Summary
Ultra-alta frecuencia de ultrasonido es una poderosa herramienta de imágenes en directo para examinar anormalidades cardíacas en animales pequeños. Su carácter no invasivo permite el mantenimiento del estado fisiológico de los embriones. En este documento, se muestra el uso del modo M ultrasonido para medir el ritmo cardíaco de los embriones en E18.5 en el útero.
Abstract
La cardiopatía congénita (CHD) es la causa infecciosa más frecuente de muerte en el nacimiento. La incidencia de la CHD oscila entre 4 y 50/1, 000 nacimientos (Enfermedad y estimaciones regionales de lesiones, Organización Mundial de la Salud, 2004). Se requieren cirugías que a menudo ponen en peligro la calidad de vida para corregir los defectos del corazón, que nos recuerda la importancia de encontrar las causas de las enfermedades del corazón. Modelos de ratones mutantes y la tecnología de imágenes en directo se han convertido en herramientas esenciales para el estudio de la etiología de esta enfermedad. Aunque los métodos avanzados permiten imágenes en vivo de los corazones anormales en los embriones, los estados fisiológicos y hemodinámicos de este último a menudo comprometida debido a los procedimientos quirúrgicos y / o prolongados. De imágenes por ultrasonido no invasiva, sin embargo, se puede utilizar sin exponer quirúrgicamente los embriones, manteniendo de ese modo su fisiología. Aquí, utilizamos sencilla ecografía en modo M para evaluar la frecuencia cardíaca de los embriones en E18.5 en el útero. La detección de las frecuencias cardíacas anormales es sin duda un buen indicadorTor de la disfunción del corazón y por lo tanto constituye un primer paso en la identificación de defectos de desarrollo que pueden conducir a insuficiencia cardiaca.
Introduction
CHD es la causa infecciosa más común de muerte al nacer 1. Cirugías múltiples a menudo son necesarios para corregir los defectos estructurales en sujetos cuya calidad de vida puede quedar comprometida 1. Los niños con CHD frecuentemente desarrollan trastornos neurológicos, incluso si no han sido sometidos a cirugía, lo que indica importantes consecuencias en el útero de 2,3 desarrollo. Ambos factores genéticos y ambientales, como la exposición a los virus o químicos (alcohol) durante el embarazo, la causa de CHD. El estudio de los contribuyentes genéticos se encuentra todavía en su fase inicial, pero está creciendo rápidamente. Para identificar estos contribuyentes y entender su papel en el desarrollo del corazón, fenotipo de los ratones mutantes con una herramienta sencilla y potente será altamente beneficioso.
Mouse es de hecho un modelo animal de elección para estudiar las enfermedades del corazón, y la mayoría de los casos humanos puede ser reproducida en ratones 4,5. En consecuencia, fetal de ratón fenotipificación cardiaca se ha convertido Increasingly importante investigar la etiología de las enfermedades del corazón humano y requiere de las herramientas adecuadas. Aunque los estudios histológicos de las muestras fijadas son invaluables, imágenes en tiempo real de los animales vivos es crucial para entender la fisiología del corazón. Microscopía de vídeo ofrece imágenes en vivo. Sin embargo, requiere una laparotomía para exponer embriones, comprometiendo de ese modo su estado fisiológico y hemodinámica. Recientemente, la ecocardiografía se ha convertido en la técnica de imagen estándar para evaluaciones cardíacas en la clínica, así como en ratones.
Ratón ecocardiografía fetal se realiza utilizando sistemas estándar de ultrasonido clínicos, así como los sistemas de ultrasonido ultra-alta frecuencia. Estos últimos proporcionan 30 MHz o transductores de frecuencias más altas que generan imágenes en dos dimensiones y permiten la evaluación de las etapas embrionarias tempranas. Estos transductores tienen una profundidad relativamente escasa penetración (~ 13 mm), que es, sin embargo, suficiente para obtener planos de imagen adecuados y determinar PA fundamental corazónparámetros, como la frecuencia cardíaca, el diámetro interno del ventrículo izquierdo y la derecha en la diástole y la sístole y el tabique y el espesor de la pared, sin necesidad de realizar una laparotomía.
En nuestro estudio, hemos utilizado un sistema de ultrasonido de frecuencia ultra alta para evaluar las tasas de corazón de embriones de ratón en el día E18.5 embrionarias. Elegimos un transductor de 30 MHz que proporciona un campo de visión de 20 mm x 20 mm, que es ideal dado el tamaño de los fetos, con una longitud focal de 12,7 mm. Sin embargo, un transductor de frecuencia más alta puede ser elegido para analizar las etapas de desarrollo anteriores. El modo M seleccionada permite la visualización de los tejidos en movimiento gracias a una alta resolución temporal de 1000 cuadros / seg. El procedimiento completo es simple y se debe realizar lo más rápidamente posible para evitar cualquier perturbación de los estados fisiológicos y hemodinámicos del feto. El análisis de alrededor de 8 embriones requiere aproximadamente 1 h.
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Protocol
Todos los procedimientos que se muestran en este protocolo ha sido aprobado por el Comité de Cuidado de Animales IRCM.
1. Sistema de ultrasonido y de la estación Preparación
- Iniciar el sistema de imágenes de ultrasonido y conectar el cabezal de exploración, así como la unidad de controlador de la fisiología de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1). Elegir programa de medición cardíaca y la cabeza de exploración que corresponde al transductor de 30 MHz.
- Llenar la boquilla del cabezal de exploración con agua desionizada. Evite las burbujas de aire ya que interfieren con la resolución de imagen. Coloque el cabezal de exploración con el lado de la manija arriba en su soporte cerca de la plataforma de formación de imágenes (Figura 1A).
- Desinfectar la plataforma de imágenes y zona de trabajo.
- Llene por completo la botella de gel de ultrasonido para evitar que se formen burbujas y colocarlo boca abajo en su conjunto recipiente de precalentamiento a 37 ° C (Figura 1B).
- Verificar los niveles de oxígenogeneración y el isoflurano y el sistema de tubos para la anestesia. Uno de los experimentos con embriones ~ 8 usaría aproximadamente 15 a 20 L de oxígeno.
- Coloque las botellas de bálsamo oftálmica, crema depilatoria y gel para electrodos cerca de la plataforma de imágenes (Figura 1B).
- Verifique que las funciones de la lámpara de calor infrarrojo. Durante el entrenamiento, establecer el nivel de calor, la posición de la lámpara y la distancia de la lámpara a ratones con el fin de mantener constante la temperatura corporal y el ritmo cardíaco.
Nota: La preparación adecuada del sistema y el material es crítica. Procedimientos largos pueden afectar a las características fisiológicas y hemodinámicas de los fetos como anestesia de larga deprime la función cardiaca mediante la reducción de la frecuencia cardíaca, la presión arterial y el nivel de oxigenación de la sangre-. El tiempo de tramitación de ~ 8 fetos (tamaño medio de la camada en ratones C57BL / 6) debe ser de aproximadamente 1 hora. Otras cepas de ratón pueden proporcionar un mayor número de fetos, posiblemente con un tamaño hembra de mayor tamaño. La formación es esencial para optimizar el processitiempo ng.
2. Preparación Ratón
- Anestesie la mujer embarazada en una cámara con suministro continuo de 2% de isoflurano en oxígeno (200 ml / min) hasta que se convierte en no responde.
- Coloque el ratón en la plataforma de imágenes en posición supina, ajuste el tubo para la inhalación continua de 1,5% de isoflurano en oxígeno (200 ml / min), y fijar el tubo de inhalación con cinta (Figura 2A). Anestesia suficientes deben ser confirmados durante el procedimiento por la postura relajada del ratón y la ausencia de respuesta a la cola y los pies pellizcos.
- Coloque gel de electrodos sólo en la parte superior izquierda y los cojines del electrodo inferior derecha (justo antes de la pierna y la pata trasera izquierda, también llamada posición de la derivación II) de la electrocardiografía. Plazo de entrega de la posición II proporciona un mejor onda P definido en posición vertical positivo y complejo QRS para determinar la frecuencia cardíaca. Asegure las cuatro patas a cada pad usando cinta (Figura 2A). Para prevenir la sequedad de los ojos, aplique 1 gota debálsamo oftálmica en cada ojo.
- Afeitar el abdomen desde el pecho hasta la vejiga con una cortadora de cabello. A continuación, aplicar la crema depilatoria durante 2 minutos y limpie con una gasa y / o un hisopo de algodón para eliminar cuidadosamente cualquier resto del cabello. Tenga cuidado de no cortar los pezones.
- Insertar el termómetro prelubricados con gel de electrodo en el recto de la hembra para supervisar la temperatura del cuerpo (debe mantenerse a 37 ± 0,5 ° C mediante el ajuste de una lámpara de calor infrarrojo colocado por encima de la plataforma). La frecuencia cardíaca debe ser de 450 ± 50 latidos / min (lpm). Tanto la temperatura y la frecuencia cardíaca se muestran en la unidad de control de la fisiología (Figura 1B).
Nota: Long anestesia, pérdida de cabello y el gel de ultrasonido (aunque precalentado) pueden conducir a la hipotermia, la cual puede afectar el ritmo cardiaco de la hembra. Si la temperatura del cuerpo cae por debajo de 36,5 ° C, detener el procedimiento y modificar la posición de la lámpara de calentamiento para ajustar la temperatura y la frecuencia cardíaca. Espere un par de minutos befmineral de proceder de nuevo.
3. Embrión de identificación
- Presione suavemente sobre el abdomen desnudo para localizar los embriones. Lenta y suavemente esparcirán al tener la mayoría de los embriones en una sola capa bajo la superficie abdominal. En cada cuerno uterino, sacos están linealmente conectados el uno al otro. Trate de respetar este orden cuando se propague.
- Marque cada embrión en el vientre desnudo de la mujer con un marcador permanente con su anterior / posterior y dorsal / ventral direcciones. Conociendo la orientación facilitará la localización de la corazón con la sonda. Número de los embriones en el derecho y cuernos izquierda a partir de la cérvix (1, 2, 3 ... y 1 ', 2', 3 '..., respectivamente; Figura 2B).
Nota: (i) Evitar la difusión de los embriones con una fuerza excesiva. Dibuje su ubicación en una hoja de papel para hacer un seguimiento de ellos (Figura 2 C). (Ii) de C57BL / 6 hembras tienen ~ 8 fetos por camada. Sin embargo, de 0-2 embriones en cada camada son lituado debajo de las demás, por lo que su imagen imposible. Excluir estos embriones a partir del análisis y evaluación más camadas si es necesario.
4. Medición de la frecuencia cardíaca
- Coloque una pequeña cantidad de gel de ultrasonido precalentado en el abdomen desnudo y extenderla uniformemente. Evite la formación de burbujas. Añadir una mayor cantidad de gel de (~ 5 ml) en el área específica de la imagen.
- Mantenga la sonda en contacto con la capa de gel de espesor (10 mm) y avanzar gradualmente la sonda hacia la piel mientras buscaba el corazón latiendo. Una vez que el corazón latiente se visualiza en la pantalla, ajuste el ángulo de la sonda a tener ambos ventrículos en su tamaño más grande en el plano de la imagen (Figura 2D).
- Comience la adquisición de imágenes. Con el antebrazo apoyado en la estación, coloque el transductor sobre el gel de ultrasonido para obtener una imagen en vivo en la pantalla de visualización (Figura 2D). El mantenimiento de la loma del transductor en la parte superior y haga clic en el orientatio cabeza del exploradorn marcador (en la esquina superior izquierda de la imagen) permite la coordinación del movimiento de la mano y el área visualizada en la pantalla.
- A partir de la cerviz, mueva al embrión más cercana marcada (1 ó 1 'en la trompa uterina derecha oa la izquierda, respectivamente) para visualizar el corazón que late en la pantalla. Debido a la profundidad focal es fija, mover suavemente la sonda hacia arriba / abajo y hacia los lados sin perder el contacto con el gel para obtener el plano de la imagen deseada.
- Coloque el corazón que late en el centro de la pantalla dentro de la región indicada por la línea discontinua de color amarillo que representa la zona de coordinación para mejor la adquisición de datos.
- Adquirir la grabación en vivo. Obtenga la imagen exploradora y reanudar la grabación (Figura 3A). Una vez obtenido un mínimo de 10 segundos de grabación estable, detener la grabación y guardar.
- Continúe con el siguiente embrión.
- Una vez que todos los embriones son analizados, pulse "Examinar" en el teclado para ver la lista de las grabaciones. Juega cada traci modo M grabadang y realizar mediciones múltiples (por lo menos 5 por rastreo) de la separación entre los picos adyacentes (ciclo de tiempo / flujo) para obtener el promedio del ritmo cardíaco (Figura 3B).
Nota: Algunos protocolos sugieren el uso de un soporte estacionario para la cabeza de exploración para evitar sacudidas. Sin embargo, se restringe el ángulo de análisis, por lo que la observación de embriones laterales difícil. También se ralentiza el análisis, ya que el soporte tiene que ser ajustado para cada embrión. La celebración de la cabeza de exploración, mientras que la solución del antebrazo en la estación minimiza eficazmente temblando. Se recomienda entrenamiento con 5 a 10 mujeres embarazadas para optimizar el resultado.
5. Genotipado
- El uso de tijeras y pinzas quirúrgicas limpias, incisión longitudinal en la piel y la capa muscular del abdomen. Localice los sacos en cada cuerno uterino y coinciden con los números. Corte y abra el saco vitelino para exponer el embrión en el orden utilizado anteriormente. Si no está en una disposición lineal, el dibujo de las posiciones de embriones en un pedazode papel será esencial una vez que las marcas en la piel ya no son visibles.
- Cortar sólo ~ 4 mm de la cola para la genotipificación como ADN genómico se extrae de manera muy eficiente de las colas embrionarias.
Nota: (i) El procedimiento quirúrgico puede tener que ser realizado en una ubicación separada de la sala de formación de imágenes. Sin embargo, es importante que no se mueva el ratón y tener el procedimiento quirúrgico en la plataforma de formación de imágenes con el fin de realizar un seguimiento de los embriones numerados. Consulte con el administrador de instalación de animales para optimizar el procedimiento quirúrgico. (Ii) La mujer embarazada muere rápidamente debido a la pérdida de sangre que se extraen los fetos para el genotipado después de la impresión. Después de cortar la cola, los fetos se colocan 3 min en hielo durante la anestesia por hipotermia y luego decapitados con unas tijeras, según lo recomendado por nuestro Comité de Cuidado de Animales.
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Representative Results
El método anterior se utilizó para evaluar el impacto de la presencia o ausencia de la furina serina proteasa en células endoteliales en las tasas de corazón de embriones de ratón en E18.5 en el útero. La furina pertenece a la familia de las convertasas de proproteína (PC) que los precursores de proteínas escinden después de los residuos básicos. La furina y sus sustratos son proteínas secretoras y la escisión pueden ocurrir en el aparato de Golgi, endosomas o en la superficie celular. Sustratos clave de furina incluyen TGFb, y factores TGFb-como, tales como las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) que juegan un papel importante en el desarrollo del corazón. Otros miembros de la familia de PC también pueden activar sustratos típicos de la furina mediante escisión in vitro 6. El papel fundamental y único de furina durante el desarrollo se evidencia por la temprana muerte de los embriones-furina deficiente en el día embrionario 11 7.
Debido a que muchos de los defectos exhibidos por embriones-furina deficiente sugiere una función importante defurina en las células endoteliales, se examinó el papel de la enzima en endotelial nocaut específico de las células (ECKO) ratones. furina flox / flox ratones que llevan alelos condicionales de flox el gen de Furin 8 se cruzaron con furina flox / + ratones que llevan un transgén en que la expresión de la recombinasa Cre es impulsado por el Tie2 promotor específico de células endoteliales 9. En las células endoteliales, Cre recombina dos sitios loxP que flanquean el exón 2 del gen de la furina, que codifica el péptido señal y parte de prosegmento, y de ese modo genera la furina alelos inactivados. recién nacidos Ecko mueren poco después del nacimiento, lo que confirma el papel esencial de la furina en el procesamiento de precursores de células endoteliales.
En el análisis de útero de las frecuencias cardíacas en embriones en E18.5 mostró que, aunque no heterocigotos, embriones Ecko sufrido taquicardia (frecuencia cardíaca elevados homocigotos; Figura 4 10.
Figura 1. Visión general de la configuración del sistema. Se muestra (A) sistema de ultrasonido ultra-alta frecuencia con la cabeza de exploración en su soporte. (B) La estación comprende un sistema de anestesia, la unidad y los materiales controlador fisiología. Clic k aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Mouse Set-up. (A) El ratón embarazada se coloca en posición supina con la oferta isoflurano y restringido en la plataforma con cinta adhesiva. (B) Después de la eliminación del vello abdominal, la ubicación de los embriones se marca en el abdomen o (C) esbozado en un papel. (D) El plano de imagen deseado se obtiene moviendo el cabezal de exploración que permanece en contacto con el gel de ultrasonido. El antebrazo se coloca de forma segura en la estación para evitar sacudidas. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
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Figura 3. Evaluación de representación de la frecuencia cardíaca. (A) Una imagen de ecocardiografía bidimensional de un corazón embrionario en E18.5 se obtiene al colocar dentro de la zona focal centrada en la línea de trazos de color amarillo. Los dos ventrículos están indicadas por flechas. VI, del ventrículo izquierdo; VD: ventrículo derecho. (B) La frecuencia cardíaca se calcula a partir de mediciones repetidas entre los ciclos de flujo adyacentes en modo M rastreo. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. Análisis de los datos representativos de la frecuencia cardiaca. En la ecocardiografía útero (modo M) de 9 WT y 7 ECKO corazones en E18.5 de embriones se realizó utilizando un transductor de 30 MHz. Estos embriones wERE obtenido en 3 camadas independientes. P <0,0005 (***) se determinó mediante la prueba t y bares de Student de dos colas representan la media ± SEM. WT, transgén negativo Furina flox / + o furina ratones flox / flox;. Ecko, furina flox / flox Tg (Tie2-cre) + / 0 ratones Haz click aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
Ecocardiografía en modo M es un método eficaz y sencillo para medir la frecuencia cardíaca en el útero de los embriones de ratón. Transductores disponibles en el mercado proporcionan suficiente resolución para visualizar pequeños corazones latiendo. Por lo tanto, permiten una medición de la frecuencia cardíaca de alta precisión, en comparación con otros métodos tales como la medición del pulso, y pueden sustituir de vídeo microscopía de alta resolución. Sin embargo, las herramientas actuales no permiten el análisis simultáneo de todos los embriones, lo que implica un procedimiento tedioso para visualizar cada uno de los embriones. Además, el campo relativamente estrecho de vista y la ausencia de profundidad de campo (2D-imagen) requieren un ajuste manual sólo logrado por manos entrenadas. De hecho, una formación adecuada puede maximizar en gran medida la eficacia de este método.
En mediciones in vivo de las tasas de corazón embrionarias (E18.5) ofrece una evaluación fisiológica de la función del corazón por una formación de imágenes en vivo no invasiva como, diferente de los métodos anteriores, que haceno requiere laparotomía. En lugar de ello, marcar la posición de los embriones en el abdomen de la hembra embarazada asegura un seguimiento adecuado y conserva su estado fisiológico. Por lo tanto, el procedimiento supera la principal debilidad de otras tecnologías de la imagen, como la tomografía computarizada y la resonancia magnética. Por último, pero no menos importante, este método es menos costoso.
Unos pocos pasos críticos en este método incluyen mantener la temperatura corporal y el ritmo cardíaco del ratón embarazada estables mediante el ajuste de la posición de la lámpara de calentamiento y la generación de una tasa adecuada de isoflurano para mantener el estado fisiológico de embriones y adquirir datos fiables. Procediendo de una manera consistente y en el menor tiempo posible es esencial. Por lo tanto, es muy recomendable mantener el procedimiento simple y practicar antes de proceder.
En conclusión, ecocardiografía en modo M es un método efectivo para evaluar las tasas de corazón embrionario en el útero. Anomalíasritmos cardíacos normales son indicativos de disfunción del corazón y el método descrito permitirán especialistas, así como los no especialistas, para la detección de defectos de desarrollo que conducen a la insuficiencia cardíaca en modelos de ratón.
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Disclosures
Ningún conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a Manon Laprise para la formación en ecocardiografía y Ann Chamberland para tomar las fotos que se muestran en las figuras 1 y 2. Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de subvención MOP 44363 y Canadá Cátedra de 950 a 216.684.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| Electrode gel | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| Ophthalmic gel | Novartis | Tear-Gel | |
| Depilatory cream | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| Hair clipper | |||
| Gauze/cotton swap | Q-tips | ||
| Permanent marker | |||
| High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz Transducer | Visual Sonics | RMV707B | |
| Imaging platform and physiology controller unit | Visual Sonics | ||
| Anesthetic System | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| Infrared heating lamp |
References
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- Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).
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