Summary
Ultra-høy frekvens ultralyd er en kraftig direkte avbildning verktøy for å undersøke hjertefeil i små dyr. Dens noninvasiveness kan opprettholde fysiologisk tilstand av embryoer. Heri, vi viser bruk av M-modus ultralyd for å måle hjertefrekvens for embryoer ved E18.5 in utero.
Abstract
Medfødt hjertesykdom (CHD) er den hyppigste infeksiøs dødsårsaken ved fødselen. Forekomsten av CHD varierer fra 4 til 50/1, 000 fødsler (sykdom og skade regionale anslag, World Health Organization, 2004). Operasjoner som ofte kompromiss livskvalitet er pålagt å korrigere hjertefeil, og minner oss om viktigheten av å finne årsakene til CHD. Mutant musemodeller og levende bildeteknologi har blitt viktige verktøy for å studere etiologi av denne sykdommen. Selv avanserte metoder tillate direkte avbildning av unormale hjerter i embryoer, er de fysiologiske og hemodynamiske tilstander av sistnevnte ofte kompromittert på grunn av kirurgiske og / eller omstendelige prosedyrer. Ikke-invasiv ultralydavbildning, men kan benyttes uten kirurgisk eksponering av embryoene, og derved opprettholde deres fysiologi. Heri, bruker vi enkle M-modus ultralyd for å vurdere hjertefrekvenser av embryoer ved E18.5 in utero. Påvisning av unormal hjerterytme er faktisk en god indikasjontor av dysfunksjon av hjertet og dermed utgjør et første skritt i identifisering av utviklingsmessige defekter som kan føre til hjertesvikt.
Introduction
CHD er den vanligste dødsårsak infeksiøs ved fødsel 1.. Flere operasjoner er ofte nødvendig for å rette opp de strukturelle defekter i fag hvis livskvalitet kan forbli kompromittert en. Barn med CHD ofte utvikle nevrologiske lidelser, selv om de ikke har gjennomgått kirurgi, noe som indikerer viktig in utero konsekvenser for utviklingen 2,3. Både genetiske og miljømessige faktorer, som for eksempel eksponering for virus eller kjemikalier (alkohol) under graviditet, føre CHD. Å studere genetiske bidragsytere er fortsatt på sitt tidlig fase, men vokser raskt. For å identifisere disse bidragsytere og forstå sin rolle i hjerte utvikling, fenotyping muterte musene med et enkelt og kraftig verktøy vil være svært gunstig.
Mus er faktisk en dyremodell for valg å studere CHD, og mesteparten av den menneskelige tilfeller kan gjengis i mus 4,5. Derfor har fosterets mus hjerte phenotyping bli increasingly viktig å undersøke etiologien av menneskelig CHD og krever tilstrekkelig verktøy. Selv histologiske undersøkelser på faste prøver er uvurderlig, er sanntids avbildning av levende dyr avgjørende å forstå fysiologi av hjertet. Video mikros tilbyr live bildebehandling. Men, det krever laparotomi å eksponere embryoer, og dermed svekke deres fysiologiske og hemodynamisk tilstand. Nylig har ekkokardiografi blitt standard avbildningsteknikk for hjerteundersøkelser i klinikken, så vel som hos mus.
Mus fetal ekkokardiografi er utført ved hjelp av standard kliniske ultralydsystemer, samt ultra-høyfrekvente ultralydsystemer. Sistnevnte gir 30 MHz eller høyere frekvens transdusere som genererer to-dimensjonale bilder og tillater vurdering av tidlige embryonale stadier. Disse transdusere har en relativt dårlig inntrengningsdybde (~ 13 mm), som er imidlertid tilstrekkelig til å oppnå tilfredsstillende bildeplan, og å bestemme grunnleggende hjerte paparametere, som hjertefrekvens, venstre og høyre ventrikkel indre diameter på diastole og systole og septum og veggtykkelse, uten å utføre laparotomi.
I vår studie har vi brukt en ultra-høy frekvens ultralyd system for å vurdere hjertefrekvenser av mus embryoer på embryonale dag E18.5. Vi har valgt en 30 MHz transduser som gir et synsfelt på 20 mm x 20 mm, noe som gjør det gitt størrelsen på fostrene, med en brennvidde på 12,7 mm. Imidlertid kan en høyere frekvens transduser være valgt for å analysere tidligere utviklingsstadier. Den valgte M-modus lar visualisering av vev i bevegelse takket være en høy tidsoppløsning på 1000 bilder / sek. Den fullstendige prosedyren er enkel og bør utføres så raskt som mulig for å unngå forstyrrelse av de fysiologiske og hemodynamiske tilstander hos fosteret. Analysen av ca 8 embryoer krever omtrent 1 time.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som vises i denne protokollen har blitt godkjent av IRCM Animal Care Committee.
En. Ultralyd System og Station Forberedelse
- Start ultralyd imaging system og koble proben samt fysiologi kontrollerenhet i henhold til produsentens instruksjoner (Figur 1). Velg Cardiac Measurement Program og proben som tilsvarer 30 MHz svinger.
- Fyll revolveren av proben med avionisert vann. Unngå luftbobler som de forstyrrer bildeoppløsning. Plasser proben med håndtakssiden opp på holderen nær bildebehandling plattformen (figur 1A).
- Desinfiser bildebehandling plattform og arbeidsområde.
- Fyll helt flasken av ultralyd gel for å unngå dannelse av bobler og legg den opp ned i sin prewarming container satt til 37 ° C (Figur 1B).
- Kontroller nivåene av oksygengen og isofluran og rørsystem for anestesi. Ett eksperiment med ~ 8 embryoer ville bruke ca 15-20 L oksygen.
- Plasser flaskene med oftalmisk balsam, hårfjerningskrem og elektrode gel nær bildebehandling plattform (Figur 1B).
- Verifisere at infrarød varme lampe funksjoner. Under trening, angir nivået varme, stillingen av lampen, og avstanden fra lyskilden til mus for å opprettholde konstant kroppstemperatur og hjertefrekvens.
Merk: Riktig klargjøring av systemet og materialet er kritisk. Omstendelige prosedyrer kan påvirke fysiologiske og hemodynamiske karakteristikker av fostre så lenge anestesi presser hjertefunksjon ved å senke puls, blodtrykk og blodoksygene nivå. Behandlingstiden for ~ 8 fostre (gjennomsnittlig kullstørrelse i C57BL / 6) bør være ca 1 time. Andre musestammer kan gi et høyere antall fostere, eventuelt med en større kvinnelig størrelse. Trening er viktig for å optimalisere behandlingenng tid.
2. Mus Forberedelse
- Anesthetize gravid kvinne i et kammer med kontinuerlig tilførsel av 2% isofluran i oksygen (200 ml / min) inntil det blir nonresponsive.
- Plasser musen på bildebehandling plattformen i en liggende stilling, justere slangen for kontinuerlig inhalasjon av 1,5% isofluran i oksygen (200 ml / min), og fikse innånding røret med tape (Figur 2A). Tilstrekkelig anestesi bør bli bekreftet i løpet av prosedyren ved den avslappede holdning av musen og fraværet av noen reaksjon på halen og tå klyper.
- Place elektrode gel bare på venstre topp og høyre bunn elektrodene (høyre forgrunnen ben og venstre bakben, også kalt bly II stilling) for EKG. Lead II stilling gir bedre definert oppreist positiv P-bølge og QRS-komplekset å fastslå hjertefrekvensen. Fest de fire potene til hver pad bruke tape (Figur 2A). For å hindre tørrhet i øyne, anvende en dråpeophthalmic balsam i hvert øye.
- Barbere magen fra brystet til blæren med en hårklipperen. Da gjelder Hårfjerningskrem for 2 min og tørke det av med gasbind og / eller bomullspinne til å forsiktig fjerne eventuelle gjenværende hår. Vær forsiktig med å skjære brystvortene.
- Sett termometer prelubricated med elektroden gel inn i kvinnens rektum for å overvåke kroppstemperatur (bør opprettholdes ved 37 ± 0,5 ° C ved å justere en infrarød varmelampe plasseres over plattformen). Hjertefrekvensen skal være 450 ± 50 slag / min (bpm). Både temperatur og puls er vist på fysiologi kontrollerenhet (figur 1B).
Merk: Lang anesthetization, håravfall og ultralyd gel (selv prewarmed) kan føre til hypotermi, som kan påvirke kvinnens puls. Hvis kroppstemperaturen synker under 36,5 ° C, slutt prosedyren og endre posisjonen til varmelampe for å justere temperaturen og hjertefrekvensen. Vent et par minutter BEFmalm går igjen.
Tre. Embryo Identifikasjon
- Trykk forsiktig ned på den nakne magen for å finne fostre. Sakte og forsiktig spre dem ut for å ha det meste av embryoer i et enkelt lag under bukhinnen. I hvert livmorhorn, er blærer lineært forbundet med hverandre. Prøv å respektere denne rekkefølgen ved spredning.
- Mark hvert embryo på den nakne magen av den kvinnelige med en permanent markør med sin anterior / posterior og rygg / ventral retninger. Å vite retningen vil lette lokalisering hjertet med sonden. Antall embryoer i høyre og venstre horn med start fra livmorhalsen (1, 2, 3 ..., 1 ', 2', 3 '... henholdsvis figur 2B).
Merk: (i) Unngå å spre embryoene med stor kraft. Skisser denne posisjonen på et stykke papir for å spore dem (figur 2C). (Ii) C57BL / 6 kvinner har ~ 8 fostre per kull. Men 0-2 embryoene i hvert kull er located under de andre, noe som gjør deres bildebehandling umulig. Ekskludere disse embryoer fra analysen og vurdere flere kull hvis nødvendig.
4. Pulsmåling
- Plasser en liten mengde prewarmed ultralyd gel på den nakne magen og spre den jevnt. Unngå bobledannelse. Legg til en større mengde gel (~ 5 ml) av den spesifikke området for bildet.
- Hold sonden i kontakt med den tykke gel lag (10 mm) og gradvis bevege sonden mot huden samtidig som leter etter det bankende hjertet. Når det bankende hjertet visualiseres på skjermen, justere vinkelen på sonden å ha begge ventriklene i deres største størrelse i bildeplanet (figur 2D).
- Begynn å anskaffe image. Med underarmen hviler på stasjonen, plasserer svingeren på ultralyd gel for å få et levende bilde på visningsskjermen (figur 2D). Vedlike ryggen av svingeren på toppen og klikke proben orienteringenn markør (i venstre hjørne av bildet) la koordinering av håndbevegelser og området visualiseres på skjermen.
- Starter fra livmorhalsen, gå til nærmeste embryo merket (1 eller 1 "i høyre eller venstre livmor horn, henholdsvis) for å visualisere det bankende hjertet på skjermen. Ettersom focal dybde er fast, lett bevege sonde opp / ned og sideveis, uten å miste kontakt med gelen for å oppnå den ønskede bildeplan.
- Plasser det bankende hjertet i sentrum av skjermen innenfor området angitt av den gule stiplede linjen representerer midtsone for bedre datainnsamling.
- Skaff deg liveopptak. Skaff speider bilde og gjenoppta innspillingen (figur 3A). Når en minimum 10 sek stabil opptak oppnås, stoppe innspillingen og lagre.
- Gå videre til neste embryo.
- Når alle embryoene er analysert, trykker du på "Browse" på tastaturet for å vise listen over opptakene. Spill hvert innspilt M-modus tracing og utføre flere målinger (minst fem pr tracing) av avstanden mellom tilstøtende topper (time / syklus) strømning for å oppnå den gjennomsnittlige hjertefrekvensen (figur 3B).
Merk: Noen protokoller foreslå å bruke en stasjonær stativ for proben for å unngå risting. Imidlertid begrenser den vinkel analyse, noe som gjør observasjonen av lateral embryoer vanskelig. Det også bremser ned analysen, som stativet må justeres for hver embryo. Holder sensorhodet mens settling underarmen på stasjonen effektivt minimerer risting. Trening med 5-10 gravide kvinner anbefales å optimalisere resultatet.
5. Genotyping
- Bruk rene kirurgiske saks og pinsett, incise lengde hud og muskel lag av magen. Finn sacs i hver livmor horn og matche tallene. Skjær åpne plommesekken å utsette fosteret i den rekkefølgen som brukes ovenfor. Dersom den ikke er i et lineært arrangement, skissen av embryoet posisjoner på et stykkeav papir vil være avgjørende når de merker på huden ikke lenger er synlige.
- Kutt bare ~ 4 mm av halen for genotyping som genomisk DNA er svært effektivt hentet fra embryonale haler.
Bemerk: (i) Den kirurgiske prosedyren kan ha til å bli utført i et separat sted fra avbildningsrommet. Men det er viktig ikke å flytte musen, og har den kirurgiske prosedyren på bildebehandling plattformen for å holde styr på de nummererte embryoer. Rådfør dyret anlegget manager for å optimalisere den kirurgiske prosedyren. (Ii) Den gravide kvinne dør raskt på grunn av blodtap som fostrene blir fjernet for genotyping etter bildebehandling. Etter halen kuttet, er fostre plassert tre minutter på isen for anestesi ved nedkjøling og deretter halshugget med saks, som anbefalt av vår Animal Care Committee.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovennevnte metode ble brukt til å vurdere effekten av tilstedeværelse eller fravær av serin protease Furin i endotelceller på hjertefrekvens for mus embryoer ved E18.5 in utero. Furin tilhører familien av proprotein convertases (PC) at Cleave protein forløpere etter grunnleggende rester. Furin og dens substrater er sekretoriske proteiner og spalting kan skje i Golgi-apparatet, endosomer eller på celleoverflaten. Nøkkel substrater av Furin inkluderer TGFb, og TGFb-lignende faktorer, som for eksempel de Benmorfogenetiske proteiner (BMP) som spiller en viktig rolle i hjerte utvikling. Andre medlemmer av PC familien kan også aktivere typiske substrater av Furin ved in vitro cleavage seks. Nøkkelen og unik rolle Furin under utvikling er dokumentert av den tidlige død Furin-mangel embryoer på embryonale dag 11 7.
Fordi mange av feilene utstilt ved Furin-mangel embryoer foreslo en viktig funksjonFurin i endotelceller, ble rollen av enzymet undersøkt i endotelceller spesifikke knockout (Ecko) mus. Furin FLOX / FLOX mus som bærer betingede FLOX alleler av Furin genet 8 ble krysset med Furin FLOX / + mus som bærer et transgen i hvor ekspresjonen av Cre rekombinase blir drevet av endotelcelle-spesifikt Tie2 promoter 9.. I endotelceller, rekombinerer Cre to loxP områder som flankerer exon 2 av Furin genet, som koder for signal peptid og en del av prosegment, og derved genererer inaktiv Furin alleler. Ecko nyfødte dør kort tid etter fødselen, noe som bekrefter den avgjørende rollen Furin i behandlingen av endotelcelle forløpere.
I utero analyse av hjertefrekvenser i embryoer ved E18.5 viste at homozygot, men ikke heterozygot, Ecko embryo led av takykardi (forhøyet hjerterytme; Figur 4 10.
Figur 1. Oversikt over systemoppsett (A) Ultra-høyfrekvente ultralydsystem med proben i holderen vises.. (B) Stasjonen omfatter en narkosesystemet, fysiologi kontrollerenheten og materialer. Clic k her for å se større bilde.
Figur 2. Muse-oppsett. (A) Den gravide mus blir plassert i ryggleie med isofluran tilførsel og behersket på plattformen med tape. (B) Etter mage hårfjerning, er plasseringen av embryoer markert på magen eller (C) skisserte på et papir. (D) Den ønskede avbildningsplanet blir oppnådd ved å flytte sensorhodet, som forblir i kontakt med en gel. Underarmen er trygt plassert på stasjonen for å unngå risting. Klikk her for å se større bilde .
jpg "width =" 500px "/>
Figur 3. Representative vurdering av hjertefrekvensen. (A) En to-dimensjonal ekkokardiografi bilde av en embryonisk hjerte E18.5 ble oppnådd ved å plassere det i det sentrale sone sentrert på den gule stiplet linje. De to ventriklene er angitt ved piler. LV, venstre ventrikkel, RV, høyre ventrikkel. (B) Pulsen er beregnet fra gjentatte målinger mellom tilstøtende strømnings sykluser i M-modus tracing. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Representative data analyse av hjerterytmen. In utero ekkokardiografi (M-modus) av 9 WT og 7 Ecko embryo hjerter på E18.5 ble utført ved hjelp av en 30 MHz svinger. Disse embryoene were oppnådd i tre uavhengige kull. P <0,0005 (***) ble bestemt ved en tosidig Student t-test, og søylene representerer den midlere + SEM. WT, transgenet negative Furin FLOX / + eller Furin FLOX / FLOX mus;. Ecko, Furin FLOX / FLOX Tg (Tie2-cre) + / 0 mus Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
M-mode ekkokardiografi er en effektiv og enkel metode for å måle in utero hjertefrekvens for mus embryoer. Kommersielt tilgjengelige transdusere gi tilstrekkelig oppløsning til å visualisere små bankende hjerter. Således, de tillater en meget nøyaktig måling av hjertefrekvensen, i forhold til andre metoder som for eksempel pulsmålinger, og kan erstatte høy oppløsning videomikroskopi. Men gjør dagens verktøy ikke la samtidig analyse av alle befruktede egg, noe som tyder på en langtekkelig prosedyre for å visualisere hver av embryoer. I tillegg er den relativt smalt synsfelt og fravær av dybdeskarphet (2D-bilde) krever en manuell justering bare oppnås ved trent hender. Faktisk kan en riktig trening sterkt maksimere effektiviteten av denne fremgangsmåte.
In vivo målinger av embryonale hjerte priser (E18.5) tilbyr en fysiologisk vurdering av hjertefunksjon etter en ikke-invasiv direkte avbildning som, forskjellig fra tidligere metoder, gjør detikke krever laparotomi. I stedet angir posisjonen av embryoene på magen til den gravide kvinne sikrer en riktig sporing og bevarer deres fysiologiske tilstand. Dermed seirer prosedyren den store svakheten i andre bildebehandlingsteknologier, for eksempel computertomografi og magnetisk resonans imaging. Sist men ikke minst, er denne metoden mindre kostnadskrevende.
Noen få kritiske trinn i denne fremgangsmåte omfatter å holde kroppstemperaturen og puls av den gravide mus stabil ved å justere posisjonen til den varmelampe og generere en passende rate av isofluran for å opprettholde den fysiologiske tilstand av embryoer og skaffe pålitelige data. Fortsetter på en konsistent måte og på kortest mulig tid er avgjørende. Derfor holder prosedyren enkel og øve før du fortsetter på det sterkeste.
I konklusjonen, er M-modus ekkokardiografi en effektiv metode for å vurdere embryonale hjerterytme in utero. Uregelmessigheter harmal hjertefrekvenser er tegn på hjertefunksjon og fremgangsmåten som er beskrevet gjør det mulig spesialister, samt nonspecialists, for å screene for utviklingsdefekter som fører til hjertesvikt i musemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikt erklært.
Acknowledgments
Vi takker Manon Laprise for opplæring i ekkokardiografi og Ann Chamber for å ta bildene vist i figur 1 og 2. Dette arbeidet ble støttet av kanadiske Institutes of Health Research stipend MOP 44363 og Canada Chair 950-216684.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| Electrode gel | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| Ophthalmic gel | Novartis | Tear-Gel | |
| Depilatory cream | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| Hair clipper | |||
| Gauze/cotton swap | Q-tips | ||
| Permanent marker | |||
| High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz Transducer | Visual Sonics | RMV707B | |
| Imaging platform and physiology controller unit | Visual Sonics | ||
| Anesthetic System | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| Infrared heating lamp |
References
- Hoffman, J. I., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).
- Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and. 15, 165-176 (2003).
- Yu, Q., et al. ENU induced mutations causing congenital cardiovascular anomalies. Development. 131, 6211-6223 (2004).
- Seidah, N. G., Prat, A. The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 367-383 (2012).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Limited redundancy of the proprotein convertase furin in mouse liver. J. Biol. Chem. 279, 53442-53450 (2004).
- Kisanuki, Y. Y., et al. Tie2-Cre transgenic mice: a new model for endothelial cell-lineage analysis in vivo. Dev. Biol. 230, 230-242 (2001).
- Kim, W., et al. Loss of endothelial furin leads to cardiac malformation and early postnatal death. Mol. Cell Biol. 32, 3382-3391 (2012).
