT, transgene negatief Furine flox / + of Furine flox / flox muizen;. Ecko, Furine flox / flox Tg (Tie2-cre) + / 0 muizen Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
M-mode echocardiografie is een effectieve en eenvoudige methode om te meten in utero hartslag van muizenembryo's. Commercieel beschikbare transducers voldoende resolutie om kleine kloppende harten te visualiseren. Dus ze laten een zeer nauwkeurige hartslagmeting, vergeleken met andere methoden, zoals hartslag meting en kan hoge resolutie video microscopie vervangen. Echter, de huidige instrumenten niet toe dat de gelijktijdige analyse van alle embryo's, wat een vervelende procedure elk van de embryo's te visualiseren. Bovendien, het relatief smal gezichtsveld en het ontbreken van scherptediepte (2D-beeld) of vereisen een handmatige aanpassing alleen bereikt door geschoolde handen. Inderdaad kan een goede training sterk maximaliseren van de efficiëntie van deze werkwijze.
In vivo metingen van embryonale hartslag (E18.5) biedt een fysiologische evaluatie van de hartfunctie door een niet-invasieve live-imaging als, anders dan de vorige methoden, het doetniet laparotomie vereist. In plaats daarvan, het markeren van de positie van het embryo op de buik van de zwangere vrouw zorgt voor een goede tracking en bewaart de fysiologische toestand. Zo is de procedure overwint de grote zwakte van andere beeldvormende technieken, zoals computertomografie en magnetische resonantie beeldvorming. Tenslotte is deze methode goedkoper.
Enkele kritische stappen in deze werkwijze omvatten waarbij de lichaamstemperatuur en hartslag van de zwangere muis stal door de positie van de warmtelamp en het genereren van een goede snelheid van isofluraan de fysiologische toestand van embryo handhaven en betrouwbare gegevens te verkrijgen. Te gaan op een consistente wijze en in de kortst mogelijke tijd is van essentieel belang. Daarom is het houden van de procedure eenvoudig en oefenen voorafgaand aan de procedure wordt sterk aanbevolen.
Concluderend, M-mode echocardiografie is een effectieve methode voor het beoordelen embryonale hartslagen in utero. Abnormaliteitennormale hartslag zijn indicatief hartdysfunctie en beschreven methode specialisten en nonspecialists toestaan om te screenen op ontwikkelingsstoornissen leiden tot hartfalen in muismodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflict verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Manon Laprise voor opleiding in echocardiografie en Ann Chamberland voor het nemen van de in de figuren 1 en 2 foto's. Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research subsidie MOP 44.363 en Canada Stoel 950-216684.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| Electrode gel | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| Ophthalmic gel | Novartis | Tear-Gel | |
| Depilatory cream | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| Hair clipper | |||
| Gauze/cotton swap | Q-tips | ||
| Permanent marker | |||
| High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz Transducer | Visual Sonics | RMV707B | |
| Imaging platform and physiology controller unit | Visual Sonics | ||
| Anesthetic System | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| Infrared heating lamp |
References
- Hoffman, J. I., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).
- Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and. 15, 165-176 (2003).
- Yu, Q., et al. ENU induced mutations causing congenital cardiovascular anomalies. Development. 131, 6211-6223 (2004).
- Seidah, N. G., Prat, A. The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 367-383 (2012).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Limited redundancy of the proprotein convertase furin in mouse liver. J. Biol. Chem. 279, 53442-53450 (2004).
- Kisanuki, Y. Y., et al. Tie2-Cre transgenic mice: a new model for endothelial cell-lineage analysis in vivo. Dev. Biol. 230, 230-242 (2001).
- Kim, W., et al. Loss of endothelial furin leads to cardiac malformation and early postnatal death. Mol. Cell Biol. 32, 3382-3391 (2012).
