Summary
Ultra-alta freqüência ultra-som é uma ferramenta de imagem ao vivo poderoso para examinar anormalidades cardíacas em pequenos animais. Sua noninvasiveness permite manter o estado fisiológico de embriões. Aqui, vamos mostrar o uso do M-modo ultra-som para medir os batimentos cardíacos de embriões em E18.5 no útero.
Abstract
A doença cardíaca congênita (DCC) é a causa não infecciosa mais freqüente de morte ao nascer. A incidência de doença coronariana varia de 4 a 50/1, 000 nascimentos (doença e estimativas regionais lesão, Organização Mundial da Saúde, 2004). Cirurgias que muitas vezes comprometem a qualidade de vida são necessárias para corrigir defeitos do coração, lembrando-nos da importância de encontrar as causas da doença coronariana. Modelos de ratos mutantes e tecnologia de imagem ao vivo tornaram-se ferramentas essenciais para o estudo da etiologia da doença. Embora os métodos avançados permitem imagens ao vivo de corações anormais em embriões, os estados fisiológicos e hemodinâmicos destes últimos são muitas vezes comprometida devido a procedimentos cirúrgicos e / ou prolongados. Imagiologia de ultra-sons não-invasivo, no entanto, pode ser usado sem expondo cirurgicamente os embriões, mantendo assim a sua fisiologia. Aqui, nós usamos simples ultrassom modo-M para avaliar a freqüência cardíaca de embriões em E18.5 no útero. A detecção de ritmos cardíacos anormais é realmente uma boa indicator de disfunção do coração e, portanto, constitui uma primeira etapa na identificação de defeitos de desenvolvimento que podem levar a insuficiência cardíaca.
Introduction
CHD é a causa não infecciosa mais comum de morte no nascimento 1. Várias cirurgias são muitas vezes necessárias para corrigir as deficiências estruturais em indivíduos cuja qualidade de vida pode ficar comprometida 1. Crianças com CHD freqüentemente desenvolvem distúrbios neurológicos, mesmo que não tenham sido submetidos a cirurgia, indicando importante em conseqüências útero em desenvolvimento 2,3. Ambos os fatores genéticos e ambientais, como a exposição a vírus ou produtos químicos (álcool) durante a gravidez, causa CHD. Estudar os contribuintes genéticos ainda está em sua fase inicial, mas crescendo rapidamente. Para identificar esses contribuintes e compreender o seu papel no desenvolvimento do coração, fenotipagem ratos mutantes com uma ferramenta simples e poderosa será altamente benéfico.
Mouse é na verdade um modelo animal de escolha para estudar CHD, ea maioria dos casos humanos podem ser reproduzidas em camundongos 4,5. Consequentemente, rato fetal fenotipagem cardíaca tornou-se increasingly importante investigar a etiologia da doença coronária humana e requer ferramentas adequadas. Embora os estudos histológicos em espécimes fixados são de valor inestimável, imagens em tempo real de animais vivos é crucial para compreender a fisiologia do coração. Microscopia de vídeo oferece imagens ao vivo. No entanto, requer laparotomia para expor os embriões, comprometendo assim o seu estado fisiológico e hemodinâmico. Recentemente, tornou-se a ecocardiografia técnica de imagem padrão para as avaliações cardíacas na clínica, bem como em ratinhos.
Rato ecocardiografia fetal é realizado com sistemas de ultra-som clínicos padrão, bem como sistemas de ultra-som ultra-alta freqüência. O último fornecer 30 MHz ou transdutores de frequências mais altas que geram imagens bidimensionais e permitem a avaliação das fases embrionárias precoces. Estes transdutores tem uma profundidade de penetração relativamente pobre (~ 13 mm), o que é, no entanto, suficiente para obter planos de imagiologia adequadas e determinar aa medula fundamentaltros, como a frequência cardíaca, o diâmetro interno do ventrículo esquerdo e direito na diástole e sístole e septo e espessura da parede, sem a realização de laparotomia.
Em nosso estudo, nós usamos um sistema de ultra-som ultra-alta freqüência para avaliar a freqüência cardíaca de embriões de camundongos em E18.5 dia embrionário. Escolhemos um transdutor de 30 MHz, que proporciona um campo de visão de 20 mm x 20 mm, o que é ideal, dado o tamanho dos fetos, com uma distância focal de 12,7 mm. No entanto, um transdutor de frequência mais elevada pode ser escolhida para analisar as fases precoces do desenvolvimento. O M-modo selecionado permite a visualização de tecidos em movimento, graças a uma alta resolução temporal de 1000 frames / seg. O procedimento completo é simples e deve ser realizado tão rapidamente quanto possível para evitar qualquer perturbação dos estados fisiológicos e hemodinâmicos do feto. A análise de embriões de cerca de 8 exige cerca de 1 hora.
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Protocol
Todos os procedimentos mostrados neste protocolo ter sido aprovado pelo Comitê Animal Care a IRCM.
1. O ultra-som do sistema e estação de preparação
- Inicie o sistema de imagiologia de ultra-sons e ligar a cabeça da sonda, assim como a unidade controladora da fisiologia de acordo com as instruções do fabricante (Figura 1). Escolha cardíaca Programa de medição e a cabeça da sonda que corresponde ao transdutor 30 MHz.
- Encha o revólver da cabeça da sonda com água deionizada. Evite bolhas de ar como eles interferem com resolução de imagem. Coloque a cabeça da sonda, com o lado da pega para cima no respectivo suporte, perto da plataforma de imagem (Figura 1A).
- Desinfetar a plataforma de imagem e área de trabalho.
- Preencha completamente o frasco de gel de ultra-som para evitar a formação de bolhas e colocá-lo de cabeça para baixo em seu conjunto recipiente pré-aquecimento de 37 ° C (Figura 1B).
- Verifique os níveis de oxigen e isoflurano e do sistema de tubulação para a anestesia. Um experimento com ~ 8 embriões usaria cerca de 15-20 L de oxigênio.
- Colocar os frascos de bálsamo oftálmica, creme depilatório e gel de eléctrodo próximo da plataforma de imagem (Figura 1B).
- Verifique se as funções da lâmpada de calor infravermelho. Durante o treino, definir o nível de temperatura, a posição da luz e da distância da lâmpada para ratinhos, a fim de manter a temperatura corporal constante e frequência cardíaca.
Nota: A preparação adequada do sistema e o material é crítica. A morosidade dos processos pode afetar as características fisiológicas e hemodinâmicas de fetos como anestesia longo deprime a função cardíaca, diminuindo a freqüência cardíaca, pressão arterial e nível de sangue-oxigenação. O tempo de processamento para ~ 8 fetos (tamanho médio das ninhadas em C57BL / 6) deve ser de aproximadamente 1 hora. Outras estirpes de ratos pode fornecer um maior número de fetos, possivelmente, com um tamanho maior do sexo feminino. A formação é essencial para otimizar o processitempo ng.
2. Rato Preparação
- Anestesiar a fêmea grávida numa câmara com o fornecimento contínuo de 2% de isoflurano em oxigénio (200 ml / min) até que se torne não responsivas.
- Posicione o mouse sobre a plataforma de imagem em decúbito dorsal, ajuste o tubo por inalação contínua de 1,5% de isoflurano em oxigênio (200 ml / min), e fixar o tubo de inalação com fita adesiva (Figura 2A). Anestesia suficientes deve ser confirmado durante o procedimento pela postura relaxada do mouse e na ausência de qualquer resposta a cauda e pés beliscões.
- Gel Lugar eletrodo apenas no canto superior esquerdo e inferior direito almofadas de eletrodo (direita antes perna e perna esquerda, também chamada de posição II chumbo) para eletrocardiografia. Chumbo posição II proporciona melhor onda P definido na vertical positivo e complexo QRS para determinar a freqüência cardíaca. Fixar as quatro patas para cada bloco utilizando uma fita (Figura 2A). Para prevenir o ressecamento dos olhos, aplique uma gota debálsamo oftálmica em cada olho.
- Raspar o abdômen do tórax para bexiga com uma máquina de cortar cabelo. Em seguida, aplique o creme depilatório para 2 min e limpe-a com gaze e / ou cotonete para remover cuidadosamente qualquer cabelo restante. Tenha cuidado para não cortar os mamilos.
- Inserir o termómetro pré-lubrificadas com gel de eléctrodo no reto da fêmea para monitorar a temperatura corporal (deve ser mantida a 37 ± 0,5 ° C por ajuste de uma lâmpada de aquecimento de infravermelhos colocados acima da plataforma). A freqüência cardíaca deve ser de 450 ± 50 batimentos / minuto (bpm). Tanto a temperatura e freqüência cardíaca são exibidos na unidade controladora fisiologia (Figura 1B).
Nota: Longa anesthetization, perda de cabelo e gel de ultra-som (embora pré-aquecido) pode levar a hipotermia, o que pode afetar a frequência cardíaca do feminino. Se a temperatura do corpo cai abaixo de 36,5 ° C, parar o processo e modificar a posição da lâmpada de aquecimento para regular a temperatura e a frequência cardíaca. Espere alguns minutos befminério de proceder novamente.
3. Embrião de Identificação
- Pressione levemente para baixo no abdômen nu para localizar os embriões. Lenta e levemente espalhá-los para fora para ter a maioria dos embriões em uma única camada sob a superfície abdominal. Em cada corno uterino, os sacos são linearmente ligados uns aos outros. Tente respeitar essa ordem quando se espalhando.
- Mark cada embrião no abdômen nu da fêmea com um marcador permanente com o seu anterior / posterior e dorsal / ventral direções. Conhecer a orientação facilitará a localização do coração com a sonda. Número de embriões em lados direito e esquerdo a partir de colo do útero (1, 2, 3 ... e 1 ', 2', 3 '..., respectivamente; Figura 2B).
Nota: (i) evitar a propagação da embriões com força excessiva. Desenhe suas localizações em um pedaço de papel de controlá-los (Figura 2C). (Ii) C57BL / 6 fêmeas têm ~ 8 fetos por ninhada. No entanto, 0-2 embriões em cada ninhada são localizado abaixo dos outros, tornando a sua imagem impossível. Excluir esses embriões a partir da análise e avaliação mais ninhadas, se necessário.
4. Medição de freqüência cardíaca
- Coloque uma pequena quantidade de gel de ultra-som pré-aquecido no abdômen nu e espalhe uniformemente. Evite a formação de bolhas. Adicionar uma quantidade maior de gel (~ 5 ml) sobre a área específica para a imagem.
- Segure a sonda em contato com a camada de gel de espessura (10 mm) e gradualmente mover a sonda em direção à pele ao olhar para o coração batendo. Uma vez que o coração é visualizado no ecrã, ajustar o ângulo da sonda para ter ambos os ventrículos na sua maior dimensão no plano de imagem (Figura 2D).
- Comece a aquisição de imagem. Com o antebraço repousando sobre a estação, coloque o transdutor de ultra-som sobre o gel para obter uma imagem ao vivo na tela de visualização (Figura 2D). Manter o cume do transdutor na parte superior e clique no ORIENTAÇÃO scanheadn marcador (no canto superior esquerdo da imagem) permitem a coordenação do movimento das mãos e área visualizada na tela.
- A partir do colo do útero, passar para o embrião mais próximo marcada (1 ou 1 'no corno uterino direita ou à esquerda, respectivamente) para visualizar o coração batendo na tela. Porque profundidade focal é fixo, mova suavemente a sonda para cima / baixo e para os lados, sem perder contato com gel para obter o plano de imagem desejada.
- Posicionar o coração no centro da tela, no interior da região indicada pela linha a tracejado amarelo representando a zona de contacto para a melhor aquisição de dados.
- Adquirir a gravação ao vivo. Obtenha a imagem de olheiro e retomar a gravação (Figura 3A). Uma vez que um mínimo de 10 segundos de gravação estável é obtido, parar a gravação e salvar.
- Vá para a próxima embrião.
- Uma vez que todos os embriões são analisados, pressione "Browse" no teclado para ver a lista das gravações. Jogue cada gravado em modo M Tracing e executar várias medições (pelo menos 5 por rastreamento) do espaçamento entre picos adjacentes (ciclo de tempo / fluxo) para obter a freqüência cardíaca média (Figura 3B).
Nota: Alguns protocolos de sugerir o uso de um suporte fixo para a cabeça da sonda para evitar tremer. No entanto, ela limita o ângulo de análise, fazendo a observação dos embriões laterais difícil. Ele também retarda a análise, como o suporte tem que ser ajustada para cada embrião. Segurando a cabeça da sonda, enquanto a resolução do antebraço na estação eficiente minimiza tremendo. Treinamento com 5-10 fêmeas grávidas é recomendado para otimizar o resultado.
5. Genotipagem
- Usando uma tesoura cirúrgica limpas e fórceps, inciso longitudinalmente a pele ea camada muscular do abdômen. Localize os sacos em cada trompa do útero e combinar os números. Cortar abrir o saco vitelino para expor o embrião no fim usado acima. Se não estiver em um arranjo linear, o esboço das posições de embriões em um pedaçode papel será essencial uma vez que as marcas na pele não são mais visíveis.
- Cortar apenas a 4 mm de cauda de genotipagem como ADN genómico é extraído de forma muito eficiente a partir de caudas embrionárias.
Nota: (i) O procedimento cirúrgico pode ter que ser realizada numa localização separada da sala de imagiologia. No entanto, é importante não mova o mouse e ter o procedimento cirúrgico na plataforma de imagem, a fim de manter o controle dos embriões numeradas. Consulte o gerente da unidade de animais para otimizar o procedimento cirúrgico. (Ii) A fêmea grávida morre rapidamente, devido à perda de sangue, como os fetos são removidos para genotipagem após imagem. Depois de cauda cortada, os fetos são colocados 3 min no gelo para a anestesia por hipotermia e depois decapitado com uma tesoura, conforme recomendado pelo Comitê Animal Care.
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Representative Results
O método acima foi utilizado para avaliar o impacto da presença ou ausência da furina serina-protease em células endoteliais em frequências cardíacas de embriões de ratinho no E18.5 no útero. Furina pertence à família das convertases pró-proteína (PCs) que os precursores de proteína clivam depois de resíduos básicos. Furina e seus substratos são proteínas secretoras e clivagem pode ocorrer no aparelho de Golgi, endossomas ou na superfície da célula. Substratos chave de furina incluem TGFb, e factores de TGFb semelhantes, tais como as proteínas morfogenéticas do osso (BMPs), que desempenham um papel importante no desenvolvimento do coração. Outros membros da família de PC também pode activar substratos típicos de furina por clivagem in vitro de 6. O papel essencial e única de furina durante o desenvolvimento é evidenciado pela morte precoce de embriões furin-deficiente no dia embrionário 11 7.
Porque muitos dos defeitos exibidos pelos embriões furin-deficiente sugeriu uma função importantefurina em células endoteliais, o papel da enzima foi analisada em células específicas de nocaute endotelial (Ecko) ratinhos. Furin flox / flox ratinhos que transportam os alelos flox condicionais do gene Furin 8 foram cruzados com ratinhos furina flox + / portadoras de um transgene em que a expressão da recombinase Cre é impulsionado pelo endotelial específico de células Tie2 promotor 9. Em células endoteliais, Cre recombina dois sítios loxP que flanqueiam o exão 2 do gene da furina, que codifica o péptido de sinal e da peça de prosegment, e assim gera furina alelos inactivados. recém-nascidos Ecko morrer logo após o nascimento, o que confirma o papel essencial da furin no processamento de precursores de células endoteliais.
Na análise das taxas de utero cardíacos em embriões em E18.5 mostrou que homozigotos, mas não heterozigótica, embriões Ecko sofria de taquicardia (batimentos cardíacos elevados; Figura 4 10.
Figura 1. Visão geral do sistema de set-up. (A) sistema de ultra-som ultra-alta freqüência com a cabeça da sonda em seu suporte é mostrado. (B) A estação compreende um sistema anestésico, a unidade controladora fisiologia e materiais. Clic k aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Rato set-up. (A) O mouse grávida é colocado em decúbito dorsal, com a oferta de isoflurano e contido na plataforma com fita adesiva. (B) Após a depilação abdominal, a localização de embriões é marcado no abdômen ou (C) esboçou em um papel. (D) O plano da imagem desejada é obtida movendo a cabeça da sonda, que permanece em contacto com o gel de ultra-som. O antebraço está bem colocada na estação para evitar tremer. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Figura 3. Avaliação representativa do ritmo cardíaco. (A) Uma imagem ecocardiografia bi-dimensional de um coração embrionário E18.5 foi obtida posicionando-o no interior da zona focal centrada na linha tracejada amarela. Os dois ventrículos são indicados por setas. LV, do ventrículo esquerdo; VD, ventrículo direito. (B) A frequência cardíaca é calculada a partir de medidas repetidas entre os ciclos de fluxo adjacentes no traçado do modo-M. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. Análise de dados Representante da freqüência cardíaca. In utero ecocardiografia (modo-M), de 9 e 7 WT Ecko embrião corações em E18.5 foi realizada utilizando um transdutor de 30 MHz. Estes embriões were obtido em 3 ninhadas independentes. P <0,0005 (***) foi determinada pelo teste t de barras e um de Student bicaudal representam a média + SEM. WT, transgene negativo Furin Flox / + ou furin camundongos Flox / Flox;. Ecko, Furin Flox / Flox Tg (Tie2-CRE) + / 0 ratos Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
-Ecocardiograma modo M é um método simples e eficaz para medir a freqüência cardíaca útero de embriões de camundongos. Transdutores disponíveis comercialmente fornecer resolução suficiente para visualizar pequenos corações batendo. Assim, eles permitem que a medição da frequência cardíaca de alta precisão, em comparação com outros métodos, como a medição de pulso, e pode substituir a microscopia de vídeo de alta resolução. Contudo, as ferramentas atuais não permitem a análise simultânea de todos os embriões, o que implica um procedimento tedioso para visualizar cada um dos embriões. Além disso, o campo de visão relativamente estreita e a ausência da profundidade de campo (2D-imagem) de requerer um ajuste manual apenas conseguida por mãos treinadas. Com efeito, uma formação adequada pode maximizar grandemente a eficiência do presente método.
Em medições in vivo de frequências cardíacas embrionárias (E18.5) oferece uma avaliação fisiológica da função cardíaca por uma imagem ao vivo não invasiva como, diferente dos métodos anteriores, ele faznão necessita de laparotomia. Em vez disso, a marcação da posição dos embriões no abdómen da mulher grávida assegura um acompanhamento correcto e preserva o seu estado fisiológico. Assim, o procedimento supera a maior fraqueza de outras tecnologias de imagem, como tomografia computadorizada e ressonância magnética. Por último, mas não menos importante, este método é menos onerosa.
Alguns passos críticos neste processo incluem a manter a temperatura do corpo e do ritmo cardíaco do rato grávida estável através do ajuste da posição da lâmpada de aquecimento e de gerar uma taxa adequada de isoflurano para manter o estado fisiológico de embriões e adquirir dados fiáveis. Procedendo de uma forma consistente e no menor tempo possível é essencial. Assim, mantendo o procedimento simples e pratica, antes de prosseguir é altamente recomendável.
Em conclusão, a ecocardiografia modo M é um método eficaz para avaliar as frequências cardíacas embrionárias no útero. Anormalidadesbatimentos cardíacos normais são indicativos de disfunção cardíaca e o método descrito permitirá especialistas, assim como não-especialistas, para o rastreio de defeitos de desenvolvimento leva a insuficiência cardíaca, em modelos de rato.
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Disclosures
Não há conflito de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Manon Laprise para treinamento em ecocardiografia e Ann Chamberland para tirar as fotos mostradas nas Figuras 1 e 2. Este trabalho foi financiado pela Canadian Institutes of Health Research concessão 44363 MOP e Canadá Presidente 950-216684.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| Electrode gel | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| Ophthalmic gel | Novartis | Tear-Gel | |
| Depilatory cream | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| Hair clipper | |||
| Gauze/cotton swap | Q-tips | ||
| Permanent marker | |||
| High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz Transducer | Visual Sonics | RMV707B | |
| Imaging platform and physiology controller unit | Visual Sonics | ||
| Anesthetic System | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| Infrared heating lamp |
References
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- Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).
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