I livmodern Mätning av hjärtfrekvens i mus genom Noninvasive M-mode ekokardiografi

Summary

Ultra-hög frekvens ultraljud är en kraftfull live-imaging verktyg för att undersöka hjärtfel i små djur. Dess noninvasiveness gör upprätthålla den fysiologiska tillstånd av embryon. Häri visar vi användning av M-mode-ultraljud för att mäta hjärtfrekvenser från embryon vid E18.5 i livmodern.

Abstract

Medfödd hjärtsjukdom (CHD) är den vanligaste icke smittsamma dödsorsaken vid födseln. Förekomsten av CHD varierar från 4 till 50/1 000 födslar (sjukdomar och skador regionala beräkningar, Världshälsoorganisationen, 2004). Operationer som ofta äventyrar livskvaliteten krävs för att korrigera hjärtfel, påminner oss om hur viktigt det är att finna orsakerna till CHD. Mutant musmodeller och levande bildteknik har blivit viktiga verktyg för att studera etiologin av denna sjukdom. Även om avancerade metoder tillåter live-avbildning av onormala hjärtan i embryon, är de fysiologiska och hemodynamiska tillstånd av den senare ofta nedsatt på grund av kirurgiska och / eller långdragna förfaranden. Noninvasive ultraljudsavbildning, kan dock användas utan kirurgiskt exponera embryon och därigenom bibehålla deras fysiologi. Häri använder vi enkla M-mode ultraljud för att bedöma hjärtfrekvenser av embryon vid E18.5 i livmodern. Registreringen av onormala hjärtfrekvenser är verkligen en bra indicator av dysfunktion av hjärtat och därmed utgör ett första steg i identifieringen av utvecklingsdefekter som kan leda till hjärtsvikt.

Introduction

CHD är den vanligaste icke smittsamma dödsorsaken vid födseln ^1. Flera operationer är ofta behövs för att rätta till de strukturella brister i patienter vars livskvalitet kan förbli äventyras ^1. Barn med CHD utvecklas ofta neurologiska sjukdomar, även om de inte har genomgått kirurgi, vilket indikerar viktiga i livmodern konsekvenser för utvecklings ^2,3. Både genetiska faktorer och miljöfaktorer, såsom exponering för virus eller kemikalier (alkohol) under graviditeten, orsakar CHD. Att studera de genetiska bidragsgivarna är fortfarande i ett tidigt skede, men växer snabbt. För att identifiera dessa bidragsgivare och förstå deras roll i hjärtutveckling, fenotypning muterade möss med ett enkelt och kraftfullt verktyg kommer att vara till stor nytta.

Musen är verkligen en djurmodell av val att studera CHD, och de flesta av de mänskliga fall kan reproduceras i möss ^4,5. Följaktligen har fetal mus cardiac fenotypning bli increasingly viktigt att undersöka etiologin av mänskliga CHD och kräver lämpliga verktyg. Även histologiska studier på fasta prover är ovärderliga, är i realtid avbildning av levande djur viktigt att förstå fysiologi hjärtat. Video mikroskopi erbjuder levande avbildning. Det kräver dock laparotomi att exponera embryon, och därmed äventyra deras fysiologiska och hemodynamiska tillstånd. Nyligen har ekokardiografi blivit standard bildteknik för hjärt bedömningar i kliniken och i möss.

Mus foster ekokardiografi utförs med hjälp av vanliga kliniska ultraljudssystem samt extremt högfrekventa ultraljudssystem. De senare ger 30 MHz eller högre frekvensomvandlare som genererar tvådimensionella bilder och möjliggör utvärdering av tidiga embryonala stadier. Dessa givare har en relativt dålig penetrationsdjup (~ 13 mm), vilket är emellertid tillräckligt för att erhålla adekvat avbildningsplan och bestämma grundläggande hjärta paparametrar såsom hjärtfrekvens, vänster och höger kammare inre diameter vid diastole och systole och septum och väggtjocklek, utan att utföra laparotomi.

I vår studie har vi använt en ultrahög frekvens ultraljudssystem för att bedöma hjärtfrekvenser från musembryon på embryonala dag E18.5. Vi valde en 30 MHz omvandlare, som ger ett fält vy av 20 mm x 20 mm, vilket är idealiskt med tanke på storleken av fostren, med en brännvidd av 12,7 mm. Dock kan en givare högre frekvens väljas för att analysera tidigare utvecklingsstadier. Det valda M-läge tillåter visualisering av vävnad i rörelse tack vare en hög temporal upplösning på 1000 bilder / sek. Hela proceduren är enkel och bör utföras så snabbt som möjligt för att undvika störning av de fysiologiska och hemodynamiska tillstånd av fostret. Analysen av cirka 8 embryon kräver ungefär en timme.

Protocol

Alla förfaranden som visas i detta protokoll har godkänts av IRCM Animal Care kommittén.

1. Ultraljudssystem och Station Förberedelse

1. Starta ultraljudsavbildningssystem och anslut proben samt fysiologin styrenheten i enlighet med tillverkarens instruktioner (Figur 1). Välj Hjärtmätning Program och proben som motsvarar 30 MHz-givare.
2. Fyll nosstycket på proben med avjoniserat vatten. Undvik luftbubblor eftersom de stör avbildning upplösning. Placera tonhuvudet med handtaget uppåt på hållaren nära avbildning plattformen (Figur 1A).
3. Desinficera avbildning plattform och arbetsområde.
4. Fyll helt flaskan av ultraljud gel för att undvika bildandet av bubblor och placera den upp och ned i sin förvärmningsanordning behållare inställd på 37 ° C (Figur 1B).
5. Kontrollera nivåerna av syregen och isofluran och slangsystem för anestesi. Ett experiment med ~ 8 embryon skulle använda ungefär 15-20 L syre.
6. Placera flaskorna med oftalmisk balsam, hårborttagningskräm och elektrodgel nära avbildnings plattform (Figur 1B).
7. Kontrollera att infraröd värmelampa funktioner. Under träning ställer in värmenivå, placeringen av lampan och avståndet från lampan till möss i syfte att bibehålla konstant kroppstemperatur och hjärtfrekvens.
   Obs: Korrekt förberedelse av systemet och materialet är kritisk. Utdragna förfaranden kan påverka de fysiologiska och hemodynamiska egenskaper hos foster så länge anestesi trycker ned hjärtfunktionen genom att sänka puls, blodtryck och blod-syresättning nivå. Handläggningstiden för ~ 8 foster (genomsnittlig kullstorlek i C57BL / 6) bör vara ungefär 1 timme. Andra musstammar kan ge ett högre antal foster, eventuellt med en större kvinnlig storlek. Träning är viktigt för att optimera processing tid.

2. Mus Framställning

1. Söva den gravida kvinnan i en kammare med kontinuerlig tillförsel av 2% isofluran i syre (200 ml / min) tills den blir inte svarar.
2. Placera musen på bildplattform i ryggläge, justera slangen för kontinuerlig inhalation av 1,5% isofluran i syre (200 ml / min), och fixera inhalationsröret med tejp (Figur 2A). Tillräckliga anestesi bör bekräftas under förfarandet vid avslappnad hållning av musen och avsaknad av svar på svans och tå nypor.
3. Placera elektrod gel endast på den vänstra övre och högra nedre elektroderna (höger främre ben och vänster bakben, även kallad lead II-läge) för EKG. Lead II position ger bättre definierade upprätt positiv P-våg och QRS-komplexet för att bestämma hjärtfrekvensen. Säkra de fyra tassar att varje dyna med tejp (Figur 2A). För att förhindra torrhet i ögon, applicera 1 droppeoftalmologiska balsam i varje öga.
4. Raka buken från bröstkorgen till urinblåsan med en hårtrimmer. Applicera sedan hårborttagningskräm för 2 minuter och torka av den med gasväv och / eller bomullspinne för att försiktigt ta bort eventuella kvarvarande hår. Var noga med att inte skära bröstvårtorna.
5. Sätt termometern insmorda med elektrodgel in i kvinnans ändtarm för att övervaka kroppstemperatur (bör hållas vid 37 ± 0,5 ° C genom att justera en infraröd värmelampa placeras ovanför plattformen). Pulsen bör vara 450 ± 50 slag / minut (bpm). Både temperatur och hjärtfrekvens visas på fysiologi styrenhet (Figur 1B).
   OBS: Långt anesthetization, håravfall och ultraljud gel (även om förvärmt) kan leda till hypotermi, vilket kan påverka den kvinnliga hjärtfrekvens. Om kroppstemperaturen sjunker under 36,5 ° C, stoppa proceduren och ändra positionen för värmelampa för att justera temperaturen och hjärtfrekvens. Vänta ett par minuter befmalm fortsätter igen.

3. Embryo Identifiering

1. Tryck försiktigt ned den nakna mage att lokalisera embryona. Långsamt och försiktigt sprida ut dem att ha de flesta av embryon i ett enda skikt enligt den abdominala ytan. I varje livmoderhorn, är säckar linjärt kopplade till varandra. Försök att respektera denna ordning vid spridning.
2. Markera varje embryo på den nakna magen av det kvinnliga med en permanent markör med sin främre / bakre och rygg / ventrala riktningar. Att veta orienteringen kommer att underlätta placering av hjärta med sonden. Siffer embryona i de högra och vänstra horn som börjar från livmoderhalsen (1, 2, 3, ... och 1 ', 2', 3 '... respektive; Figur 2B).
   Anmärkning: (i) Undvik att sprida embryon med överdrivet våld. Skissa sina platser på ett papper för att spåra dem (figur 2C). (Ii) C57BL / 6 honor har ~ 8 foster per kull. Men 0-2 embryon i varje kull är located under de andra, vilket gör deras avbildning omöjligt. Uteslut dessa embryon från analysen och bedöma fler kullar om det behövs.

4. Hjärtfrekvensmätning

1. Placera en liten mängd av förvärmd ultraljud gel på den nakna magen och sprida det jämnt. Undvik bubbelbildning. Lägg till en större mängd gel (~ 5 ml) på det specifika området för att avbilda.
2. Håll proben i kontakt med tjock gel lager (10 mm) och gradvis flytta sonden mot huden samtidigt som de söker att slå hjärtat. När slående hjärta visualiseras på skärmen, justera vinkeln på sonden att ha båda kamrarna i deras största storlek i bildplanet (figur 2D).
3. Börja skaffa bild. Med underarmen vilar på stationen, placera givaren på ultraljud gel för att få en levande bild på bildskärmen (Figur 2D). Upprätthållande åsen hos omvandlaren på toppen och klicka proben läggningn markör (i det vänstra övre hörnet av bilden) att samordningen av handrörelse och området visualiseras på skärmen.
4. Starta från livmoderhalsen, gå till närmaste embryot märkt (1 eller 1 'i höger eller vänster livmoderhorn, respektive) för att visualisera slående hjärta på skärmen. Eftersom skärpedjup är fast, rör försiktigt sonden upp / ner och i sidled utan att tappa kontakten med gel för att få önskad bildplanet.
5. Placera bultande hjärta i mitten av skärmen inom regionen som den gula streckade linjen representerar brännzonen för bättre datainsamling.
6. Skaffa liveinspelning. Skaffa scout bilden och återuppta inspelningen (Figur 3A). När minst 10 sekunder för stabil inspelning erhålls, stoppa inspelningen och spara.
7. Fortsätt till nästa embryot.
8. När alla embryon analyseras, tryck på "Bläddra" på tangentbordet för att visa listan över inspelningar. Spela varje inspelad M-mode tracing och utföra flera mätningar (minst 5 per spårning) av avståndet mellan intilliggande toppar (tid / flöde cykel) för att erhålla den genomsnittliga hjärtfrekvensen (figur 3B).
   OBS: Vissa protokoll föreslår att du använder en stationär ställning för proben för att undvika skakningar. Dock hindrar det vinkeln analysen, vilket gör observationen av sido embryon svårt. Den saktar också ner analysen, eftersom stativet måste justeras för varje embryo. Håll proben samtidigt lösa underarmen på stationen effektivt minimerar skakningar. Träning med 5-10 dräktiga honor rekommenderas för att optimera resultatet.

5. Genotypning

1. Använda rena kirurgisk sax och pincett, incisionsfilm längdled huden och muskellagret i buken. Leta upp säckar i varje livmoderhorn och matcha siffrorna. Skär öppna gulesäcken att exponera embryot i den ordning som används ovan. Om inte i ett linjärt arrangemang skiss av embryot positioner på en bitav papper kommer att vara avgörande när märken på huden inte längre är synliga.
2. Klipp bara ~ 4 mm av svansen för genotypning som iskt DNA är mycket effektivt utvinns ur embryonala svansar.
   Anm: (i) Den kirurgiska proceduren kan behöva utföras på ett separat ställe från bildrummet. Det är dock viktigt att inte flytta musen och ha det kirurgiska ingreppet på bildplanet för att hålla reda på de numrerade embryon. Läs i djuranläggning manager för att optimera den kirurgiska proceduren. (Ii) Den gravida kvinnor dör snabbt på grund av blodförlust eftersom fostren bort för genotypning efter avbildning. Efter svans klippa, är fostren placerade 3 minuter på is för anestesi av hypotermi och sedan halshöggs med en sax, som rekommenderas av våra Animal Care kommittén.

Representative Results

Ovanstående metod användes för att bedöma effekten av närvaro eller frånvaro av serin proteas furin i endotelceller på hjärtfrekvens av musembryon vid E18.5 i livmodern. Furin tillhör familjen av proprotein konvertaser (PC) som klyver proteinprekursorer efter basiska rester. Furin och dess substrat är sekretoriska proteiner och spjälkning kan ske i Golgi-apparaten, endosomer eller vid cellytan. Viktiga substrat av furin inkluderar TGFb och TGFb-liknande faktorer, såsom de benmorfogenetiska proteiner (BMP) som spelar en viktig roll i hjärtutveckling. Andra medlemmar av PC familjen kan också aktivera typiska substrat av furin genom in vitro klyvning ^6. Nyckeln och unika roll furin under utveckling styrks av den tidiga död Furin fattiga embryon på embryonala dag 11 ^7.

Eftersom många av de brister som uppvisas av Furin fattiga embryon föreslog en viktig funktionfurin i endotelceller, har rollen av enzymet undersöktes i endotelial cellspecifik knockout (EcKo) möss. Furin ^{flox / flox} möss som bär villkor flox alleler av Furin gen ⁸ korsades med Furin ^{flox / +} möss som bär en transgen i vilken uttrycket av Cre-rekombinas är driven av den endoteliala cellspecifika Tie2 promotor ^9. I endotelceller, Cre rekombinerar två loxP-ställen som flankerar exon 2 av Furin-genen, som kodar för signalpeptiden och en del av prosegment och därigenom genererar inaktive Furin alleler. Ecko nyfödda dör kort efter födseln, vilket bekräftar den viktiga roll furin i bearbetning av endotelceller prekursorer.

I livmodern analys av hjärtfrekvens i embryon vid E18.5 visade att homozygota, men inte heterozygot, Ecko embryon drabbats av takykardi (förhöjda hjärtfrekvens; Figur 4 10.

Figur 1. Översikt av systeminställning. (A) Ultra-högfrekventa ultraljudssystem med proben i hållaren visas. (B) Stationen innefattar en anestesisystemet, fysiologin styrenheten och material. Clic k här för att visa en större bild.

Figur 2. Musen set-up. (A) Den gravida musen placeras i ryggläge med isofluran utbud och återhållsam på plattformen med tejp. (B) Efter buken hårborttagning, är platsen för embryon markerade på buken eller (C) skissat på ett papper. (D) Den önskade avbildningsplanet erhålls genom att förflytta proben som förblir i kontakt med ultraljuds gel. Underarmen är ordentligt placerad på stationen för att undvika skakningar. Klicka här för att visa en större bild .

jpg "width =" 500px "/>
Figur 3. Representativ utvärdering av hjärtfrekvensen. (A) En tvådimensionell ekokardiografi bilden av ett embryonalt hjärta vid E18.5 erhölls genom att placera den i brännzonen centrerad på gul streckad linje. De två kamrarna är indikerade med pilar. LV, vänster ventrikel; RV, höger ventrikel. (B) Puls beräknas från upprepade mätningar mellan intilliggande flödescykler i M-mode spårning. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. Representant dataanalys av hjärtfrekvensen. I livmodern ekokardiografi (M-läge) på 9 WT och 7 Ecko embryo hjärtan vid E18.5 utfördes med hjälp av en 30 MHz-givare. Dessa embryon were erhållits i 3 oberoende kullar. P <0,0005 (***) bestämdes genom en två-tailed Students t-test och staplarna representerar medelvärdet + SEM. WT, transgen negativ Furin ^{Flox / +} eller Furin ^{flox / flox} möss;. Ecko, Furin ^{flox / flox} Tg (Tie2-cre) ^{+ / 0} möss Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

M-mode ekokardiografi är en effektiv och enkel metod för att mäta in utero hjärtfrekvens av musembryon. Kommersiellt tillgängliga givare ger tillräcklig upplösning för att visualisera små slående hjärtan. Således de tillåter en mycket exakt hjärtfrekvensmätning, jämfört med andra metoder, såsom pulsmätning, och kan ersätta högupplöst video mikroskopi. Däremot behöver de nuvarande verktygen inte tillåter samtidig analys av alla embryon, vilket innebär en omständlig procedur för att visualisera alla de embryon. Dessutom är relativt smalt synfält och frånvaron av skärpedjup (2D-bild) kräver en manuell justering endast uppnås genom utbildade händer. I själva verket kan en lämplig utbildning kraftigt maximera effektiviteten i denna metod.

In vivo-mätningar av embryonala hjärtfrekvens (E18.5) erbjuder en fysiologisk utvärdering av hjärtfunktionen med en icke-invasiv live-avbildning som, skiljer sig från tidigare metoder, det gör detinte kräver laparotomi. Istället, som markerar läget för de embryon på buk gravid hona säkerställer en korrekt spårning och bevarar deras fysiologiska tillstånd. Således övervinner förfarandet den stora svagheten i andra avbildningstekniker, såsom datortomografi och magnetisk resonanstomografi. Sist men inte minst, är denna metod mindre kostsam.

Några viktiga steg i denna metod är bland annat att hålla kroppstemperaturen och hjärtfrekvensen hos gravida musen stabilt genom att justera läget för värmelampa och generera en ordentlig hastighet av isofluran för att upprätthålla den fysiologiska tillstånd av embryon och skaffa tillförlitliga uppgifter. Förfara på ett konsekvent sätt och på kortast möjliga tid är viktigt. Därför håller proceduren enkel och öva innan du fortsätter rekommenderas starkt.

Sammanfattningsvis är M-mode ekokardiografi en effektiv metod för att bedöma embryonala hjärtfrekvenser i livmodern. Onormal hjärtfrekvens tyder på hjärtdysfunktion och den metod som beskrivs kommer att tillåta specialister, såväl som icke-specialister, för att screena för utvecklingsdefekter som leder till hjärtsvikt i musmodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	CP0406v2	1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether
Ultrasound gel	Parker Laboratories Inc.	Aquasonic Clear
Electrode gel	Parker Laboratories Inc.	Spectra 360
Ophthalmic gel	Novartis	Tear-Gel
Depilatory cream	Church Dwight Co., Inc.	Nair
Hair clipper
Gauze/cotton swap	Q-tips
Permanent marker
High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System	Visual Sonics	Vevo770
30 MHz Transducer	Visual Sonics	RMV707B
Imaging platform and physiology controller unit	Visual Sonics
Anesthetic System	Cyprane North America Inc.	312462
Infrared heating lamp