Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي Published: March 12, 2014 doi: 10.3791/51188
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية تقسيم الصورة الخلايا داخل الأنسجة في انواع معينة ايليجانس الأجنة. بينما العديد من البروتوكولات تصف كيفية انقسام الخلايا في صورة الجنين في وقت مبكر، ويصف هذا البروتوكول كيفية صورة انقسام الخلايا داخل الأنسجة النامية خلال منتصف أواخر مرحلة التطور الجنيني.

Abstract

يصف هذا البروتوكول استخدام مضان المجهري لصورة تقسيم الخلايا داخل تطوير انواع معينة ايليجانس الأجنة. على وجه الخصوص، يركز هذا البروتوكول على كيفية تقسيم الصورة neuroblasts، والتي توجد تحت خلايا البشرة وربما يكون من المهم للالبشرة التشكل. تشكيل الأنسجة أمر بالغ الأهمية لتحقيق التنمية metazoan وتعتمد على الإشارات الخارجية من الأنسجة المجاورة. C. ايليجانس هو كائن نموذجا ممتازا لدراسة التشكل الأنسجة في الجسم الحي بسبب شفافيته وتنظيم بسيط، مما يجعل من السهل الأنسجة لدراسة عبر المجهر. الضميمة بطني هو عملية حيث يتم تغطية السطح البطني للجنين من قبل طبقة واحدة من الخلايا الظهارية. ويعتقد أن هذا الحدث إلى أن تيسره neuroblasts الكامنة، والتي توفر التوجيه العظة الكيميائية للتوسط هجرة الخلايا الظهارية الفوقية. ومع ذلك، فإن neuroblasts هي التكاثري للغاية وأيضا قد تعملباعتبارها الركيزة الميكانيكية للخلايا البشرة بطني. الدراسات التجريبية باستخدام هذا البروتوكول يمكن الكشف عن أهمية التواصل بين الخلايا أثناء تكوين الأنسجة، ويمكن استخدامها للكشف عن أدوار الجينات المسؤولة عن انقسام الخلايا في الأنسجة النامية.

Introduction

في حين أن هناك بروتوكولات تصف كيفية انقسام الخلية الصورة في أوائل C. ايليجانس الجنين، ويصف هذا البروتوكول كيفية انقسام الخلية صورة داخل الأنسجة خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني. كان واحدا من التحديات الرئيسية في التصوير الحية خلال تطوير حساسيتها للالضيائية. ومع ذلك، فقد سمحت زيادة إمكانية الوصول إلى الغزل المجاهر القرص أو متحد البؤر المجهر حقل اجتاحت تطبيقات التصوير أكثر انتشارا. كلا النظامين استخدام الليزر في الحالة الصلبة والضوء المتناثرة، مما يحد من مستويات الأشعة فوق البنفسجية التي يتعرض لها الكائنات الحية ل. ومع ذلك، وتقف widefield ما زال بالإمكان استخدام للتصوير في الجسم الحي، وخاصة إذا تم تجهيزه أنهم مع الكاميرات مع حساسية عالية (على سبيل المثال EMCCD)، والتحكم في الفتحة والتحكم في الإضاءة (مثل المصابيح أو مصابيح الزئبق قابل للتعديل). يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام إما نظام متحد البؤر مقرها أو نظام widefield لانقسام الخلايا الصورة داخل النامية C. ايليجانس <م /> الأجنة. كمثال على ذلك، ونحن تصف كيفية صورة انقسام الخلية أرومة عصبية. Neuroblasts قد تسهل البشرة التشكل من خلال توفير الاشارات الكيميائية أو الميكانيكية للخلايا البشرة المغطي، وتوفر مثالا ممتازا على أهمية التواصل بين الخلايا في تشكيل الأنسجة.

انواع معينة ايليجانس هو كائن النموذج المثالي للدراسات المجهر مقرها نظرا لشفافيته وتنظيم الأنسجة بسيطة 1. وعلاوة على ذلك، C. ايليجانس هو قابل للطرق وراثية ورني، ولأن العديد من جيناته ديك المتماثلات الإنسان، فإنه يمكن استخدامها لتحديد آليات الحفظ لتكوين الأنسجة 2-5. في C. ايليجانس، تشكيل البشرة يحدث خلال مرحلة التطور الجنيني منتصف، حين يكون الجنين لديه> 300 الخلايا. تتكون البشرة التشكل من عدة مراحل رئيسية، حيث يتم وضع الجنين في طبقة من خلايا البشرة التي تؤدي إلى انقباض وتمدد إلى تحويل EMBRيو من نموذج بيضوي الشكل في شكل ممدود من دودة 6. يصف الضميمة بطني واحد من هذه الأحداث التخلق، عندما تهاجر خلايا البشرة بطني نحو خط الوسط بطني لتغطية السطح البطني للجنين (الشكل 1). الأولى، اثنين من أزواج من الخلايا الأمامية تقع حافة الرائدة تهاجر نحو خط الوسط بطني، حيث تلتزم والصمامات مع الجيران المقابل لها 6. ويعقب ذلك من خلال هجرة الخلفي تقع خلايا جيب، والتي تشكل إسفين مثل الأشكال خلق جيب بطني 6-7. ليست مفهومة جيدا الآلية التي يغلق الجيب. واحد الاحتمالات هو أن هيكل الأكتين الميوسين مقلص supracellular تربط الخلايا معا في جيب سلسلة محفظة مثل الأزياء، على غرار التئام الجروح 8. ومن المثير للاهتمام، يتم بوساطة هجرة بعض الخلايا جيب من قبل مجموعات فرعية معينة من neuroblasts الكامنة 9 (السلائف الخلايا العصبية التي توجد تحت epidermiق؛ الشكل 1B).

وأظهرت دراسات سابقة أن neuroblasts تنظيم الهجرة الخلية البشرة بطني والعلبة بطني. يتم التعبير عن VAB-1 (Ephrin مستقبلات) وVAB-2 (Ephrin يجند) غاية في neuroblasts وتسهيل فرز الأمامي والخلفي neuroblasts عن بعضها البعض، و الطفرات في VAB-1-2 أو VAB قضية الضميمة بطني الظواهر 10-13. ومع ذلك، أظهرت التجارب الانقاذ المروج ما هو مطلوب أيضا VAB-1 في خلايا البشرة المغطي بطني ومستقبلات للالعظة التوجيه الأخرى التي يفرزها neuroblasts يتم التعبير عنها في خلايا البشرة بطني 9. على الرغم من الطفرات في أي من هذه المستقبلات يسبب الظواهر الضميمة بطني، فإنه ليس من الواضح ما إذا كانت العيوب تنشأ بسبب مشاكل في أرومة عصبية لتحديد المواقع أو بسبب فشل خلايا البشرة بطني للرد على توجيهات جديلة 14. تغيير تقسيم neuroblasts وايthout تؤثر على قدرتهم على إفراز العظة التوجيه يمكن أن تسلط الضوء على دور neuroblasts وقدرتها على توفير المدخلات الميكانيكية خلال البشرة التشكل. في الآونة الأخيرة، فقد وجد أن الجين انقسام الخلايا، العاني-1 (anillin) ويعبر عن درجة عالية في neuroblasts (الشكل 2A) واستنزافها يسبب تشوهات الانقسام أرومة عصبية. ومن المثير للاهتمام، وعرض هذه الأجنة الظواهر الضميمة بطني (Fotopoulos، Wernike وPiekny والملاحظات غير منشورة).

مطلوب Anillin لانقسام الخلايا، وخاصة بالنسبة الانقسام السيتوبلازمي، الذي يصف عملية حيث يقسم الخلية الأم إلى خليتين جسديا ابنة. هو الدافع وراء الانقسام السيتوبلازمي قبل تشكيل عصابة مقلص أكتوميوزين، الذي يحتاج الى رقابة مشددة في المكان والزمان لضمان أن يقترن بشكل صحيح مع الكروموتيد العزل. المنظم سيد الانقسام السيتوبلازمي metazoan هو RhoA (RHO-1 في C. ايليجانس)، وGTPase الصغيرة التي هيالتفاعلية الذي نظمه في شكل محدد GTP لها. مرفق البيئة العالمية Ect2/ECT-2 ينشط RhoA، وبعد ذلك يتفاعل RhoA-GTP مع المستجيبات المصب التي تشكل حلقة مقلص والتوسط في ingression 15. Anillin هو بروتين المجال متعددة التي تربط لRhoA عبر لمحطة سي والأكتين والميوسين لها عبر N-محطة. مطلوب Anillin لتحقيق الاستقرار في الموقف من الحلبة مقلص في خلايا الثدييات أو ذبابة الفاكهة S2 16. استنزاف Anillin يسبب حلقات مقلص للخضوع التذبذبات الجانبية، والانقسام السيتوبلازمي في نهاية المطاف فشل تشكيل خلايا متعدد النوى 17-19. ومن المثير للاهتمام، على الرغم من C. ايليجانس العاني-1 إحداثيات أكتوميوزين انقباض في الجنين في وقت مبكر، فإنه ليس من الضروري لالحرائك الخلوية. ومع ذلك، كما هو موضح أعلاه، مطلوب العاني-1 لأرومة عصبية الانقسام السيتوبلازمي خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني (Fotopoulos، Wernike وPiekny والملاحظات غير منشورة). ان الفشل الانقسام السيتوبلازمي تغيير عدد وموقف neuroblasts ويمكن أن تؤثر على الموضعأوجه من العظة التوجيه الكيميائية، أو أنها يمكن أن يغير من الخواص الميكانيكية للأنسجة. تسليط الضوء على دور كلا النموذجين nonautonomous من neuroblasts لالضميمة بطني، وأهمية التواصل الأنسجة الأنسجة أثناء التطور الجنيني.

يصف هذا البروتوكول التجريبي كيفية انقسام الخلية خلال الصورة C. ايليجانس منتصف مرحلة التطور الجنيني باستخدام المجهر مضان. وقد أجريت غالبية التجارب دراسة آليات انقسام الخلايا في الخلايا واحد داخل أطباق الثقافة (على سبيل المثال. هيلا أو خلايا S2) أو في الأجنة في وقت مبكر مع عدد محدود من الخلايا (على سبيل المثال جيم ايليجانس الجنين خلية واحدة، القيطم، أو شوكي الأجنة). ومع ذلك، فمن المهم دراسة أيضا انقسام الخلايا داخل الأنسجة، كما أن هناك منبهات الخارجية التي يمكن أن تؤثر على توقيت ووضع الطائرة الانقسام. علاوة على ذلك، يمكن أن توفر الخلايا الاشارات الكيميائية أو الميكانيكية للتأثير على نمو أنسجة المجاورةق، وأنه من المهم أن نفهم كيف تساعد على التواصل بين الخلايا الأنسجة لتشكيل خلال التنمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد لوحات للحفاظ على سلالات دودة والمسرحية رني

  1. لوحات وسائط النمو الخيطية
    1. لوحات
      1. إعداد وسائط النمو النيماتودا (NGM) لوحات للحفاظ على سلالات دودة وأداء الصلبان الوراثية. الجمع بين 3 غرام كلوريد الصوديوم، 17 غ أجار و 2.5 غ BactoPeptone مع 1 لتر من الماء المقطر في دورق 2 لتر وإضافة شريط التحريك المعادن.
      2. الأوتوكلاف القارورة حل أجار وتعقيم وسائل الإعلام. ثم ضع القارورة على طبق من ضجة والسماح لوسائل الإعلام لتبريد مع التحريك.
      3. بمجرد أن يبرد إلى أسفل وسائل الإعلام لا يزال دافئا بعض الشيء للمس (45-50 درجة مئوية)، إضافة 1 مل 1 M و CaCl 2، 1 مل 1 M MgSO 4، 1 مل من محلول 5 الكولسترول ملغ / مل و 25 مل 1 M العازلة فوسفات البوتاسيوم (PPB؛ صفة في الجدول الكواشف / المواد؛ فلتر تعقيم الحلول الأسهم) وتصب على الفور وسائل الإعلام في أطباق بتري الصغيرة (60 ملم × 15 ملم؛ ملء الأطباق ~ 3/4 إلى الأعلى أو 13 مل / لوحة باليودنانوغرام على موزع الآلي). ملاحظة: للحصول على الصيانة على المدى الطويل لبعض سلالات التتراسيكلين يمكن أن تضاف إلى لوحات (12.5 ميكروغرام / مل) للسماح TN10 ينقول تعطيل الجينات البكتيرية من ريبونوكلياز الثالث.
      4. دعونا وسائل الإعلام يصلب بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: يجب أن تبقى لوحات في غطاء بيولوجية أو في مساحة المختبر التي هي أقل عرضة للتلوث. أيضا، إزالة أي التكثيف التي تراكمت على الأغطية (على سبيل المثال نظيفة مع المناديل الورقية) للحد من التلوث الفطرية. إذا تم إضافة التتراسيكلين أيضا في لوحات، ثم تغطيتها بورق الألومنيوم وهذه المضادات الحيوية هي الحساسة للضوء.
      5. في اليوم التالي، البذور الجافة لوحات NGM مع تعليق E. القولونية (سلالة OP50، وانظر القسم 1.1.2) التي تم vortexed بلطف. لجعل لوحات للتزاوج، إضافة ~ 50 ميكرولتر من OP50 إلى مركز كل لوحة (لتشكيل دائرة صغيرة). لجعل لوحات للحفاظ على سلالات دودة، البذور كل لوحة NGM مع ~ 100-200 ميكرولتر من OP50 (لتأكد من أنها تغطي مساحة أكبر من لوحة).
      6. السماح لوحات الجافة المصنف O / N في درجة حرارة الغرفة.
      7. في اليوم التالي، وتحويل لوحات NGM المجففة رأسا على عقب ورصها في حاويات التخزين البلاستيكية في 4 درجات مئوية. ملاحظة: لوحات صالحة للاستعمال ما يصل إلى ~ 3-4 أسابيع. يجب أن تبقى لوحات تحتوي على التتراسايكلين في الظلام.
    2. غذاء
      1. استخدام E. القولونية OP50 [من مركز علم الوراثة انواع معينة (CGC؛ http://www.cbs.umn.edu/cgc)] كمصدر للغذاء لC. . ايليجانس ملاحظة: OP50 يمكن تخزينها كما أسهم الجلسرين في -80 درجة مئوية (نسبة 1:1 في 50٪ ت / ت الجلسرين).
      2. لجعل OP50 لوحات NGM، وجعل لوحة متتالية باستخدام قسامة صغيرة من الجلسرين الأسهم (<10 ميكرولتر؛ استخدام غيض ماصة معقمة). انتشرت البكتيريا على صفيحة أجار LB (وصفة في الجدول الكواشف / المواد) ونترك الامر عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ~. ملاحظة: إذا كان هناك مشاكل مع التلوث، ويمكن استخدام الستربتوميسين OP50 مقاومة، والثانية الستربتوميسين يمكن أن تضاف إلى لوحات أجار LB (50 ميكروغرام / مل).
      3. في اليوم التالي، واختيار مستعمرة واحدة وتطعيم 100 مل من السائل وسائل الإعلام LB (وصفة في الجدول الكواشف / المواد) في قارورة 500 مل.
      4. السماح للثقافة تنمو O / N عند 37 درجة مئوية مع الهز.
      5. في اليوم التالي، استخدم تعليق البكتيرية لبذر وحات NGM. ملاحظة: OP50 يمكن aliquoted في أنابيب مخروطية 50 مل وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 4-6 أسابيع ~.
  2. رني
    التغذية هي واحدة من الطرق الرئيسية لأداء RNA بوساطة التدخل (رني؛ لضربة قاضية منتج جين معين) في C. ايليجانس جيم المنحرفين ايليجانس يمكن تغذية E. كولاي سلالة HT115 تحولت مع ناقلات التغذية التي تعبر عن الرنا المزدوج الجديلة على الاستقراء. تبث هذه الرنا المزدوج الجديلة (أو شظاياه) إلى الغدد التناسلية، مما يؤدي عادة في ضربة قاضية كبيرة من الهدف جين معين.
    1. لوحات رني
      1. إعداد لوحات NGM كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 1.1.1)، ولكن أيضا إضافة 1 مل من 1 M IPTG (isopropylthio بيتا-D-غالاكتوزيد؛ للحث على التعبير عن الرنا المزدوج الجديلة) و 500 ميكرولتر من 50 ملغ / مل الأمبيسلين (الأمبير، وناقلات معربا عن الرنا المزدوج الجديلة هي الأمبير مقاومة) إلى وسائل الإعلام الدافئة (45-50 درجة مئوية).
      2. بعد أن جفت لوحات، والبذور لهم ~ 50-100 ميكرولتر من E. القولونية HT115 (انظر القسم 1.2.2). ملاحظة: يمكن تخزين لوحات غير المصنف في 4 درجة مئوية لمدة 4-5 أسابيع ~.
      3. السماح لوحات المصنف تجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
      4. في اليوم التالي، وتحويل لوحات رني المجففة رأسا على عقب وتخزينها في حاوية تخزين بلاستيكية في 15-20 درجة مئوية. ملاحظة: لوحات مصنف الاحتفاظ كفاءة رني لمدة تصل إلى ~ 2-3 أسابيع.
    2. رني الغذاء
      1. استخدام E. القولونية HT115 (من CGC، وانظر القسم 1.1.2) تحولت مع ناقلات L4440 التغذية، أو L4440 تحتوي على كدنا] إلى الجينات في المصالح. ملاحظة: تغذية المكتبات التي تستهدف غالبية إطارات القراءة المفتوحة في الجينوموقد أجريت بالفعل، وتتوفر (الحيوانات المستنسخة في L4440 تتحول إلى HT115، على سبيل المثال تحتوي على جزء من Y49E10.19 لالعاني -1 20-21؛ http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / صفحات / rnai.html). ملاحظة: HT115 يمكن أن تظل كما أسهم الجلسرين في -80 درجة مئوية (نسبة 1:1 في 50٪ ت / ت الجلسرين).
      2. لإنشاء بناء جديد استهداف الجينات في المصالح، راجع L4440 خريطة النواقل واستنساخ [كدنا] بين المروجين T7 المرافقة، والتي هي محرض من قبل IPTG.
      3. تحويل HT115 مع بناء L4440 باستخدام بروتوكول قياسي للتحول (على سبيل المثال جعل البكتيريا المختصة كيميائيا وأداء حرارة التحول صدمة).
      4. كما هو موضح لOP50 (انظر القسم 1.1.2)، وينبغي أن تحتوي على البكتيريا متتالية من المخزون الجلسرين على صفيحة أجار LB، ولكن أيضا لوحة 50 ميكروغرام / مل من أمبيسيلين. ملاحظة: إذا كنت تستخدم قبل بناء L4440 القائمة، تخطي أقسام 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. اختيار مستعمرة واحدة وتطعيم 5 ملمن وسائل الاعلام LB تحتوي على 5 ميكرولتر من الأمبيسلين من 50 ملغ / مل الاسهم (LB الأمبير)، ووضعه عند 37 درجة مئوية مع الهز.
      6. بعد 16 ساعة ~، تلقيح 5 مل من وسائل الإعلام LB الطازجة أمبير مع 50 ميكرولتر من ثقافة O / N وتنمو ثقافة لمدة 7-8 ساعة مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية.
      7. أجهزة الطرد المركزي البكتيريا لمدة 1 دقيقة في 4،000-8،000 x ج، تجاهل طاف و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من الطازجة وسائل الإعلام LB الأمبير.
      8. استخدام هذا الحل البكتيرية على البذور لوحات رني كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 1.2.1). ملاحظة: HT115 ينبغي استخدامها على الفور، وينبغي ألا يتم تخزينها.

2. زراعة سلالات دودة

الحفاظ على C. سلالات ايليجانس أمر من CGC على لوحات NGM وفقا لبروتوكول القياسية 1. السلالات المستخدمة لهذا البروتوكول ما يلي: C. ايليجانس فار بريستول، من النوع البري (ID سلالة في CGC N2)؛ UNC-119 (tm4063)؛ wgIs102 [لحم الخنزير-1 UNC-119 (+)] (ID السلالة في CGC OP102)؛ UNC-119 (ED3)؛ ltIs44pAA173 [فطيرة-1P-mCherry :: PH (PLC1delta1) + UNC-11 9 (+)] (ID سلالة في CGC OD70)؛ AJM-1 (ok160)؛ jcEx44 [AJM-1 :: GFP + رول-6 (su1006)] (ID سلالة في CGC SU159)؛ UNC-119 (ED3) ؛ xnIs96 [pJN455 (HMR-1P :: HMR-1 :: GFP :: UNC-54 3'UTR + UNC-119 (+) [(ID سلالة في CGC FT250).

  1. اختيار ~ 3 المنحرفين الشباب البالغين التي تعرض النمط الظاهري الصحيح إلى لوحة NGM الطازجة. ملاحظة: N2 (var. بريستول؛ من النوع البري) لا يمكن الحفاظ عليه بين 15-25 درجة مئوية، لكنها لن تصل الكثافة أسرع عند ارتفاع درجات الحرارة. وينبغي بذل الأسهم الجديدة عند كثافة دودة عالية.
  2. إبقاء جميع سلالات الفلورسنت (مثل GFP و / أو الديدان، معربا عن mCherry) في 20-25 درجة مئوية لمدة التعبير الأمثل من البروتينات الفلورية. وينبغي بذل الأسهم الجديدة عند كثافة عالية ودودة الغذاء منخفضة.
  3. لاختيار الديدان، واستخداماختيار مصنوعة من الزجاج ماصة سحبت مع سلك البلاتين تنصهر في نهاية سحبت (~ 3-5 سم في الطول). تتسطح السلك مع حافة ناعمة. استخدام معول ل'سبقا' حتى المنحرفين ونقلها على لوحات جديدة. لهب في السلك بين استخدام لتجنب التلوث المتبادل من السلالات.

3. رني

  1. أداء رني
    1. الأولى، ومكان ~ 8 المنحرفين L4 على لوحة NGM غير المصنف ل~ 30-60 دقيقة لإزالة البكتيريا OP50 من الديدان.
    2. ثم ضع 8 المنحرفين على لوحة NGM الأمبير IPTG المصنف مع HT115 التي تحمل البلازميد L4440 التعبير عن الرنا المزدوج الجديلة إلى الجينات في المصالح (على سبيل المثال العاني-1، وانظر 1.2) ل~ 24 ساعة. ملاحظة: اعتمادا على الجينات في المصالح، أو الظواهر المطلوب (والتي قد تعتمد على قوة ضربة قاضية)، والديدان يمكن أن تترك على لوحات رني لفترات أقصر أو أطول من الوقت (بعد 24 ساعة، ضع المنحرفين على رني جديدة لوحات).
    3. لNEGالسيطرة اطر النسبية، والديدان مكان على صفيحة رني المصنف مع HT115 تحمل ناقلات L4440 فارغة. ملاحظة: يجب أن يكون لهذه الأجنة لا الظواهر.
    4. لمراقبة إيجابية، ووضع الديدان على لوحة رني التعبير عن الرنا المزدوج الجديلة التي تستهدف الجين مع الظواهر تتميز جيدا. ملاحظة: للحصول على رو-1 (Y51H4A.3) والأجنة هي 100٪ قاتلة بعد 24 ساعة والمنحرفين هي عقيمة بعد 48 ساعة.
  2. رني فعالية
    وينبغي اختبار مستويات ضربة قاضية من قبل رني، لا سيما منذ بعض الأنسجة قد يكون أكثر مقاومة من غيرها. خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر منتصف، ومعظم الأنسجة هي رني الحساسة، ولكن في الجنين في وقت متأخر أو اليرقة، الخلايا العصبية هي مقاومة للرني. سلالات مختلفة يمكن استخدامها لتحسين حساسية رني (مثل قوة الرد السريع-3)، أو لتوليد الأنسجة محددة رني (مثل SID-1 في توليفة مع التحوير التي أعرب عنها العصبية المروج UNC-119).
    1. التنشيف الغربية
      Immunoblotting باستخدام C. ايليجانس يمكن أن تكون البروتيناتأجريت وفقا لبروتوكول قياسي 22.
      1. بعد أداء رني، وجمع 10 ~ حامل (مليئة الأجنة) المنحرفين في أنبوب microcentrifuge، إضافة 20-30 ميكرولتر 1X SDS-PAGE عينة العازلة وليز من قبل المغلي لمدة 2 دقيقة ~. وبالمثل، وجمع الديدان N2 في أنبوب منفصلة عن العينة الضابطة. ملاحظة: قد تختلف عدد من المنحرفين تبعا لحساسية الأجسام المضادة الأولية.
      2. إنشاء التخفيفات من العينة الضابطة (على سبيل المثال 3-100٪) في عينة العازلة. تحميل عنصر التحكم وعينات رني ويديرها SDS-PAGE وفقا لبروتوكول قياسي (ستختلف الجل٪ اعتمادا على حجم البروتين من الفائدة).
      3. نقل الجل إلى غشاء وأداء immunoblotting حسب بروتوكول قياسي. ملاحظة: استخدام مختلف التخفيفات الأجسام المضادة الأولية والثانوية على النحو الموصى به لكل الأجسام المضادة.
      4. تطوير (على سبيل المثال في حالة استخدام لمعان كيميائي) أو مسح (على سبيل المثال في حالة استخدام مضان) لطخة مناعية وقارن بين الالكثافة (ه) من العصابات في الممرات N2 مقابل الممر رني، وتحديد مستوى ضربة قاضية (مثل كثافة حارة رني مباريات سيطرة حارة 12٪، وهذا يشير إلى أن البروتين هو انخفاض بنسبة 88٪). ملاحظة: لمعرفة كفاءة ANI-1 ضربة قاضية، انظر مادوكس وآخرون 23.
    2. المناعية
      المناعية في C. ايليجانس لا يمكن أن يؤديها وفقا لبروتوكول قياسي 22.
      1. بعد أداء رني، وجمع المنحرفين حامل والأجنة الحصاد باستخدام واحدة من طريقتين. واحدة من الطرق، المنحرفين مكان في M9 العازلة (وصفة في الجدول الكواشف / المواد) في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge siliconized وبيليه عن طريق الطرد المركزي (1،000-4،000 x ج). ملاحظة: وبالمثل جمع N2 المنحرفين حامل.
      2. إزالة الحل M9.
      3. طرد الأجنة عن طريق إضافة 1 مل من محلول التبييض (1 M هيدروكسيد الصوديوم، 5٪ التبييض) إلى أنبوب microcentrifuge لمدة 3 دقائق. وبالمثل، التبييض N2 انهrmaphrodites لجعل الشرائح السيطرة.
      4. دوامة بلطف، ثم بيليه على الفور الأجنة عن طريق الطرد المركزي (4،000-8،000 x ج) وإزالة حل التبييض. ملاحظة: الوقت الكلي الذي يتم تحضين الديدان مع التبييض يجب أن لا تتجاوز 5 دقائق.
      5. غسل الأجنة 3x أخرى مع تريس مخزنة المالحة (TBS، و 50 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم) ونقل الأجنة باستخدام ماصة باستير الزجاج على بولي-L-يسين المغلفة المجهر الشريحة. ملاحظة: لمعطف شريحة المجهر والزجاج مع بولي-L-يسين، ويمسح الشريحة الأولى، ثم تضاف قطرة (~ 20-30 ميكرولتر) من بولي-L-يسين وانتشاره بالتساوي على السطح واسمحوا الجافة. لأفضل النتائج، ومعطف الشرائح مرتين أخريين. طريقة بديلة لجمع الأجنة (الأقسام 3.2.2.1-3.2.2.5) هو وضع قطرة من M9 على بولي-L-يسين المغلفة المجهر الشريحة واختيار ~ 10 المنحرفين حامل في الهبوط.
      6. إضافة ساترة على رأس كل شريحة المجهر (إلى المنطقة التي تحتوي على أكثر من الأجنة) ومكانالشرائح في النيتروجين السائل. ملاحظة: للحصول على المنحرفين وضعها مباشرة في انخفاض، الضغط على ساترة لكسر فتح المنحرفين وطرد الأجنة.
      7. تجميد الأجنة عن طريق كسر عبها خارج لل coverslips مباشرة بعد تجميدها في النيتروجين السائل.
      8. وضع الشرائح في الميثانول الباردة الجليد لمدة 20 دقيقة لإصلاح الأجنة. ملاحظة: بالنسبة لبعض المستضدات، وهو مثبت يشابك مثل امتصاص العرق قد يكون من الأفضل. انظر البروتوكول من دوير 22.
      9. ترطيب وpermeabilize الأجنة عن طريق الغسيل الشرائح 4X مع تريس مخزنة المالحة التي تحتوي على توين-20 (TBST؛ 50 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.1٪ توين 20) لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      10. تجف كل شريحة في جميع أنحاء المنطقة التي تحتوي على أكثر من الأجنة ورسم دائرة حول الأجنة باستخدام قلم حجب السائلة (مثل PAP القلم).
      11. إضافة ~ 100 ميكرولتر من TBST مع 5٪ مصل حمار عادي (NDS؛ كتلة) إلى كل شريحة (منطقة دائري)، واحتضان ل20 دقيقة في RT. ملاحظة: ضع الشرائح في 'غرفة الرطب "(على سبيل المثال طبق مع غطاء يحتوي على مناشف ورقية مبللة).
      12. إزالة الكتلة، إضافة ~ 50-100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (مخففة في TBST) إلى كل شريحة (منطقة دائري)، واحتضان لمدة 2 ساعة على RT. ملاحظة: اعتمادا على الأجسام المضادة، وتخفيف والحضانة الوقت قد تختلف. للكشف عن GFP، ونحن نستخدم مضاد للماوس الأجسام المضادة الأولية مكافحة GFP في التخفيف 1/200. للكشف عن ANI-1، ونحن نستخدم مضاد للأرنب المضادة للANI-1 الأجسام المضادة الأولية في التخفيف 1/1600 (شريطة تفضلت ايمي Shaub مادوكس، UNC تشابل هيل). للمرة الحضانة أطول، ضع الشرائح في 4 درجات مئوية.
      13. إزالة الأجسام المضادة الأولية (إن أمكن، والحفاظ على لاستخدامها في المستقبل) وتغسل الشرائح 3X مع TBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
      14. إزالة غسل الماضي وإضافة ~ 50-100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (المخفف في TBST) إلى كل شريحة (منطقة دائري)، واحتضان لمدة 2 ساعة على RT. ملاحظة: اعتمادا على الأجسام المضادة، قد تختلف التخفيف. للكشف عن GFP، ونحن استخدام لNTI الفأر اليكسا فلور 488 الضد الثانوية في 1/250 التخفيف. للكشف عن ANI-1، ونحن نستخدم مضاد للأرنب اليكسا فلور 568 الضد الثانوية في 1/250 التخفيف.
      15. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وتغسل شرائح 3x أخرى مع TBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. ملاحظة: لوصمة عار الحمض النووي، إضافة ~ 50-100 ميكرولتر من دابي (4 '،6-diamidino-2-phenylindole؛ 1 ملغ / مل) في 1/500 التخفيف في TBST لمدة 5 دقائق.
      16. إزالة دابي وتغسل الشرائح 2X مع TBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. ملاحظة: إذا لم يتم تنفيذ تلطيخ دابي، تخطي هذه الخطوة غسل إضافية.
      17. نفذ أحد غسل سريع مع 0.1M تريس (الرقم الهيدروجيني 9)، وإزالة وإضافة 15 ميكرولتر ~ من وسائل الإعلام تصاعد prewarmed إلى 37 درجة مئوية (4٪ ن ن 3.4.5-trihydroxybenzoate (بروبيل غالات)، و 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة في 9 50٪ الجلسرين) إلى كل شريحة (منطقة دائري).
      18. إضافة ساترة إلى كل شريحة (على رأس وسائل الإعلام المتصاعدة في المنطقة دائري)، الفتيل قبالة السائل الزائد وختم الشرائح مع طلاء الأظافر. ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية.
      19. مراقبة الأجنة علىالشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت widefield أو المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر. الأهم من ذلك، ضبط إعدادات لجمع الصور من الأمثل كثافة بكسل باستخدام التحكم (N2 أو غير رني) الأجنة. ثم، وجمع الصور من الأجنة رني باستخدام نفس الإعدادات. أمثلة من الصور التي تم جمعها من أجل السيطرة مقابل وتظهر العاني-1 رني الأجنة في الشكل 2B.

4. إعداد الشرائح للتصوير لايف وحصاد الأجنة

  1. إعداد منصات الاغاروز للتصوير الحية
    1. وضع نظيفة، قبل تحسنت شريحة المجهر بين اثنين من الشرائح الأخرى، ولكل منها 1-2 شرائح من الشريط عليها.
    2. باستخدام ماصة باستير الزجاج، إضافة قطرة واحدة من 2٪ ث / ت الاغاروز (المذاب في الماء المقطر ساخنة) إلى الشريحة.
    3. وضع بسرعة في الثانية، شريحة المجهر نظيفة على رأس الشريحة الأولى بطريقة عمودية لشد قطرة الاغاروز. ملاحظة: انخفض الشريط على المجاورةتقدم وفاق سمك لوحة.
    4. السماح للالاغاروز وسادة جافة لمدة 1-2 دقائق قبل إزالة الشريحة العليا. الشريحة خارج الشريحة الأعلى بعناية لتجنب كسر لوحة الاغاروز تحتها. ملاحظة: في بعض الأحيان يتم نقل لوحة إلى الشريحة الأعلى ومازالت صالحة للاستعمال، طالما أنها لا تزال سليمة.
    5. نقل الأجنة على لوحة الاغاروز في غضون بضع دقائق بعد إعداده على النحو المبين أدناه (انظر الخطوة 4.2). ملاحظة: يجب أن يكون وسادة مظهر مبهمة؛ مرة واحدة فمن الواضح، فمن جافة جدا للاستخدام.
  2. حصاد الأجنة
    1. استخدام بروتوكول التالية لجمع الأجنة للتصوير الحية، وهي مشتقة من Sulston وآخرون 24
    2. اختيار حوالي 4-6 البالغين حامل (لا جوعا) من NGM أو رني لوحات ووضعها في 20-30 ميكرولتر من العازلة M9 في بئر على شريحة الاكتئاب.
    3. استخدام مشرط معقم لقطع الديدان على جانبي spermatheca (أو بدلا من ذلك قرب الفرج) لالإفراج الأجنة في الحل.
    4. استخدام خرطوم مطاطي مع قطعة الفم متصلة الزجاج الشعرية / ماصة سحبت أن يكون لها تجويف صغيرة وشفط الأجنة عن طريق الفم pipetting ل. بدلا من ذلك، جمع الأجنة مع أنبوب زجاجي الشعرية التي يتم تركيبها على ماصة باستير لمبة المطاط.
    5. نقل الأجنة إلى بئر شفط الثانية تحتوي أيضا العازلة M9، للمساعدة في تفصلهم عن الحطام دودة.
    6. ثم، شفط الأجنة على لوحة الاغاروز الطازجة (راجع الخطوة 4.1).
    7. الأجنة أجمة معا باستخدام رمش (لصقها على اختيار الأسنان) لزيادة عدد الأجنة التي يمكن أن يتم تصويره في واحدة خ، ذ الطائرة. ملاحظة: لتجنب الحرمان من الأكسجين، لا تتجمع أكثر من 10 الأجنة معا.
    8. المقبل، وتغطي الشريحة مع ساترة وختم جزئيا مع ما قبل ساخنة VALAP السائل (الفازلين، اللانولين والبارافين؛ ذاب و01:01:01 مجتمعة) لمنع جفاف الأجنة أثناء التصوير. ملاحظة: إضافية M9 العازلة كاليفورنيان أن تضاف إلى لوحة لضمان أن الأجنة يكون السائل يكفي للتصوير. في مكان VALAP، الفازلين يمكن استخدامها لاغلاق جزئي coverslips، وإنما هو أقل جمودا مما تسبب لل coverslips أن ينزلق ويمكن الحصول على الأهداف المجهر.

5. التصوير الحية

  1. لتصور neuroblasts، للحصول على سلالة الدودة التي تعبر عن البروتين أرومة عصبية محددة تعلق على بروتين فلوري (على سبيل المثال HAM-1: GFP، ID سلالة في CGC OP102). للكشف عن أغشية الخلايا، استخدم سلالة دودة أن يعرب أيضا عن مجال البروتين الذي يعترف الدهون تعلق على بروتين فلوري مختلفة (مثل mCherry: PH، ID سلالة في CGC OD70).
  2. الأجنة الحصاد من المنحرفين الفلورسنت أبقى على السيطرة أو العاني-1 لوحات رني (انظر بروتوكولات 3 و 4)، وإعداد الشرائح كما هو موضح أعلاه (انظر البروتوكول 4).
  3. الأجنة الصورة في 4D (س، ص، ض والوقت الفاصل) بواسطة المجهر epifluorescence. استخدام إما واينظام defield [المجهر الفلورسنت الآلي مع المرشحات للGFP وTexasRed والأهداف يصل إلى 60X أو 100X، عالية الدقة CCD (تهمة جانب الجهاز) الكاميرا، وآلية للغاية مرحلة (على سبيل المثال. بيزو Z) وبرنامج الحصول المتخصصة] أو livescan اجتاحت الميدان المجهر متحد البؤر [الآلي المجهر الفلورسنت مع 488 نانومتر و 561 نانومتر ليزر، أهداف تصل إلى 100X، (الإلكترون ضرب اتفاقية مكافحة التصحر) وكاميرا لEMCCD، بمحركات عالية المرحلة (مثل بيزو Z) وبرنامج الحصول المتخصصة]. ملاحظة: بالنسبة لنظام widefield، وذلك باستخدام المصابيح وكاميرا EMCCD سيحد الضيائية. أيضا، المجهر متحد البؤر القرص الغزل يمكن استخدامها بدلا من نظام اجتاحت الميدان.
  4. لانقسام الخلايا صورة أرومة عصبية على أي نظام، والعثور س، ذ إطارات للأجنة باستخدام أهداف 10X 20X أو، واختيار الأمثل خ، ذ الإطار حيث الأجنة تشهد إقحام الظهرية (الخطوة قبل الضميمة بطني؛ الشكل 1A) أو هي في المراحل المبكرةمن الضميمة بطني (~ 350 دقيقة بعد انقسام الخلية الأولى؛ الشكل 1A).
  5. على المجهر حقل اجتاحت، استخدم نانومتر 488 و 561 نانومتر ليزر 100 ميغاواط في السلطة 40٪ مع شق ال 50. على النظام widefield، واستخدام المرشحات GFP وTexasRed مع انخفاض المتوسطة شدة الضوء (إذا كان يمكن السيطرة عليها). ملاحظة: بالنسبة لنظام widefield، المصابيح ديهم انخفاض الضيائية وهي الأفضل.
  6. على أي نظام، واستخدام أهداف الغمر النفط 60X أو 100X وجمع 20 Z-أكوام من 0.2 ميكرومتر كل 2 دقيقة ليصبح المجموع 10 دقيقة. ملاحظة: على الرغم من أن HAM-1: GFP وmCherry: تحقيقات PH التعبير عند مستويات مرتفعة نسبيا، فإن التعرض مرات لكل التحقيق يجب أن يكون الأمثل للالمجاهر المختلفة. ملاحظة: بالنسبة لنظام widefield، ينصح أقل Z-المداخن للحد الضيائية والتصوير على مدى فترات أطول من الوقت، واستخدام نقاط زمنية أقل.
  7. لتقليل الضيائية الناجمة عن التعرض للأجنة لضوء الأشعة فوق البنفسجية على النظام widefield (إذا باستخدام الحائزاتلمبة أوروغواي)، إغلاق الفتحة إلى 30٪ وتقلل من شدة الضوء (باستخدام نظام إضاءة قابل للتعديل). ملاحظة: على الرغم من أن ليست هناك حاجة مكاسب باستخدام إما النظام، قد يكون المجاهر مصادر الضوء الأخرى مع شدة أقل أو أهداف مع فتحات العددية المختلفة، والتي يمكن أن تتطلب استخدام مكسب للحصول على صور من الأمثل كثافة بكسل. اختبار الظروف باستخدام الجنين الرقابة لضمان أن أي الظواهر احظ ليست بسبب الضيائية مصطنعة.

6. تحليل البيانات المجهر

  1. لتحليل الصور، وملفات التصدير والمشاجرات وفتح المشاجرات كما كومة باستخدام البرمجيات المتخصصة مثل جافا برنامج معالجة الصور (مثل يماغيج، المعاهد الوطنية للصحة، http://rsbweb.nih.gov/ij/). ملاحظة: اعتمادا على البرمجيات المستخدمة في جمع اقتناء الصور، وملفات يمكن الاحتفاظ بها في شكلها الأصلي وافتتح في ImageJ. هذا هو الأفضل كما يتم الاحتفاظ البيانات الوصفية مع الملفات.
  2. فصل مكدسفي 'الصور' وحدد نقاط الوقت وZ-طائرات كما تريد. ملاحظة: على الرغم من كومة من 20 Z-طائرات يؤخذ، فإن العديد من neuroblasts هي <1 ميكرون سميكة خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني في وقت متأخر، وهناك حاجة فقط عدد قليل من Z-الطائرات.
  3. Restack الطائرات Z المختارة لكل نقطة زمنية وجعل التوقعات Z-كومة منفصلة. ثم، كومة من التوقعات في كل مرة نشير معا لجعل التسلسل الزمني.
  4. إجراء تعديلات على السطوع / التباين وأو لكل قناة.
  5. ثم، حدد المنطقة من اهتمام، والمحاصيل (وتدوير إذا لزم الأمر) في المنطقة.
  6. إنشاء الصور المدمجة باستخدام وظيفة "قنوات دمج 'واختيار لون مختلف لكل قناة. تحويل الصور المدمجة إلى RGB.
  7. عكس الصور الرمادية لكل قناة من الخطوات 6.3 أو 6.4 (استخدام الدالة 'قلب' تحت عنوان 'تحرير') لتصور الصور أكثر وضوحا.
  8. حفظ جميع الصور النهائية كما المشاجرات 8 بت لجعل الأرقام في ناقل القائمة تحديثات برامج المزودهي برامج أو ملفات كويك تايم لجعل الأفلام.
  9. إذا كانت هناك حاجة قياسات حجم بكسل (على سبيل المثال لتشمل شريط النطاق مع الصور)، استخدم يماغيج، أو غيرها من برامج معالجة الصور لقياس حجم الجنين. ملاحظة: ستكون الصور التي تم جمعها باستخدام أهداف مختلفة وأحجام مختلفة بكسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصف هذا البروتوكول التجريبي كيفية انقسام الخلايا في صورة C. ايليجانس الأجنة خلال مرحلة التطور الجنيني منتصف. على وجه الخصوص، فهو يصف كيفية neuroblasts الصورة، التي قد تسهل البشرة التشكل. البشرة التشكل يحدث نتيجة لمزيج من التغييرات شكل الخلية البشرة، والهجرة والالتصاق، ولكن أيضا تعتمد على الاشارات الكيميائية أو الميكانيكية من neuroblasts الكامنة (الشكل 1B). وneuroblasts تفرز العظة التوجيه التي يتم تلقيها من قبل المستقبلات على سطح خلايا البشرة بطني، الذي ينظم 10،14،25 هجرتهم. وعلاوة على ذلك، فإن neuroblasts هي التكاثري للغاية، والتي قد توفر القوى الميكانيكية التي تسهم في هجرة خلايا البشرة بطني 26. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة انقسام الخلية أرومة عصبية خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني. أول والأجنة coexpressing علامات لتصور neuroblasts يتم إنشاؤها: (PH mCherry) (HAM-1 GFP) تمر الانقسام السيتوبلازمي. HAM-1: GFP عن GFP (بروتين الفلورية الخضراء) الموسومة البروتين الذي يموضع إلى أرومة عصبية نوى 27، وضروري لاستخدام لأن هناك العديد من الأنواع الأخرى خلية حاضرا خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني (> 300 خلية؛ الشكل 3). هذا أيضا بمثابة علامة جيدة لتقسيم الخلايا، لأن الحمض النووي في الكروموسومات يتكثف أثناء الانقسام. mCherry: PH هو بروتين فلوري mCherry الموسومة التي يتم التعبير من قبل المروج الأمهات (فطيرة-1)، ويحتوي المجال الدهون ملزم من PLC1 ∂ 1 28، والتي يموضع لأغشية الخلايا. هناك حاجة إلى هذا البروتين لتصور الانقسام السيتوبلازمي، عندما الغشاء والعصارة الخلوية قرصة في لفصل الخلية الأم إلى خليتين ابنة؛ الشكل 3؛ فيديو 1). على الرغم من أن هذا البروتوكول يصف كيفية تقسيم الصورة أرومة عصبية، (كما هو موضح من قبل HAM-1: التعبير GFP)، يمكن أن تستخدم علامات أخرى لتصور أنواع الخلايا الأخرى.

لتصور تقسيم neuroblasts والأجنة coexpressing HAM-1: GFP وmCherry: يتم تصوير PH كل 2 دقيقة (أي ما مجموعه 10 دقيقة). كل أرومة عصبية ليست سوى ~ 1-4 ميكرون في القطر، و<1 ميكرون سميكة، وأنه من الأفضل لاستخدام الهدف مع التكبير عالية (على سبيل المثال. 100X). علاوة على ذلك، العديد من Z-المداخن (~ 20) يتم جمعها مع حجم خطوة صغيرة (0.2 ميكرومتر) للتأكد من أن زوايا مختلفة من كل خلية (كروية الشكل) يتم تصويرها. لجمع هذا العدد الكبير من الصور دون المساس نقاط الوقت، فمن المستحسن مرحلة بمحركات عالية (على سبيل المثال بيزو Z مرحلة). بعد جمع سلسلة من الصور، ويتم تحليل ما للعثور على الخلايا في غضون بضعة Z-المداخن التي يتم تقسيم، ويتم تكثيف الحمض النووي، وingressed غشاء الخلايا الوليدة والجديدة وتشكيل (نقاط زمنية من المكدس المتوقعة من القنوات اندمجت هي هو مبين في الشكل 3A، وتظهر مداخن مختارة من القنوات اندمجت في الشكل 3B؛ فيديو 1). لتصور أفضل للخلايا، فمن المستحسن لإبقاء كل قناة في الرمادي وعكس الصور (مثل الشكل 4).

دقة وضوح الصورة هو مختلف عن نظام widefield باستخدام كاميرا CCD عالية الدقة (1344 x 1024 بكسل) مباراة. النظام اجتاحت الحقل باستخدام كاميرا EMCCD بسرعة عالية مع حساسية عالية (~ 35 لقطة / ثانية و 512 X 512 بكسل). يتم عرض الصور مقلوب تقسيم neuroblasts من أجنة الرقابة المتخذة مع كل من أنظمة للمقارنة (الشكل 4 مقابل 5). كما هو مبين في الشكل 4A (نظام widefield؛ فيديو 2)، والصور أكثر وضوحا مقابل الشكل 5A. (نظام اجتاحت الميدان؛ فيديو 4). ومع ذلك، عند استخدام نظام widefield والأجنة عرضة للالضيائية ونقاط زمنية أسرع ليست ممكنة مع كاميرا عالية الدقة. على سبيل المثال، لدراسة التغيرات في توطين البروتينات المختلفة (على سبيل المثال. رس دراسة التغيرات في ديناميتها)، قد تحتاج النقاط الزمنية التي سيتم جمعها في أكثر الأحيان. أيضا، فإنه قد لا يكون من الممكن على الصورة لفترات أطول من الزمن دون التقليل من عدد من Z-مداخن ونقاط الوقت. باستخدام كاميرا EMCCD على النظام widefield قد تسمح مجموعة واسعة من تطبيقات التصوير. وقد وضعت الكاميرات التي لديها كل دقة عالية وسرعة عالية، ولكن السائقين قد لا تكون متاحة اعتمادا على البرمجيات المستخدمة الاستحواذ، وأنها لا تزال قد لا تكون حساسة مثل الكاميرات EMCCD. نظام آخر يستخدم عادة للتصوير C. ايليجانس هو متحد البؤر القرص الغزل، التي لديها أيضا أقل الضيائية ويمكن تجهيزه إما EMCCD أو CCD الكاميرات (انظر مناقشة).

لدراسة الجينات المطلوبة لانقسام الخلايا، ويتم التعامل مع المنحرفين رني ضد الجينات في المصالح (على سبيل المثال العاني-1، وانظر الأقسام 1.2 و 3 من البروتوكول) ويتم تصوير الأجنة في نفس الطريقة كما كنترولالأجنة لتر. لمقارنة الخلايا من الأجنة رني للسيطرة على الأجنة، فمن الأفضل أن الصورة مشابهة في مراحل التطور الجنيني (للمساعدة في الأشكال خلية مباراة والمواقف). على سبيل المثال، هناك خلية أكبر مرئية في وسط الجنين أثناء الضميمة بطني التي يمكن أن تكون بمثابة نقطة مرجعية جيدة لneuroblasts التصوير (أرقام 4 و 5). درس الجين هنا، العاني-1 (anillin)، وينظم أكتوميوزين انقباض، ولكن ليس هو المطلوب لالحرائك الخلوية في الجنين في وقت مبكر 23،29-30. المتماثلات Anillin، ومع ذلك، هناك حاجة لالحرائك الخلوية في أعلى حقيقيات النوى 16، والعاني 1 مطلوب للأرومة عصبية الانقسام السيتوبلازمي (Fotopoulos، Wernike وPiekny والملاحظات غير منشورة). كما هو مبين في الأرقام 4B (فيديو 3) و 5B (فيديو 5)، عدة neuroblasts بدء الانقسام السيتوبلازمي والأغشية قرصة في، ولكن بدلا من تشكيل اثنين ابنة منفصلةالخلايا، والأغشية تتراجع وتصبح الخلايا متعدد النوى (> 1 النواة / خلية). يجب الإشارة إلى أن العاني-1 قد تكون هناك حاجة لتغيير تقسيم أو شكل من أنواع الخلايا الأخرى، والتي لم يتم الكشف عنها من قبل هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول لا تظهر النتائج من الأنسجة رني محددة (انظر مناقشة).

الشكل 1
الشكل 1. الضميمة بطني أثناء C. ايليجانس البشرة التشكل. أ) التوقعات Z-كومة (3 مداخن Z-0.5 ميكرون في سمك) من السيطرة على AJM-1: GFP (الملتصقة تقاطع علامة لتصور حدود الخلية البشرة؛ ID سلالة في CGC SU159) الجنين تمر الظهرية إقحام (يسار، نظرا الظهرية ) والتحكم AJM-1: GFP الجنين تمر الضميمة بطني (يمين، وعرض بطني). ومقلوب الصور على نحو أفضل فيماتظهر ualize حدود الخلية. ب) الرسوم الكاريكاتورية وجهات النظر بطني من C. الأجنة ايليجانس تمر الضميمة بطني. الأولى، اثنين من أزواج من أبرز خلايا حافة (الازرق) استخدام أرجل كاذبة خيطية الغنية الأكتين (الخطوط السوداء) لترحيل نحو خط الوسط بطني (الجنين على اليسار). المقبل، والخلايا جيب بطني الخلفي (أحمر) تهاجر نحو خط الوسط خلق حفرة على سطح بطني التي قد أغلق من قبل سلسلة محفظة مثل آلية (B '، أسود منقط خط / دائرة؛ تذكرنا التئام الجروح) 25. أظهرت أيضا هي neuroblasts الكامنة (كدوائر الرمادي). الجنين الثاني (B ") يبين كيف يتم بوساطة هجرة مجموعات فرعية معينة من خلايا البشرة من قبل 'الجسر' تشكلت من إعادة ترتيب، معربا عن مستقبلات خلايا PLX-2/plexin وVAB-1/Ephrin 'الفرقة plexin' (الخضراء الدوائر). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 2
الشكل 2. ANI-1 التعريب في C. ايليجانس الأجنة. A) C. A ثابتة ايليجانس الجنين معربا عن HMR-1: GFP (E-كادهيرين؛ علامة من حدود الخلية البشرة) costained عن GFP (الخضراء) والعاني 1 (الحمراء). الصور متحد البؤر من طبقات الخلايا الخارجية (4 مداخن Z-0.2 ميكرون في سمك) تظهر خلايا البشرة المغطي وneuroblasts الكامنة، والتي هي ANI-1 الإيجابية B) ثابت N2 N2 و؛ وشارك الملون العاني-1 رني الأجنة ل ANI-1. يتم تقليل ANI-1 بشكل كبير في الجنين المنضب العاني-1-. أشرطة النطاق: 10 ميكرون اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

together.within المحافظة على صفحة = "دائما"> الرقم 3
الرقم 3. تصور تقسيم أرومة عصبية أثناء C. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني. وترد (A) التوقعات Z-مكدس (20 Z-أكوام من 0.2 ميكرون في سمك) من جنين السيطرة coexpressing HAM-1: GFP (لتصور نواة أرومة عصبية؛ الأخضر) وmCherry: PH (لتصور أغشية الخلايا، أحمر) . العديد من neuroblasts وأنواع الخلايا الأخرى واضحة في التوقعات تظهر (B) التوقعات Z-مكدس باستخدام عدد أقل من الطائرات Z من آخر الجنين السيطرة coexpressing HAM-1: GFP (الخضراء) وmCherry: PH (الحمراء). وأسرع منطقة في (مربع أبيض) لإظهار مزيد من الواضح أن أرومة عصبية الفاصل الفردية. ويشير رؤساء السهم الأبيض إلى غشاء البلازما ingressing خلية الفاصل والدوائر الخضراء تسليط الضوء على الحمض النووي المكثف خلال الانقسام وحديثاتشكيل نواة ابنة نحو نهاية الانقسام. يخدم خلية كبيرة كنقطة مرجعية (النجمة البيضاء) لتحديد المرحلة التنموية ومكان داخل الجنين. أشرطة النطاق: 10 ميكرومتر (أبيض) و 3.5 ميكرومتر (الصفراء) اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 4
الشكل 4. تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي C. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني باستخدام نظام widefield. يتم عرض A) مقلوب التوقعات Z-مكدس (2 Z-أكوام من 0.2 ميكرون في سمك) من جنين السيطرة coexpressing HAM-1: GFP وmCherry: PH التي تم جمعها من نظام widefield باستخدام كاميرا CCD مع ارتفاع القرار. تشير السهام الحمراء لتقسيم neuroblasts مع طngressing أغشية الخلايا. الدوائر الخضراء تسليط الضوء على الحمض النووي مكثف خلال المراحل الأولى من الانقسام أو تشكيل نواة حديثا ابنة نحو نهاية الانقسام / الانقسام السيتوبلازمي. يخدم خلية كبيرة كنقطة مرجعية (النجمة الصفراء) لتحديد المرحلة التنموية. B) الصور المعروضة هي مماثلة لA)، ولكن هي من جنين تعامل مع العاني-1 رني. وingresses غشاء الخلية في الخلية كما تنتقل عن طريق الانقسام، ولكن يرتاح بعد فترة وجيزة، ترك الخلية متعدد النوى. شريط النطاق: 10 ميكرومتر (أسود)، 3.5 ميكرومتر (الصفراء) اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 5
الرقم 5. تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي C. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني باستخدام نظام اجتاحت الميدان. يتم عرض A) مقلوب التوقعات Z-2 Z كومة من أكوام من 0.2 ميكرومتر (0.4 ميكرومتر مجموع) من جنين coexpressing HAM-1: GFP وmCherry: PH التي تم جمعها من نظام اجتاحت الحقل باستخدام كاميرا EMCCD مع حساسية عالية، ولكن انخفاض القرار. النقاط رأس السهم الأحمر إلى الانقسام السيتوبلازمي أرومة عصبية يمر. الدوائر الخضراء تسليط الضوء على الحمض النووي المكثف خلال الانقسام وتشكيل حديثا ابنة نوى بعد الانقسام السيتوبلازمي. يخدم خلية كبيرة كنقطة مرجعية (النجمة الصفراء) لتحديد المرحلة التنموية. B) الصور المعروضة هي مماثلة لA)، ولكن هي من جنين تعامل مع العاني-1 رني، وتستخدم Z-3 مداخن (المجموع 0.6 ميكرومتر ). كما هو موضح أعلاه، فإن ingresses الغشاء في أثناء سير الخلية من خلال الانقسام، ولكن بعد ذلك يرتاح مما تسبب في الخلايا لتصبح متعدد النوى. شريط النطاق: 10 ميكرومتر (أسود)، 3.5 ميكرومتر (الصفراء).188/51188fig5highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الفيديو 1. تصور neuroblasts تقسيم أثناء C. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني. توقعات Z-كومة من طائرتين Z (0.4 ميكرون / طائرة) من جنين السيطرة coexpressing HAM-1: GFP (الخضراء) وmCherry: PH (الحمراء). وتظهر الصور التي تم جمعها من المجهر widefield لكلتا القناتين. الفيديو يتوافق مع الجنين هو مبين في لوحة الثالث من الشكل 3B. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.

الفيديو 2. تصور neuroblasts تقسيم أثناء C. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني. توقعات Z-كومة من طائرتين Z (0.4 ميكرون / طائرة) من جنين السيطرة coexpressing HAM-1: GFP (الخضراء) وmCherry: PH (الحمراء). الفيديو يتوافق مع صور مقلوبة جمعها من المجهر widefield لmCherry: قناة PH قلذ (الجنين في الشكل 4A). اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.

الفيديو 3. تصور neuroblasts تقسيم أثناء C. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني. توقعات Z-كومة من طائرتين Z (0.4 ميكرون / طائرة) من جنين تعامل العاني-1 رني coexpressing HAM-1: GFP (الخضراء) وmCherry: PH (الحمراء). الفيديو يتوافق مع صور مقلوبة جمعها من المجهر widefield لmCherry: قناة PH فقط (الجنين في الشكل 4B) اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.

الفيديو 4. تصور تقسيم أرومة عصبية أثناء C. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني. توقعات Z-كومة من طائرتين Z (0.4 ميكرون / طائرة) من جنين السيطرة coexpressing HAM-1: GFP (الخضراء) وmCherry: PH (الحمراء). الفيديو يتوافق مع قلبإد الصور التي تم جمعها من الميدان المجهر متحد البؤر اجتاحت لmCherry: قناة PH فقط (الجنين في الشكل 5A) اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.

الفيديو 5. تصور تقسيم أرومة عصبية أثناء C. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني. توقعات Z-كومة من ثلاث طائرات Z (0.4 ميكرون / طائرة) من جنين تعامل العاني-1 رني coexpressing HAM-1: GFP (الخضراء) وmCherry: PH (الحمراء). الفيديو يتوافق مع صور مقلوبة تم جمعها من الميدان اجتاحت المجهر متحد البؤر لmCherry: قناة PH فقط (الجنين في الشكل 5B) اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول استخدام أنواع مختلفة من المجهري إلى انقسامات الخلية صورة خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني. على وجه الخصوص، وهذا يسلط الضوء على البروتوكول كيفية تقسيم الصورة neuroblasts، الخلايا التي قد تسهل البشرة التشكل. الاتصالات خلية خلية المهم لتشكيل الأنسجة أثناء تطوير metazoan وC. ايليجانس هو نموذج ممتاز لدراسة تشكيل الأنسجة في الجسم الحي. حدث واحد أن يصور بشكل رائع تفاعل أنسجة البشرة هو التشكل، والتي تغطي الجنين في طبقة من الخلايا الظهارية. على وجه الخصوص، الضميمة بطني هو عملية حيث تهاجر خلايا البشرة بطني لإحاطة السطح البطني للجنين، ويعتمد على neuroblasts الكامنة. توفير neuroblasts العظة الكيميائية أو الميكانيكية، والمساس الضميمة بطني إذا تم تغيير موقف neuroblasts. عدد (أو القطبية) من neuroblasts أيضا قد تكون ضرورية لالضميمة بطني تحدث بشكل صحيح،وأنه من المهم لفهم الآليات التي تنظم تقسيم بهم. يصف هذا البروتوكول كيفية انقسام الخلية صورة داخل الأنسجة الحية باستخدام C. ايليجانس الأجنة coexpressing تحقيقين الفلورسنت (mCherry: PH لتوضيح أغشية البلازما وHAM-1: GFP لتسمية نواة أرومة عصبية).
أهم الخطوات الأساسية لصورة C. يعيشون ايليجانس الأجنة معربا عن تحقيقات الفلورسنت هي: ط) استخدام صحية، والمنحرفين الشباب البالغين معربا عن علامات الفلورسنت المطلوب (الحفاظ على 20-25 درجة مئوية)، والثاني) استخدام المسوخ أو رني لدراسة متطلبات الجينات أثناء تكوين الأنسجة، والثالث) جمع الأجنة في المرحلة الحق للفحص المجهري (على سبيل المثال. منتصف مرحلة التطور الجنيني)، والرابع) أداء المجهر الفلورسنت باستخدام إعدادات الأمثل للحفاظ على الضيائية منخفضة، ولكن للحفاظ على جودة صورة عالية.

لتحديد خلايا معينة و / أو حجرات داخل الخلايا داخل الأنسجة من الاهتمام، معربا عن استخدام الديدان علامات المفتاحية الموالية الفلورسنتبيز. مركز علم الوراثة انواع معينة (CGC؛ http://www.cbs.umn.edu/cgc) يقدم مجموعة متنوعة من السلالات التي coexpress علامات متعددة. ومع ذلك، واثنين من سلالات (كل واحد يعبر عن علامة من الفائدة) قد يكون من الضروري فحص وعبرت مع المجهر الفلورسنت على مدى عدة أجيال لتوليد سلالة التعبير عن ثابت كلا تحقيقات. على سبيل المثال، لتنفيذ هذا البروتوكول التجريبي، معربا عن سلالة علامة لتصور أغشية الخلايا (mCherry: PH؛ OP70) وقد عبرت مع سلالة معربا عن علامة لتصور نواة أرومة عصبية (HAM-1: GFP؛ OP102) لإنشاء سلالة coexpressing على حد سواء.

أفضل وسيلة لدراسة متطلبات الجينات أثناء التطور الجنيني هو لأداء وظيفة فقدان التجارب، حيث طرقت الجين المنتج لأسفل أو تحور. يصف هذا البروتوكول التجريبي أداء رني ضد anillin (العاني-1) للحد من مستويات الذاتية ANI-1 في جميع الأنسجة الجنينية. هناك الأليلات hypomorphic لا تتميز بشكل جيدمن العاني-1. وبالتالي، رني هو الخيار الأفضل لدراسة فقدان العاني-1 'ق من الظواهر وظيفة وتحديد وظيفتها أثناء التطور الجنيني. عادة، فمن الأفضل استخدام بدلا من المسوخ رني، وكفاءة ضربة قاضية يمكن أن يكون متغير ونادرا ما فارغة. واحدة من المشاكل الأكثر شيوعا واجه مع تغذية بروتوكولات رني هو التلوث، الأمر الذي سيقلل كفاءة رني. لتقليل مخاطر التلوث، وإعداد لوحات رني والمواد الغذائية في ظروف معقمة. ويمكن الكشف عن التلوث عن طريق فحص عدد قليل من لوحات قبل الاستخدام، واللوحات مع حليبي مبهمة البكتيريا / أبحث ينبغي التخلص منها. مشكلة أخرى التي يمكن أن تقلل كفاءة رني هو من خلال عدم اختيار المنحرفين في هذه المرحلة التنموية الصحيح. فمن الأفضل لاستخدام الديدان البالغة L4-نظموا أو الشباب (يظهر الفرج النامية ودائرة بيضاء / حفرة على الجانب البطني للدودة)، التي ليس لها / الأجنة المخصبة قليلة. وعلاوة على ذلك، فإن الظروف رني والعلاجات مالمنعم يوسف تختلف عن المنتجات الجينات المختلفة. طرق مختلفة لزيادة أو نقصان في قوة رني هو عن طريق إعادة التعليق على البكتيريا HT115 مكعبات في كميات مختلفة من وسائل الإعلام LB الأمبير (انظر القسم 1.2.2)، وعن طريق تغيير مدة العلاج رني (طول الفترة الزمنية التي يتم الاحتفاظ على الديدان لوحات رني، وانظر البروتوكول 3). العائد الأمثل العاني-1 الظواهر رني لهذا البروتوكول، ومعلق البكتيريا في 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام LB الأمبير والديدان وأبقى على لوحات رني لمدة 2 يوم (العاني-1 رني تميزت سابقا من قبل مادوكس وآخرون 23). ويمكن أيضا رني السلالات المقاومة أو الحساسة (على سبيل المثال. كفاءة الاسترجاع والتدمير-1، SID-1 أو قوة الرد السريع-3) أن تستخدم لتغيير قوة رني. الأهم من ذلك، هذه السلالات يمكن أن يقترن مع التعبير أنسجة معينة من جيناتها النوع البري لخلق سلالات الحساسة الأنسجة. على سبيل المثال، لأداء رني أرومة عصبية محددة، يمكن للمرء استخدام SID-1 الأجنة متحولة (مقاومة للرني) معربا عن بالوزن UNC-119 (ID سلالة في CGC TU3401) 31.

يصف هذا البروتوكول كيفية تقسيم الصورة الخلية أرومة عصبية خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني. هناك عدة جوانب البروتوكول الذي يتطلب دراسة متأنية، مثل المرحلة التنموية للأجنة، وجمع Z-مداخن المناسبة وتحسين ظروف التصوير لتقليل الضيائية دون المساومة على جودة الصورة. لالتقاط نقاط الوقت في هذه المرحلة التنموية الحق (على سبيل المثال الضميمة بطني)، وينبغي أن يتم تصويره الأجنة من إقحام الظهرية (أزواج من خلايا البشرة الظهرية يشابك والصمامات لتشكيل طبقة واحدة من البشرة على الجانب الظهري للجنين؛ الشكل 1A6). في هذا الوقت، ويتم تقسيم neuroblasts بسرعة. منذ انطلاق الأجنة يمكن أن يكون صعبا في ظل انخفاض التكبير (على سبيل المثال باستخدام مجهر تشريح)، فإنه يساعد على جمع أكبر عدد من الأجنة والأجنة مراحل متفاوتة فييمكن تحديد مرحلة الحق باستخدام أعلى التكبير.

Neuroblasts صغيرة نسبيا، ورقيقة، وتوجد في جميع أنحاء منتصف الجنين. فمن الضروري لتحسين عدد وحجم Z-مداخن لضمان أن الخلية بأكملها يتم التقاطها أثناء الانقسام. على سبيل المثال، وجمع الكثير من الصور سوف تعرض الأجنة لمزيد من الضوء وجعلها عرضة للالضيائية. ومع ذلك، وجمع عدد قليل جدا من Z-المداخن أو استخدام أقسام Z سميكة يمكن أن تجعل من الصعب بشكل صحيح صورة خلية الفاصل أرومة عصبية بأكمله.
يصف هذا البروتوكول استخدام المجهر متحد البؤر الميدانية اجتاحت أو نظام widefield لتقسيم صورة الخلية أرومة عصبية. كما هو موضح سابقا، واحدة من القيود الرئيسية لاستخدام المجهر widefield المجهر epifluorescent هو احتمال الضيائية. بينما ينصح بشدة استخدام متحد البؤر القرص الغزل أو اجتاحت متحد البؤر الميدانية للتصوير C. ايليجانس الأجنة، قد يكون لها بعض مختبرات محدودية فرص الحصول على هذه النظم. هذا عrotocol يعطي بعض الاقتراحات للحد الضيائية عند استخدام أنظمة widefield، مثل إغلاق الفتحة إلى 30٪، وتخفيض شدة الضوء من مصباح الزئبق (أو يفضل استخدام المصابيح)، وذلك باستخدام كاميرا EMCCD، وزيادة الربح أو binning للسماح انخفاض في زمن التعرض. وسوف يكون عدد من Z-المداخن ونقاط زمنية محدودة أيضا باستخدام نظام widefield. على الرغم من أنه لم يكن وصفها في هذا البروتوكول، يتم استخدام المجهر متحد البؤر القرص الغزل عادة لتصوير حي لأنه يسبب انخفاض الضيائية مقارنة المجهر widefield. على غرار نظام اجتاحت الحقل، ويستخدم الليزر في الحالة الصلبة وينثر الضوء (على الرغم بطريقة مختلفة مقابل اجتاحت الميدان). إما لاتفاقية مكافحة التصحر أو EMCCD الكاميرات يمكن استخدامها مع نظام القرص الغزل، والذي غالبا ما الموانئ كاميرا متعددة للسماح التصوير المزدوج. على غرار المجهر حقل اجتاحت، يمكن التقاط الصور مع أوقات التعرض أقل 50-90٪ مقابل نظام widefield.
هذا protocرأ يمكن استخدامها لدراسة وظيفة الجينات المختلفة التي تنظم الانقسام خلال تشكيل الأنسجة. يمكن تقصير الوقت بين كل صورة (على سبيل المثال. كل 15-30 ثانية مقابل. 2-3 دقيقة) لتصور أفضل الظواهر الإنقسامية. ويمكن استخدام مسابر مختلفة (على سبيل المثال بدلا من استخدام HAM-1: GFP، يمكن أن تستخدم H2B الفلورسنت الموسومة لتصور الحمض النووي، و / أو الموسومة الفلورسنت يمكن استخدامها لتصور تويولين مغزل الإنقسامية). ويمكن أيضا تغيير عدد من Z-مداخن وسمك كل كومة (على سبيل المثال أكثر من أكوام أصغر حجم الخطوة). كما هو موضح أعلاه، واختيار الإعدادات المناسبة أمر بالغ الأهمية للحد من الضيائية وتحسين جودة الصورة. على الرغم من أن mCherry: PH وHAM-1: تحقيقات GFP التعبير عند مستويات مرتفعة نسبيا، وجمع نقاط زمنية أسرع، وزيادة عدد Z-المداخن أو التصوير لفترات أطول من الوقت مقابل ما يوصف في هذا البروتوكول قد لا يكون من الممكن على نظام widefield.
وايم مقرها في جاوةبرنامج معالجة سن (يماغيج، NIH) يمكن استخدامها لمعالجة الصور التي تم جمعها من قبل مختلف المجاهر والصور يمكن تصديرها كما المشاجرات. ومع ذلك، اعتمادا على البرمجيات المستخدمة لاقتناء، يمكن أن تكون الملفات بالفعل متوافق مع برامج معالجة. فمن الأفضل لفتح الملفات الأصلية مقابل تصدير الصور (مثل المشاجرات)، حيث يتم الاحتفاظ الفوقية مع الملفات الأصلية. ويمكن استخدام برامج معالجة الصور للتلاعب لجعل الأرقام أو الأفلام. بالإضافة إلى ذلك، كما يمكن إجراء التحليل الكمي، مثل قياس كثافة بكسل في مناطق مختارة. وينبغي اختيار البرمجيات الأمثل اعتمادا على التحليل، مثل أدوات معالجة الصور (ماثووركس، ماتلاب) أو 3D و 4D في الوقت الحقيقي التفاعلية بيانات التصور (Imaris، Bitplane).
باستخدام هذا البروتوكول، وقد تبين العاني-1 لتكون لازمة لأرومة عصبية الانقسام السيتوبلازمي، على الرغم من أنه غير مطلوب للالانقسام السيتوبلازمي في الجنين في وقت مبكر. ومن المثير للاهتمام، من خلال التحكم في نوmber وموقف neuroblasts، العاني-1 يمكن أن تنظم الهجرة من خلايا البشرة بطني لالضميمة بطني، لأن neuroblasts توفير إشارات كيميائية أو ميكانيكية للخلايا الظهارية الفوقية. ومع ذلك، فإنه ليس من المعروف إذا كان مطلوبا العاني-1 لتقسيم أو تغيير الشكل من أنواع الخلايا الأخرى خلال منتصف أواخر مرحلة التطور الجنيني. تبين كيفية التشكيل العام من الأنسجة المجاورة يؤثر على الأنسجة وتؤكد على أهمية التواصل الأنسجة أثناء تطوير metazoan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن نعترف بأن هذا العمل كان مدعوما من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) منحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada Inc. #AGR001.1 For making C. elegans NGM and RNAi plates
Agar Bio Basic Inc. #9002-18-0 For making bacteria LB agar plates
Agarose BioShop Canada Inc. #AGA001.500
Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11029
Anti-mouse anti-GFP antibody Roche Applied Science #11814460001
Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11011
Ampicillin BioShop Canada Inc. #AMP201.5 Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C
Bactopetone  (peptone-A) Bio Basic Inc. #G213
CaCl2 (calcium chloride) BioShop Canada Inc. #C302.1
Cholesterol BioShop Canada Inc. #CHL380.25 Dissolve in ethanol
DAPI  Sigma-Aldrich #D9542 Use to stain nucleic acids (DNA)
Glycerol BioShop Canada Inc. #GLY001.1
IPTG (isopropylthio-β-galactoside) Bio Basic Inc. #367-93-1 Store powder and dissolved IPTG at -20 °C
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) BioShop Canada Inc. #PPM666.1
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) BioShop Canada Inc. #PPD303.1
L4440  (feeding vector) Addgene #1654 Keep as glycerol stock at -80 °C
MgSO4   (magnesium sulfate) BioShop Canada Inc. #MAG511.500
NaCl (sodium chloride) Bio Basic Inc. #7647-14-5
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. #7558-79-4
Normal Donkey Serum (NDS) Wisent Bioproducts #035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) Alfa Aesar #A10877
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich #P8920 For optimal results coat microscope slides three times 
Streptomycin BioShop Canada Inc. #STP101.50 Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C
Tetracyclin BioShop Canada Inc. #TET701.10 Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C
Tween-20 Bio Basic Inc. CAS#9005-64-5
Tryptone BioShop Canada Inc. #TRP402.500
Yeast Extract Bio Basic Inc. #8013-01-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  3. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  4. Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
  5. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
  7. Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
  8. Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
  9. Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
  10. Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
  11. Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
  12. Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
  13. Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
  14. Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
  15. Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
  16. Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
  17. Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
  18. Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
  19. Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
  20. Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  21. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  22. Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
  23. Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
  24. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
  25. Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
  26. Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
  27. Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
  28. Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
  29. Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
  30. Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
  31. Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).

Tags

علم الأعصاب، العدد 85،
تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; مرحلة التطور الجنيني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wernike, D., van Oostende, C.,… More

Wernike, D., van Oostende, C., Piekny, A. Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis. J. Vis. Exp. (85), e51188, doi:10.3791/51188 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter