Summary
超高周波超音波小動物における心臓の異常を調べるための強力なライブイメージングツールです。その非侵襲性は、胚の生理的な状態を維持することができます。ここで、我々は子宮内で E18.5で胚の心拍数を測定するためのM-モード超音波を使用することを示している。
Abstract
先天性心疾患（CHD）出生時の死亡の最も頻度の高い非感染性の原因である。 CHDの発生率は、4〜50/1、000出生（病気やケガ、地域の推定、世界保健機関、2004）の範囲である。多くの場合、生活の質を損なう手術は、CHDの原因を見つけることの大切さを思い出させ、心臓欠陥を修正するために必要な。変異マウスモデルとライブイメージング技術は、この疾患の病因を研究するために不可欠なツールとなっている。高度な方法は、胚における異常な心のライブイメージングを可能にするが、後者の生理学的および血行動態状態は、しばしば外科的および/または時間のかかる手順を侵害された。非侵襲超音波イメージングは、しかし、それによってそれらの生理機能を維持し、外科的に胚を曝露することなく使用することができる。ここで、我々は子宮内で E18.5で胚の心拍数を評価するために、単純なM-モード超音波を使用しています。異常な心拍数の検出は、確かに良いインディカですこのため、心臓の機能障害のTORとは、心不全につながる可能性発達障害の識別の最初のステップとなる。
Introduction
CHDは、出生1での死亡の最も一般的な非感染性の原因である。複数の手術は、しばしば、生活の質を損なわ1残ること被験者における構造的欠陥を修正するために必要とされる。 CHDを持つ子どもは、頻繁に開発2,3上の子宮への影響の重要なことを示す、彼らが手術を受けていない場合でも、神経疾患を開発しています。妊娠、原因CHD中のウイルスや化学物質への曝露（アルコール）などの遺伝的要因と環境要因の両方。遺伝的貢献を研究することは、その初期段階ではまだですが、急速に成長。これらの貢献者を特定し、シンプルかつ強力なツールと変異マウスの表現型を、心臓発生における役割を理解するために非常に有益である。
マウスは確かにCHDを研究するための任意の動物モデルであり、ヒト症例のほとんどは4,5マウスで再生することができる。その結果、マウス胎児の心臓表現型は、株式会社となっているreasingly重要なヒトCHDの病因を調査し、適切なツールが必要です。固定した標本上の組織学的研究は非常に貴重ですが、生きている動物のリアルタイムイメージングは、心臓の生理機能を理解することが重要です。ビデオ顕微鏡、ライブイメージングを提供しています。しかしながら、それによりそれらの生理学的および血行動態の状態を損なうこと、胚を露出させるために開腹を必要とする。最近では、心エコー検査は、診療所だけでなく、マウスでの心臓評価のための標準的なイメージング技術となっている。
マウス胎児心エコー検査は、標準的な臨床超音波システム、ならびに超高周波超音波システムを用いて行われる。後者は、二次元画像を生成し、初期胚の段階の評価を可能にする30 MHz以上の周波数変換器を提供する。これらのトランスデューサは、しかし、適切な撮像面を取得し、基本的な心臓年率を判断するのに十分であるが、比較的貧弱な侵入深さ（-13 mm）を有する例えば、心拍数、拡張期と収縮期と隔壁と壁の厚さで左及び右心室内径、開腹術を行うことなくとしてrameters。
我々の研究では、胎生E18.5でのマウス胚の心拍数を評価するために、超高周波数超音波システムを使用している。私たちは、12.7ミリメートルの焦点距離と、胎児の大き与えられた理想的なX 20ミリメートル、20ミリメートルのフィールドビューを提供30 MHzのトランスデューサを選択しました。しかしながら、より高い周波数変換器は、以前の発達段階を分析するために選択することができる。選択されたM-modeは千フレーム/秒の高時間分解能への運動のおかげで組織の可視化を可能にする。フル手順は簡単で、胎児の生理学的および血行動態状態のいずれかの摂動を避けるために、可能な限り迅速に行うべきである。約8胚の解析は、約1時間を必要とします。
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Protocol
このプロトコルに示されているすべての手順は、IRCM動物実験委員会によって承認されている。
1。超音波システムおよびステーションの準備
- 超音波撮像システムを起動し、製造者の指示（ 図1）に記載の走査ヘッドならびに生理学コントローラユニットに接続する。心臓測定プログラムおよび30 MHzのトランスデューサに対応スキャンヘッドを選択してください。
- 脱イオン水でスキャンヘッドのノーズピースを埋める。彼らは画像の解像度を妨害するように空気の泡を避けてください。イメージングプラットフォーム（ 図1A）の近くに、その所有者のハンドル側を上にしてスキャンヘッドを置きます。
- イメージングプラットフォームと作業領域を消毒。
- 気泡の形成を避け、37℃（ 図1B）、その予熱コンテナセットに逆さまに配置し、完全に超音波ゲルのボトルを埋める。
- オキシのレベルを確認します。GENおよびイソフルラン麻酔のための配管システム。 〜8胚の一つの実験では、約15から20のLの酸素を使用します。
- イメージングプラットフォーム（ 図1B）の近くの眼科バーム、脱毛クリームや電極ゲルのボトルを置きます。
- 赤外線加熱ランプ機能することを確認します。トレーニング中に、熱レベル、ランプの位置と一定の体温と心拍数を維持するために、マウスへのランプの距離を設定する。
注意：適切なシステムの製造および材料が重要です。長い手順があれ麻酔心拍数、血圧および血液酸素化レベルを低下させることによって心機能を押下する胎児の生理学的および血行力学的特性に影響を与えることができる。 （C57BL / 6の平均産仔数）〜8胎児の処理時間は約1時間でなければなりません。他のマウス系統は、おそらく大きな女性のサイズで、胎児の高い番号を提供することができる。訓練は、プロセスiを最適化することが不可欠であるNG時間。
2。マウスの準備
- それが応答しなくなるまで、酸素の2％イソフルラン（200ミリリットル/分）を連続的に供給してチャンバー内に妊娠した女性を麻酔。
- 酸素1.5％イソフルラン（200ミリリットル/分）の連続吸入用チューブを調整し、テープ（ 図2A）と吸入チューブを固定、仰臥位でイメージングプラットフォーム上にマウスを置きます。十分な麻酔は、マウスのリラックスした姿勢と尾と足指ピンチへの応答の不在により手順の間確認されるべきである。
- 唯一の心電図用（右脚と、リードIIポジションと呼ばれる左後肢、フォア）左上と右下の電極パッドの上に置いて電極ゲル。リードIIの位置は、心拍数を決定するための複雑な良好に定義直立正のP波とQRSを提供する。テープ（ 図2A）を使用して、それぞれのパッドに4本の足を固定します。目の乾燥を防ぐために、1滴の適用それぞれの目に眼科バーム。
- バリカンで膀胱に胸から腹部を剃る。その後、2分間の除毛クリームを適用し、慎重に残っている毛を取り除くためにガーゼおよび/または綿棒で拭き取ってください。乳首を切らないように注意してください。
- 体温を監視するための雌の直腸内への電極ゲルを封入品温度計を挿入し（プラットフォームの上方に配置された赤外線加熱ランプを調整することにより、37±0.5℃に維持されるべきである）。心拍数は450±50拍/分（BPM）である必要があります。温度及び心拍数の両方が生理コントローラユニット（ 図1B）に表示される。
注意：長い麻酔、抜け毛や超音波ゲルが（予め温めが）女性の心拍数に影響を与えることが、低体温症につながることができます。体温が36.5°Cを下回ると、手順を停止し、温度及び心拍数を調整する加熱ランプの位置を変更する。 BEF数分待つ鉱石が再び進む。
3。胚の識別
- 優しく胚を見つけるために裸の腹部を下に押します。ゆっくりと軽く腹部表面下の単層での胚のほとんどを持っているためにそれらを広げ。各子宮角では、嚢は、直線的に相互に接続されている。拡散時にこの順序を尊重するようにしてください。
- マーク彼らの前方/後方背側/腹側方向に油性マジックで女性の裸の腹部に各胚。方向を知ることは、プローブを用いて、心臓の位置を容易にするであろう。数頸部から出発し、左右の角における胚（1、2、3 ...と1 '、2'、3 '···それぞれ、 図2B）。
注：（I）過大な力で胚を広げないようにしてください。 （ 図2C）、それらを追跡するために紙の上の位置をスケッチする。 （II）のC57BL / 6雌は腹あたり〜8胎児を持っている。しかし、各リターの0-2胚はLですその画像を不可能に、他の人の下ocated。分析からこれらの胚を除外し、必要に応じてより多くの仔を評価します。
4。心拍数測定
- 裸の腹部に温めておいた超音波ゲルの少量を置き、均等に広げる。気泡形成を避ける。画像に固有の領域にゲルを多く（約5mL）を追加します。
- 厚いゲル層（10ミリメートル）と接触したプローブを保持し、拍動する心臓を探している間、徐々に皮膚に向かってプローブを移動します。心臓の鼓動が画面上で可視化されると、撮像面（ 図2D）におけるそれらの最大の大きさに両方の心室を有するように、プローブの角度を調節する。
- 画像を取得開始します。前腕の駅で休んで、視聴画面（ 図2D）ライブ画像を得るために超音波ゲルで振動子を配置します。上部のトランスデューサの尾根を維持し、走査ヘッド指向¼をクリック（画像の左上隅にある）、n個のマーカが画面上に可視化され、手の動きと地域の連携を可能にする。
- 子宮頸部からスタートして、画面上に拍動する心臓を視覚化する（それぞれ、右または左の子宮角内の1または1 '）とマーク近い胚に移動します。焦点深度が固定されているので、緩やかに所望の像平面を得るためにゲルと接触を失うことなく、アップ/ダウン及び横プローブを移動させる。
- よりよいデータ取得のための焦点域を表す黄色の破線で示した領域内に、画面の中央に、拍動する心臓の位置を決めます。
- ライブ録音を獲得。スカウト画像を入手した（ 図3A）の記録を再開します。安定した記録の10秒の最小値が得られると、録音を停止し、保存します。
- 次の胚に進みます。
- すべての胚が分析されると、Enterキーを押して録画リストを表示するには、キーボード上の「参照」。記録された各Mモードトレイシーを演じるngの平均心拍数（ 図3B）を得るために隣接するピーク（時間/フローサイクル）の間の間隔の複数の測定値（トレース当たり少なくとも5）を行う。
注：一部のプロトコルは揺れを避けるために、走査ヘッド用の固定スタンドを使用してお勧めします。しかしながら、横方向の胚の観察を困難に、分析の角度を規制する。スタンドは各胚のために調整しなければならないように、それはまた、解析が遅くなります。ステーションに前腕をセトリングしながらスキャンヘッドを保持することは効率的に揺れが最小限に抑えられます。 5月10日、妊娠中の女性とのトレーニングは、結果を最適化することをお勧めします。
5。遺伝子型判定
- きれいな外科はさみやピンセットを用いて、縦方向に皮膚や腹部の筋肉層を切開。各子宮角に嚢の位置を確認し、番号と一致。上記で使用したために、胚を露出するために卵黄嚢を切り開い。線形構成ではない場合は、一枚上の胚位置のスケッチ皮膚上のマークは、もはや表示されたら、用紙の基本的なことはありません。
- ゲノムDNAは非常に効率的に胚の尾から抽出されるように遺伝子型判定のための尾の唯一の〜4ミリメートルにカット。
注：は、（i）外科的処置は、撮影室とは別の場所で実行する必要があることがある。しかし、マウスを動かして番号胚を追跡するために、撮影台上の外科的処置を持たないことが重要である。外科手術を最適化するために、動物施設の管理者に問い合わせてください。胎児撮像後に遺伝子型判定のために除去される（II）妊娠中の女性は、急速に血液の損失に死ぬ。私たちのアニマルケア委員会が推奨する、テールカットの後、胎児は低体温麻酔のための氷上で3分間置かれた後、はさみで断頭。
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Representative Results
上記の方法は、子宮内でのE18.5マウス胚の心拍数での内皮細胞におけるセリンプロテアーゼフリンの存在または不存在の影響を評価するために使用した。フリンは、塩基性残基の後を切断するタンパク質前駆体、そのプロタンパク質転換（PCS）のファミリーに属する。フリンとその基質が分泌タンパク質であり、切断はゴルジ体、エンドソーム内または細胞表面で発生する可能性があります。フリンのキーのTGFb基質は、心臓の発達において重要な役割を果たし、骨形成タンパク質（BMP）などのTGFb様因子を含む。 PCのファミリーの他のメンバーはまた、 インビトロ切断6でフリンの典型的な基質を活性化することができます。開発中のフリンのキーと一意な役割は、胎生11 7でフリン欠損胚の早期死亡によって証明されている。
フリン欠損胚が示す欠陥の多くは重要な機能を示唆しているため内皮細胞におけるフリンは、酵素の役割は、内皮細胞特異的ノックアウト（ECKO）マウスで試験した。 フリン遺伝子 8の条件FLOX対立遺伝子を有するフリンFLOX / FLOXマウスにおいて導入遺伝子を有するフリン FLOX / +マウスと交配したCreリコンビナーゼの発現は、内皮細胞特異的プロモーターのTie2 9によって駆動される。内皮細胞において、Creリコンビナーゼは、シグナルペプチドおよびプロセグメントの一部をコード化し、それによって不活性化フューリン対立遺伝子を生成するフリン遺伝子のエクソン2に隣接する2つのloxP部位を再結合する。 ECKO新生児は、内皮細胞前駆体の処理におけるフリンの本質的な役割を確認、出生後まもなく死亡する。
図4、E18.5で胚における心拍数の子宮内解析ではホモ接合が、ヘテロ接合、Eckoの胚は頻脈（心拍数の上昇に苦しんでいないことを示した10を発表しました。
図1。そのホルダー内のスキャンヘッドを有するシステムセットアップの概要（A）超高周波数超音波システムが示されている。 （B）局は、麻酔システム、生理学制御部と、材料を含む。 clicクリック拡大画像を表示するには、ここkである。
図2。マウスがアップに設定します。（A）妊娠中のマウスをイソフルラン供給に仰臥位に置き、テープでプラットフォームに拘束されている。 （B）腹部の毛を除去した後、胚の位置は腹部又は（C）上にマークされている紙にスケッチ。 （D）は、所望の撮像面は、超音波ゲルと接触したままで走査ヘッドを移動させることにより得られる。前腕は安全に揺れを避けるために駅に配置されます。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図3。心拍数の代表的な評価は、（A）E18.5での胚の心臓の二次元心エコー画像は黄色の破線を中心と焦点ゾーン内にそれを配置することによって得た。 2つの心室を矢印で示す。 LV、左心室、右心室、右心室を。 （B）は心拍数をMモードトレース内の隣接する流れサイクル間繰り返し測定から計算されます。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。心拍数の代表的なデータ分析。 子宮内エコー検査では （M-モード）9 WTおよび7 ECKO胚心臓のE18.5では、30MHzの変換器を用いて行った。これらの胚WERE 3つの独立した仔で得られた。 P <0.0005（***）は平均+ SEMを表す2つのスチューデントのt検定やバーによって決定された。 WT、導入遺伝子負風鈴FLOX / +またはフリンFLOX / FLOXマウス; ECKO、 風鈴FLOX / FLOX TG（のTie2-CRE）+ / 0マウス。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
Mモード心エコー検査は、マウス胚の子宮内の心拍数で測定するための効果的かつ簡単な方法です。市販のトランスデューサは、小さな鼓動の心を視覚化するのに十分な解像度を提供します。従って、それらは、パルス測定等の他の方法と比較して、精度の高い心拍数測定を可能にし、高解像度のビデオ顕微鏡法を代用することができる。しかし、現在のツールでは、胚のそれぞれを可視化するための面倒な手続きを意味する、すべての胚の同時分析を可能にしない。加えて、比較的狭い視野と被写界深度の非存在下（2D画像）は、訓練を受けた手によって達成さ手動調整を必要とする。実際、適切なトレーニングが大幅にこの方法の効率を最大限に高めることができます。
胚の心拍数（E18.5）のin vivoでの測定では 、以前の方法とは異なり、それがない、などの非侵襲的ライブイメージングによる心臓機能の生理的な評価を提供しています開腹を必要としませ。その代わりに、妊娠中の女性の腹部に胚の位置をマークするには、適切なトラッキングを保証し、その生理的な状態を維持します。したがって、手順は、コンピュータ断層撮影法および磁気共鳴画像のような他の撮像技術の弱点を克服する。少なくとも最後のではなく、この方法では、低コストである。
この方法のいくつかの重要なステップは、加熱ランプの位置を調整し、胚の生理学的状態を維持し、信頼性のあるデータを取得するためにイソフルランの適切な速度を生成することにより、安定した妊娠中のマウスの体温と心拍数を維持挙げられる。一貫性のある方法で、可能な最短時間で進行することが不可欠である。そのため、簡単な手順を維持し、前に進むに練習することを強くお勧めします。
結論として、M-モード心エコー検査は、 子宮内の胚心拍数を評価するための有効な方法である。 Abnor発作の心拍数は、心臓機能障害の指標であると記載された方法は、マウスモデルにおいて、心不全に至る発達障害をスクリーニングするために、専門家だけでなく、非専門家を可能にする。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
我々は図1と図2に示した写真を撮るための心エコー検査での訓練のためのマノンLapriseとアンシャンベランに感謝します。この作品は、健康の研究助成金からMOP 44363とカナダの椅子950から216684のカナダの協会によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| Electrode gel | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| Ophthalmic gel | Novartis | Tear-Gel | |
| Depilatory cream | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| Hair clipper | |||
| Gauze/cotton swap | Q-tips | ||
| Permanent marker | |||
| High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz Transducer | Visual Sonics | RMV707B | |
| Imaging platform and physiology controller unit | Visual Sonics | ||
| Anesthetic System | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| Infrared heating lamp |
References
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