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Neuroscience

दौरान Neuroblast cytokinesis Visualizing Published: March 12, 2014 doi: 10.3791/51188
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University

Summary

इस प्रोटोकॉल छवि को Caenorhabditis एलिगेंस भ्रूण में एक ऊतक के भीतर कोशिकाओं को विभाजित कैसे करें. कई प्रोटोकॉल जल्दी भ्रूण में छवि कोशिका विभाजन के लिए, इस प्रोटोकॉल कैसे मध्य देर embryogenesis दौरान एक विकासशील ऊतक के भीतर कोशिका विभाजन छवि को बताता है कि कैसे का वर्णन करता है.

Abstract

इस प्रोटोकॉल Caenorhabditis एलिगेंस भ्रूण के विकास के भीतर कोशिकाओं को विभाजित छवि को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग का वर्णन करता है. विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल एपिडर्मल कोशिकाओं के नीचे पाया जाता है और epidermal morphogenesis के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है जो neuroblasts, विभाजित कैसे छवि पर केंद्रित है. ऊतक गठन metazoan विकास के लिए महत्वपूर्ण है और पड़ोसी ऊतकों से बाह्य संकेत पर निर्भर करता है. सी. एलिगेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से अध्ययन करने के लिए इसके ऊतकों आसान बना रही है, इसकी वजह से पारदर्शिता और सरल संगठन के लिए vivo में ऊतक morphogenesis अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है. उदर बाड़े भ्रूण के उदर सतह उपकला कोशिकाओं की एक परत द्वारा कवर किया जाता है, जहां प्रक्रिया है. इस घटना overlying उपकला कोशिकाओं के प्रवास मध्यस्थता करने के लिए रासायनिक मार्गदर्शन cues प्रदान करने वाले अंतर्निहित neuroblasts, द्वारा सुविधा होने लगा है. हालांकि, neuroblasts अत्यधिक proliferative हैं और भी कार्य कर सकते हैंउदर एपिडर्मल कोशिकाओं के लिए एक यांत्रिक सब्सट्रेट के रूप में. इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का उपयोग अध्ययन ऊतक गठन के दौरान कहनेवाला संचार के महत्व को उजागर कर सकता है और विकासशील ऊतकों के भीतर कोशिका विभाजन में शामिल जीन की भूमिका का खुलासा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

कैसे छवि कोशिका विभाजन के लिए जल्दी सी. में वर्णन प्रोटोकॉल जबकि वहाँ एलिगेंस भ्रूण, इस प्रोटोकॉल कैसे छवि कोशिका विभाजन के मध्य embryogenesis दौरान एक ऊतक के भीतर का वर्णन करता है. विकास के दौरान जीवों इमेजिंग में प्रमुख चुनौतियों में से एक phototoxicity को उनकी संवेदनशीलता कर दिया गया है. हालांकि, कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी या बह क्षेत्र सूक्ष्मदर्शी के लिए वृद्धि की पहुंच और अधिक व्यापक इमेजिंग अनुप्रयोगों की अनुमति दी है. दोनों प्रणालियों जीवों को उजागर कर रहे हैं कि यूवी के स्तर को सीमित करने, ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण और बिखरे हुए प्रकाश का उपयोग करें. हालांकि, widefield खड़ा अभी भी वे उच्च संवेदनशीलता (जैसे EMCCD), एपर्चर नियंत्रण और प्रकाश नियंत्रण (जैसे एल ई डी या समायोज्य पारा बल्ब) के साथ कैमरे के साथ outfitted कर रहे हैं, खासकर अगर vivo में इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल सी. विकासशील भीतर छवि कोशिका विभाजन के लिए एक confocal आधारित प्रणाली या एक widefield प्रणाली या तो उपयोग कैसे करें एलिगेंस </ Em> भ्रूण. एक उदाहरण के रूप में, हम कैसे छवि Neuroblast कोशिका विभाजन को वर्णन. Neuroblasts overlying एपिडर्मल कोशिकाओं को रासायनिक या यांत्रिक cues प्रदान करके एपिडर्मल morphogenesis की सुविधा, और ऊतकों के गठन में कहनेवाला संचार के महत्व का एक उत्कृष्ट उदाहरण प्रदान कर सकता है.

Caenorhabditis एलिगेंस अपनी पारदर्शिता और सरल ऊतक संगठन 1 के कारण माइक्रोस्कोपी आधारित अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल जीव है. इसके अलावा, सी. एलिगेंस आनुवंशिक तरीकों और आरएनएआई करने के लिए उत्तरदायी है, और अपने जीन के कई मानव homologues है, यह ऊतक गठन 2-5 के लिए संरक्षित तंत्र की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सी. में भ्रूण> 300 कोशिकाओं है जब एलिगेंस, एपिडर्मिस के गठन, मध्य embryogenesis दौरान होता है. एपिडर्मल morphogenesis भ्रूण कसना कि एपिडर्मल कोशिकाओं की एक परत में संलग्न और embr परिणत करने का विस्तार कर रहा है, जिसके दौरान कई प्रमुख चरणों के होते हैं,एक कीड़ा 6 की लम्बी आकार में एक अंडाकार रूप से यो. उदर एपिडर्मल कोशिकाओं भ्रूण के उदर सतह (चित्रा 1) को कवर करने के लिए उदर midline की ओर विस्थापित जब उदर बाड़े, इन morphogenetic की घटनाओं का वर्णन करता है. सबसे पहले, पूर्वकाल स्थित अग्रणी धार कोशिकाओं के दो जोड़े उनके प्रतिपक्षी पड़ोसियों 6 के साथ उदर वे पालन जहां midline, और फ्यूज की ओर पलायन. यह एक उदर जेब 6-7 बनाने के आकार की तरह कील रूप है जो पीछे स्थित जेब कोशिकाओं के प्रवास के बाद है. जेब बंद कर देता है कि तंत्र में अच्छी तरह से नहीं समझा गया है. एक संभावना यह एक supracellular actin के मायोसिन सिकुड़ा संरचना 8 घाव भरने के लिए इसी तरह, फैशन की तरह एक पर्स स्ट्रिंग में एक साथ जेब कोशिकाओं कि संबंधों है. दिलचस्प है, जेब कोशिकाओं में से कुछ के प्रवास epidermi के नीचे पाया जाता है कि अंतर्निहित neuroblasts 9 (neuronal व्यापारियों के विशिष्ट सबसेट द्वारा मध्यस्थता हैएस, चित्रा 1 बी).

पिछले अध्ययनों neuroblasts. VAB -1 (ephrin रिसेप्टर) और VAB -2 (ephrin ligand) अत्यधिक neuroblasts में व्यक्त की और एक दूसरे से पूर्वकाल और कूल्हों neuroblasts की छंटाई की सुविधा रहे उदर एपिडर्मल सेल प्रवास और उदर बाड़े विनियमित पता चला है कि, और VAB -1 या VAB -2 कारण उदर बाड़े में म्यूटेशन 10-13 phenotypes. हालांकि, प्रमोटर बचाव प्रयोगों VAB -1 भी neuroblasts द्वारा स्रावित अन्य मार्गदर्शन cues के लिए overlying उदर एपिडर्मल कोशिकाओं और रिसेप्टर्स में आवश्यक है पता चला है कि उदर एपिडर्मल कोशिकाओं 9 में व्यक्त कर रहे हैं. इन रिसेप्टर्स में से किसी में म्यूटेशन उदर बाड़े phenotypes कारण हालांकि दोषों के कारण Neuroblast स्थिति में या कारण मार्गदर्शन करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए उदर एपिडर्मल कोशिकाओं की विफलता 14 cues के लिए समस्याओं का उत्पन्न होती है, यह स्पष्ट नहीं है. Neuroblasts वाई के विभाजन फेरबदलमार्गदर्शन संकेत छिपाना करने की क्षमता को प्रभावित करने thout neuroblasts की भूमिका और एपिडर्मल morphogenesis दौरान यांत्रिक इनपुट प्रदान करने की क्षमता पर प्रकाश डाला सकता है. हाल ही में, यह एक कोशिका विभाजन जीन, आईएएनएस -1 (anillin) अत्यधिक neuroblasts (2A चित्रा) में व्यक्त किया है और इसकी कमी Neuroblast विभाजन दोष का कारण बनता है कि पाया गया था. दिलचस्प बात यह है कि इन भ्रूणों उदर बाड़े phenotypes (Fotopoulos, Wernike और Piekny, अप्रकाशित टिप्पणियों) प्रदर्शित करते हैं.

Anillin कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक है, और विशेष रूप से एक मां सेल शारीरिक रूप से दो बेटी कोशिकाओं में बिताते हैं, जहां प्रक्रिया का वर्णन करता है जो cytokinesis, के लिए है. Cytokinesis कसकर यह ठीक से बहन chromatid अलगाव के साथ युग्मित है कि यह सुनिश्चित करने के लिए स्थान और समय में नियंत्रित करने की आवश्यकता है जो एक actomyosin सिकुड़ा अंगूठी, के गठन के द्वारा संचालित है. metazoan cytokinesis के मास्टर नियामक RhoA (सी एलिगेंस में रो -1), एक है कि एक छोटे GTPase हैइसके जीटीपी समयबद्ध रूप में ctive. जीईएफ Ect2/ECT-2 RhoA-जीटीपी सिकुड़ा अंगूठी फार्म और इसके ingression 15 कि मध्यस्थता अनुप्रवाह effectors के साथ सूचना का आदान प्रदान, जिसके बाद RhoA सक्रिय. Anillin अपनी सी टर्मिनस के माध्यम से और अपने एन टर्मिनस के माध्यम से actin और मायोसिन को RhoA को बांधता है कि एक बहु डोमेन प्रोटीन है. Anillin स्तनधारी या ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं 16 में सिकुड़ा अंगूठी की स्थिति को स्थिर करने के लिए आवश्यक है. Anillin कमी पार्श्व दोलनों गुजरना करने के लिए सिकुड़ा छल्ले का कारण बनता है, और cytokinesis अंततः multinucleate कोशिकाओं 17-19 बनाने विफल रहता है. दिलचस्प है, हालांकि सी. एलिगेंस ani-1 यह cytokinesis के लिए आवश्यक नहीं है, जल्दी भ्रूण में actomyosin सिकुड़ना निर्देशांक. ऊपर वर्णित के रूप में हालांकि,, आईएएनएस -1 मध्य embryogenesis (Fotopoulos, Wernike और Piekny, अप्रकाशित टिप्पणियों) के दौरान Neuroblast cytokinesis के लिए आवश्यक है. Cytokinesis विफलता neuroblasts की संख्या और स्थिति बदल जाएगा और नियंत्रण रेखा को प्रभावित कर सकता हैरासायनिक मार्गदर्शन cues के व्यावहारिक, या यह ऊतक के यांत्रिक गुणों को बदल सकता है. दोनों मॉडल उदर बाड़े लिए neuroblasts के nonautonomous भूमिका, और भ्रूण के विकास के दौरान ऊतक ऊतक संचार के महत्व पर प्रकाश डाला.

इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे छवि कोशिका विभाजन के दौरान सी. एलिगेंस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग मध्य embryogenesis. कोशिका विभाजन के तंत्र के अध्ययन के प्रयोगों के बहुमत कोशिकाओं की एक सीमित संख्या में (जैसे सी. एक सेल भ्रूण, Xenopus, या शल्य चर्म एलिगेंस साथ संस्कृति व्यंजन (जैसे. हेला या S2 कोशिकाओं) के भीतर एकल कक्षों में या जल्दी भ्रूण में प्रदर्शन किया गया भ्रूण). हालांकि, यह विभाजन विमान के समय और स्थान को प्रभावित कर सकते हैं कि बाह्य संकेत कर रहे हैं, के रूप में भी ऊतकों के भीतर कोशिका विभाजन अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, कोशिकाओं पड़ोसी ऊतक के विकास को प्रभावित करने के लिए रासायनिक या यांत्रिक cues प्रदान कर सकता हैएस, और यह कहनेवाला संचार के विकास के दौरान फार्म करने के ऊतकों में मदद करता है समझने के लिए कैसे महत्वपूर्ण है.

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Protocol

1. कीड़ा उपभेदों बनाए रखने और आरएनएआई प्रदर्शन के लिए प्लेट्स की तैयारी

  1. निमेटोड विकास मीडिया प्लेट्स
    1. प्लेट्स
      1. कीड़ा उपभेदों बनाए रखने के लिए और आनुवंशिक पार प्रदर्शन करने निमेटोड विकास मीडिया (एन जी एम) प्लेटें तैयार करें. एक एल 2 फ्लास्क में डिस्टिल्ड पानी की 1 एल के साथ 3 जी NaCl, 17 ग्राम अगर और 2.5 ग्राम BactoPeptone गठबंधन और एक धातु सरगर्मी बार जोड़ें.
      2. अगर भंग करने और मीडिया बाँझ फ्लास्क आटोक्लेव. फिर हलचल प्लेट पर कुप्पी जगह और क्रियाशीलता जबकि मीडिया शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
      3. मीडिया ठंडा और अभी भी (45-50 डिग्री सेल्सियस) को छूने के लिए कुछ हद तक गर्म हो गया है एक बार, 1 मिलीलीटर एम 1 2 CaCl, 1 एमएल 1 एम MgSO 4, 1 मिलीलीटर 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल समाधान और 25 एमएल 1 एम जोड़ पोटेशियम फॉस्फेट बफर (PPB; अभिकर्मकों / सामग्री की तालिका में नुस्खा, फिल्टर स्टॉक समाधान बाँझ) और तुरंत 60 मिमी x 15 मिमी (छोटे पेट्री डिश में मीडिया डालो, ऊपर या 13 मिलीग्राम / प्लेट के लिए व्यंजन ~ 3/4 भरना USI) एक स्वचालित निकालने की मशीन एनजी. नोट: कुछ उपभेदों टेट्रासाइक्लिन की लंबी अवधि के रखरखाव बैक्टीरियल RNAse III जीन की Tn10 transposon निष्क्रियता अनुमति देने के लिए प्लेट (12.5 ग्राम / एमएल) के लिए जोड़ा जा सकता है.
      4. मीडिया कमरे के तापमान पर रातोंरात जमना. नोट: प्लेट्स एक जैविक हुड में या संक्रमण होने का खतरा कम है कि प्रयोगशाला के एक क्षेत्र में रखा जाना चाहिए. इसके अलावा, कवक संदूषण सीमित करने के लिए (टिशू पेपर के साथ जैसे स्वच्छ) पलकों पर बनाया गया है कि किसी भी संक्षेपण हटा दें. टेट्रासाइक्लिन भी प्लेटों के लिए जोड़ा गया है, तो इस एंटीबायोटिक प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, तो एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर.
      5. अगले दिन, ई. के निलंबन के साथ सूखी एन जी एम प्लेटों बीज कोली, धीरे vortexed किया गया है कि (OP50 तनाव धारा 1.1.2 देखें). संभोग के लिए प्लेटें बनाने के लिए, (एक छोटी सी सर्कल के लिए फार्म) प्रत्येक प्लेट के केंद्र के लिए OP50 के ~ 50 μl जोड़ें. कीड़ा उपभेदों बनाए रखने के लिए प्लेटें बनाने के लिये OP50 के 100-200 μl (को ~ साथ प्रत्येक एन जी एम थाली बीजयह) की थाली का एक बड़ा क्षेत्र को शामिल किया गया है यह सुनिश्चित.
      6. वरीयता प्राप्त प्लेटें शुष्क हे / एन कमरे के तापमान पर चलो.
      7. अगले दिन, उल्टा सूखे एन जी एम प्लेटों की बारी है और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक का भंडारण कंटेनर में उन्हें ढेर नोट: प्लेट्स 3-4 सप्ताह ~ अप करने के लिए प्रयोग करने योग्य हैं. टेट्रासाइक्लिन युक्त प्लेटें अंधेरे में रखा जाना चाहिए.
    2. भोजन
      1. ई. का उपयोग करें कोलाई OP50 [Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) से] सी. के लिए एक खाद्य स्रोत के रूप में . एलिगेंस नोट: OP50 -80 डिग्री सेल्सियस (50% v / वी ग्लिसरॉल में अनुपात 1:1) में ग्लिसरॉल शेयरों के रूप में जमा किया जा सकता है.
      2. , एन जी एम प्लेटों के लिए OP50 बनाने ग्लिसरॉल स्टॉक के एक छोटे से विभाज्य का उपयोग कर एक लकीर प्लेट बनाने के लिए (; एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग <10 μl). एक लेग अगर प्लेट (अभिकर्मकों / सामग्री की तालिका में नुस्खा) पर बैक्टीरिया बिखरा हुआ है और ~ 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें. नोट: संदूषण के साथ समस्याएँ हैं, तो स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी OP50 इस्तेमाल किया जा सकता है, एकएन डी स्ट्रेप्टोमाइसिन लेग अगर प्लेट (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए जोड़ा जा सकता है.
      3. अगले दिन, एक ही कॉलोनी लेने और एक 500 मिलीलीटर कुप्पी में तरल लेग मीडिया (अभिकर्मकों / सामग्री की तालिका में नुस्खा) की 100 मिलीलीटर टीका लगाना.
      4. संस्कृति झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस हे / एन बढ़ता है.
      5. अगले दिन, एन जी एम प्लेटों बोने के लिए जीवाणु निलंबन का उपयोग करें. नोट: OP50 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में aliquoted और ~ 4-6 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  2. आरएनएआई
    दूध पिलाने की शाही सेना की मध्यस्थता हस्तक्षेप प्रदर्शन करने के लिए मुख्य तरीकों में से एक है (आरएनएआई, एक विशेष जीन उत्पाद पछाड़ना के लिए) सी में एलिगेंस. सी. एलिगेंस hermaphrodites ई. खिलाया जा सकता है प्रेरण पर dsRNA व्यक्त करता है कि एक खिला वेक्टर साथ बदल कोलाई तनाव HT115. इस dsRNA (या उसके टुकड़े) आमतौर पर विशिष्ट जीन लक्ष्य का पर्याप्त पछाड़ना है, जिसके परिणामस्वरूप जननद में फैलता है.
    1. आरएनएआई प्लेट्स
      1. ऊपर वर्णित के रूप में एन जी एम प्लेटों की तैयारी (धारा 1.1.1) देखते हैं, लेकिन यह भी 1 एम IPTG (isopropylthio बीटा-D-galactoside के 1 मिलीलीटर जोड़ने;) dsRNA की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए और 50 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन (एएमपी के 500 μl, dsRNA व्यक्त वैक्टर एम्प हैं प्रतिरोधी गर्म मीडिया (45-50 डिग्री सेल्सियस) के लिए).
      2. प्लेटों के सूखे के बाद, ई. के 50-100 μl ~ साथ बीज उन्हें कोलाई HT115 (धारा 1.2.2 देखें). नोट: गैरवरीय प्लेटों ~ 4-5 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
      3. वरीयता प्राप्त प्लेटें कमरे के तापमान पर रातोंरात सूखी.
      4. अगले दिन, उल्टा सूखे आरएनएआई प्लेटें बदल जाते हैं और 15-20 डिग्री सेल्सियस पर एक प्लास्टिक का भंडारण कंटेनर में स्टोर नोट: वरीयता प्राप्त प्लेटें ~ अप करने के लिए 2-3 सप्ताह के लिए आरएनएआई दक्षता बरकरार रहती है.
    2. आरएनएआई खाद्य
      1. ई. का उपयोग करें (CGC से, धारा 1.1.2 देखें) कोलाई HT115 ब्याज की एक जीन को सीडीएनए युक्त खिला वेक्टर L4440, या L4440 के साथ बदल दिया. नोट: जीनोम में खुला पढ़ने फ्रेम के बहुमत लक्ष्य है कि पुस्तकालयों को दूध पिलानेपहले से ही बना है और L4440 में क्लोन HT115 में तब्दील (उपलब्ध हैं, जैसे ani -1 20-21 के लिए Y49E10.19 से एक टुकड़ा युक्त;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / पृष्ठों / rnai.html). नोट: HT115 -80 डिग्री सेल्सियस (50% v / वी ग्लिसरॉल में अनुपात 1:1) में ग्लिसरॉल शेयरों के रूप में रखा जा सकता है.
      2. ब्याज की एक जीन को निशाना बनाने के लिए एक नया निर्माण उत्पन्न करने के लिए, IPTG द्वारा inducible हैं जो flanking T7 प्रमोटर के बीच L4440 वेक्टर नक्शा और क्लोन सीडीएनए देखें.
      3. परिवर्तन के लिए एक मानक प्रोटोकॉल (जैसे रासायनिक सक्षम बैक्टीरिया बनाने और गर्मी झटका परिवर्तन प्रदर्शन) का उपयोग L4440 निर्माण के साथ HT115 रूपांतरण.
      4. (धारा 1.1.2 देखें) OP50 के लिए वर्णित है, एक लेग अगर प्लेट पर ग्लिसरॉल स्टॉक, लेकिन थाली से लकीर बैक्टीरिया भी एम्पीसिलीन के 50 माइक्रोग्राम / एमएल शामिल करना चाहिए. नोट: एक पूर्व मौजूदा L4440 निर्माण का उपयोग करते हैं, तो धारा 1.2.2.2-1.2.2.3 छोड़.
      5. एक ही कॉलोनी उठाओ और 5 एमएल टीका लगाना5 एक 50 मिलीग्राम / एमएल शेयर (लेग एएमपी) से एम्पीसिलीन के μl, और झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर यह जगह युक्त लेग मीडिया की.
      6. बाद ~ 16 घंटा, ओ / एन संस्कृति के 50 μl के साथ ताजा लेग एम्प मीडिया के 5 एमएल टीका लगाना और 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ 7-8 घंटे के लिए संस्कृति बढ़ने
      7. 4,000-8,000 XG पर 1 मिनट के लिए बैक्टीरिया अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा लेग एम्प मीडिया के 500 μl में गोली resuspend.
      8. जैसा कि ऊपर वर्णित (धारा 1.2.1 देखें) आरएनएआई प्लेटें बीज के लिए इस बैक्टीरिया का समाधान करें. नोट: HT115 तुरंत इस्तेमाल किया जाना चाहिए और संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए.

2. कीड़ा उपभेदों की खेती

सी. बनाए रखें मानक प्रोटोकॉल 1 के अनुसार एन जी एम प्लेटों पर CGC से आदेश दिया एलिगेंस उपभेदों. इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया उपभेदों में शामिल हैं: सी. एलिगेंस वर ब्रिस्टल, जंगली प्रकार (CGC एन 2 में तनाव आईडी); UNC-119 (tm4063); wgIs102 [हैम-1 UNC-119 (+)] (CGC OP102 में तनाव आईडी); UNC-119 (ed3); ltIs44pAA173 [पाई 1P-mCherry :: पीएच (PLC1delta1) + UNC-11 9 (+)] (CGC OD70 में तनाव आईडी); AJM-1 (ok160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + Rol-6 (su1006)] (CGC SU159 में तनाव आईडी); UNC-119 (ed3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1P :: HMR-1 :: GFP :: UNC-54 3'UTR + UNC-119 (+)] (CGC FT250 पर तनाव आईडी).

  1. ~ 3 एक ताजा एन जी एम प्लेट को सही फेनोटाइप प्रदर्शित करने वाले युवा वयस्क hermaphrodites उठाओ. नोट: एन 2 (var. ब्रिस्टल, जंगली प्रकार) 15-25 डिग्री सेल्सियस के बीच बनाए रखा जा सकता है, लेकिन वे उच्च तापमान पर तेजी घनत्व तक पहुंच जाएगा. कीड़ा घनत्व अधिक है जब नए स्टॉक बनाया जाना चाहिए.
  2. फ्लोरोसेंट प्रोटीन का इष्टतम अभिव्यक्ति के लिए 20-25 डिग्री सेल्सियस पर सभी फ्लोरोसेंट उपभेदों (जैसे GFP और / या mCherry व्यक्त कीड़े) रखें. कीड़ा घनत्व अधिक है और भोजन कम है जब नए स्टॉक बनाया जाना चाहिए.
  3. कीड़े लेने के लिए, एक का उपयोग करेंखींचा अंत (~ लंबाई में 3-5 सेमी) पर जुड़े हुए एक प्लैटिनम तार के साथ एक खींच लिया गिलास विंदुक से बना लेने. एक चिकनी बढ़त के साथ तार समतल. Hermaphrodites अप 'स्कूप' को लेने का उपयोग और नए प्लेटों पर उन्हें स्थानांतरण. उपभेदों के पार संक्रमण से बचने के लिए उपयोग के बीच में तार लौ.

3. आरएनएआई

  1. आरएनएआई का निष्पादन
    1. पहला, 30-60 मिनट ~ के लिए एक गैरवरीय एन जी एम थाली पर जगह ~ 8 L4 hermaphrodites कीड़े से OP50 बैक्टीरिया को दूर करने के लिए.
    2. फिर ब्याज की एक जीन को dsRNA व्यक्त L4440 प्लाज्मिड वहन करती है कि HT115 के साथ वरीयता प्राप्त एक एन जी एम एम्प IPTG थाली पर 8 hermaphrodites जगह (. जैसे ani-1, 1.2 देखें) ~ 24 घंटा के लिए. नोट: ब्याज की जीन, या वांछित phenotypes (जो पछाड़ना की ताकत पर निर्भर हो सकता है) पर निर्भर करता है, कीड़े 24 घंटे के बाद, ताजा आरएनएआई पर hermaphrodites जगह (समय की छोटी या लंबी अवधि के लिए आरएनएआई प्लेटों पर छोड़ा जा सकता है प्लेट).
    3. एक neg के लिएative नियंत्रण, एक आरएनएआई प्लेट पर जगह कीड़े खाली L4440 वेक्टर ले जाने HT115 के साथ वरीयता प्राप्त. नोट: ये भ्रूण कोई phenotypes होनी चाहिए.
    4. एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए, अच्छी तरह से विशेषता phenotypes के साथ एक जीन है कि लक्ष्य dsRNA व्यक्त एक आरएनएआई थाली पर कीड़े जगह है. नोट: 24 घंटे और hermaphrodites 48 घंटा बाद बाँझ हैं के बाद रो -1 (Y51H4A.3) के लिए, भ्रूण 100% घातक हैं.
  2. आरएनएआई प्रभावकारिता
    आरएनएआई द्वारा पछाड़ना के स्तर कुछ ऊतकों दूसरों की तुलना में अधिक प्रतिरोधी हो सकता है, खासकर के बाद परीक्षण किया जाना चाहिए. जल्दी मध्य embryogenesis दौरान, सबसे ऊतकों आरएनएआई के प्रति संवेदनशील हैं, लेकिन देर से भ्रूण या लार्वा में, न्यूरॉन्स आरएनएआई प्रतिरोधी हैं. अलग उपभेदों आरएनएआई संवेदनशीलता (जैसे RRF-3) में सुधार करने के लिए, या (तंत्रिका प्रमोटर UNC-119 द्वारा व्यक्त एक transgene के साथ संयोजन में जैसे सिड -1) ऊतक विशेष आरएनएआई उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. पश्चिमी सोख्ता
      सी. का उपयोग immunoblotting एलिगेंस प्रोटीन हो सकता हैमानक प्रोटोकॉल 22 के अनुसार प्रदर्शन किया.
      1. आरएनएआई प्रदर्शन करने के बाद, एक microcentrifuge ट्यूब में hermaphrodites (भ्रूण से भरा) ~ 10 गर्भवती एकत्र ~ 2 मिनट के लिए उबलते द्वारा 20-30 μl 1x एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर और lyse जोड़ें. इसी तरह, नियंत्रण नमूना के लिए एक अलग ट्यूब में N2 कीड़े इकट्ठा. नोट: hermaphrodites की संख्या प्राथमिक एंटीबॉडी की संवेदनशीलता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.
      2. नमूना बफर में नियंत्रण नमूना (जैसे 3-100%) के dilutions बनाएँ. नियंत्रण और आरएनएआई नमूने लोड और मानक प्रोटोकॉल (% जेल ब्याज की प्रोटीन के आकार के आधार पर अलग अलग होंगे) के अनुसार एसडीएस पृष्ठ से चलाते हैं.
      3. एक झिल्ली को जेल स्थानांतरण और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार immunoblotting प्रदर्शन करते हैं. नोट: का प्रयोग विभिन्न प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी dilutions के प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए सिफारिश की.
      4. विकास (जैसे chemiluminescence अगर) का उपयोग या स्कैन (जैसे प्रतिदीप्ति अगर) का उपयोग immunoblot और वें तुलनाई आरएनएआई लेन बनाम एन 2 गलियों में बैंड के घनत्व, और पछाड़ना के स्तर का निर्धारण (जैसे आरएनएआई लेन का घनत्व 12% नियंत्रण लेन से मेल खाता है, यह प्रोटीन 88% से कम है कि पता चलता है). नोट:. मैडॉक्स एट अल 23 देख, आईएएनएस -1 पछाड़ना की दक्षता को देखने के लिए
    2. Immunostaining
      सी. में immunostaining एलिगेंस मानक प्रोटोकॉल 22 के अनुसार किया जा सकता है.
      1. आरएनएआई प्रदर्शन करने के बाद, दो तरीकों में से एक का उपयोग कर गर्भवती hermaphrodites और फसल भ्रूण लीजिए. Centrifugation (1,000-4,000 XG) के माध्यम से microcentrifuge ट्यूबों और गोली siliconized 1.5 मिलीलीटर में M9 बफर (अभिकर्मकों / सामग्री की तालिका में नुस्खा) में तरीकों, जगह hermaphrodites में से एक के लिए. नोट: इसी एन 2 सगर्भा hermaphrodites इकट्ठा.
      2. M9 समाधान निकालें.
      3. 3 मिनट के लिए microcentrifuge ट्यूब विरंजन समाधान के 1 एमएल (1 एम NaOH, 5% ब्लीच) जोड़कर भ्रूण निष्कासित. इसी तरह, ब्लीच एन 2 वहनियंत्रण स्लाइड बनाने के लिए rmaphrodites.
      4. भंवर धीरे, तो तुरंत centrifugation (4,000-8,000 XG) के माध्यम से भ्रूण गोली और विरंजन समाधान निकालने. नोट: कीड़े ब्लीच के साथ incubated हैं कि कुल समय 5 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए.
      5. और एक पाली एल lysine लेपित खुर्दबीन स्लाइड पर एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग हस्तांतरण भ्रूण, भ्रूण Tris buffered खारा (50 मिमी Tris पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl टीबीएस) के साथ 3x धो लें. नोट: कोट करने के लिए पाली एल lysine के साथ एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड, पहली स्लाइड मिटा, तो पाली एल lysine की एक बूंद (~ 20-30 μl) जोड़ सकते हैं और सतह भर में समान रूप से फैला है और सूखी हैं. इष्टतम परिणाम, कोट स्लाइड और दो बार के लिए. भ्रूण (धारा 3.2.2.1-3.2.2.5) इकट्ठा करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका एक पाली एल lysine लेपित खुर्दबीन स्लाइड पर M9 की एक बूंद जगह और ड्रॉप में ~ 10 गर्भवती hermaphrodites उठा है.
      6. एक प्रत्येक खुर्दबीन स्लाइड के शीर्ष पर coverslip (भ्रूण का सबसे शामिल है कि क्षेत्र के लिए) और जगह जोड़ेंतरल नाइट्रोजन में स्लाइड. नोट: ड्रॉप में सीधे रखा hermaphrodites के लिए, hermaphrodites खुला तोड़ने के लिए और भ्रूण को निष्कासित करने coverslip पर दबाव डाला.
      7. तुरंत उन्हें तरल नाइट्रोजन में ठंड के बाद coverslips बंद flicking द्वारा भ्रूण रुक दरार.
      8. भ्रूण को ठीक करने के लिए 20 मिनट के लिए बर्फ ठंड मेथनॉल में स्लाइड रखें. नोट: कुछ एंटीजन के लिए, ऐसे paraformaldehyde के रूप में एक crosslinking लगानेवाला बेहतर हो सकता है. DUERR 22 से प्रोटोकॉल देखें.
      9. Rehydrate और स्लाइड धोने से भ्रूण permeabilize Tris buffered खारा बीच 20 को रोकने के साथ 4x (TBST, 50 मिमी Tris पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 0.1% बीच 20) 10 मिनट प्रत्येक के लिए.
      10. भ्रूण का सबसे शामिल है कि आसपास के क्षेत्र में प्रत्येक स्लाइड सूखी और एक तरल अवरुद्ध कलम (जैसे पीएपी कलम) का उपयोग भ्रूण के चारों ओर एक वृत्त खींचना.
      11. 5% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस, ब्लॉक) के साथ TBST की ~ 100 μl जोड़ें प्रत्येक स्लाइड (परिक्रमा क्षेत्र) के लिए और के लिए सेतेआरटी पर 20 मिनट. नोट: एक 'गीला कक्ष' (गीला कागज तौलिए से युक्त एक ढक्कन के साथ जैसे एक पकवान) में स्लाइड रखें.
      12. , ब्लॉक निकालें प्रत्येक स्लाइड (परिक्रमा क्षेत्र) से (TBST में पतला) प्राथमिक एंटीबॉडी के ~ 50-100 μl जोड़ने और आरटी पर 2 घंटे के लिए सेते हैं. नोट: एंटीबॉडी पर निर्भर करता है, कमजोर पड़ने और ऊष्मायन समय भिन्न हो सकते हैं. GFP का पता लगाने के लिए, हम एक 1/200 कमजोर पड़ने में एक विरोधी माउस विरोधी GFP प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें. आईएएनएस -1 का पता लगाने के लिए, हम (कृपया एमी Shaub मैडॉक्स, UNC चैपल हिल द्वारा प्रदान की) एक 1/1600 कमजोर पड़ने में एक विरोधी खरगोश विरोधी आईएएनएस-1 प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें. अब ऊष्मायन समय के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड जगह
      13. (यदि संभव हो तो, भविष्य में उपयोग के लिए रखना) प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस के साथ स्लाइड्स 3X धो लो.
      14. पिछले धोने निकालें और प्रत्येक स्लाइड (परिक्रमा क्षेत्र) से (TBST में पतला) माध्यमिक एंटीबॉडी के ~ 50-100 μl जोड़ने और आरटी पर 2 घंटे के लिए सेते हैं. नोट: एंटीबॉडी पर निर्भर करता है, कमजोर पड़ने भिन्न हो सकते हैं. GFP का पता लगाने के लिए, हम एक एक का उपयोग करेंएक 1/250 कमजोर पड़ने में NTI माउस एलेक्सा Fluor 488 माध्यमिक एंटीबॉडी. आईएएनएस -1 का पता लगाने के लिए, हम एक 1/250 कमजोर पड़ने में एक विरोधी खरगोश एलेक्सा Fluor 568 माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें.
      15. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और धोने स्लाइड 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस के साथ 3x. नोट:, डीएनए दाग DAPI की ~ 50-100 μl जोड़ने के लिए (4 ',6-diamidino-2-phenylindole, 1 मिलीग्राम / एमएल) के 5 मिनट के लिए TBST में 1/500 में कमजोर पड़ने.
      16. DAPI निकालें और 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस के साथ 2x स्लाइड्स धो लें. नोट: DAPI धुंधला नहीं किया जाता है, तो इस अतिरिक्त धोने कदम को छोड़.
      17. 0.1M Tris पीएच (9) के साथ एक त्वरित धोने प्रदर्शन करना, बढ़ते मीडिया के 15 μl 37 डिग्री सेल्सियस (4% N-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate), 50 मिमी Tris, में पीएच 9 तक prewarmed ~ हटाने और जोड़ने प्रत्येक स्लाइड (परिक्रमा क्षेत्र) के लिए 50% ग्लिसरॉल).
      18. अतिरिक्त तरल बंद बाती और नेल पॉलिश के साथ स्लाइड सील, (परिक्रमा क्षेत्र में बढ़ते मीडिया के शीर्ष पर) प्रत्येक स्लाइड के लिए एक coverslip जोड़ें. नोट: स्लाइड्स -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता
      19. पर भ्रूण का निरीक्षणएक widefield फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग कर स्लाइड. महत्वपूर्ण बात है, नियंत्रण (एन 2 या गैर आरएनएआई) भ्रूण का उपयोग इष्टतम पिक्सेल तीव्रता की छवियों को इकट्ठा करने के लिए सेटिंग्स समायोजित करें. फिर, एक ही सेटिंग्स का उपयोग आरएनएआई भ्रूण से छवियों को इकट्ठा. नियंत्रण बनाम के लिए एकत्र छवियों के उदाहरण ani-1 आरएनएआई भ्रूण चित्रा 2B में दिखाया गया.

4. लाइव इमेजिंग और कटाई भ्रूण के लिए स्लाइड्स की तैयारी

  1. लाइव इमेजिंग के लिए agarose पैड की तैयारी
    1. उन पर टेप की 1-2 स्ट्रिप्स के साथ दो अन्य स्लाइड्स, प्रत्येक के बीच एक स्वच्छ, पूर्व गर्म खुर्दबीन स्लाइड रखें.
    2. एक गिलास पाश्चर विंदुक का प्रयोग, स्लाइड करने के लिए (गर्म आसुत पानी में भंग) वी agarose w / 2% की एक बूंद जोड़ें.
    3. जल्दी agarose ड्रॉप समतल करने के लिए एक सीधा ढंग से पहली स्लाइड के शीर्ष पर एक दूसरे, स्वच्छ खुर्दबीन स्लाइड जगह. नोट: पड़ोसी पर टेप गिरावटतों पैड के लिए मोटाई प्रदान करता है.
    4. शीर्ष स्लाइड हटाने से पहले 1-2 मिनट के लिए agarose पैड सूखी हैं. नीचे agarose पैड को तोड़ने से बचने के लिए सावधानी से ऊपर स्लाइड से स्लाइड. नोट: कभी कभी पैड शीर्ष स्लाइड को सौंप दिया है और अभी भी प्रयोग करने योग्य है, जब तक यह बरकरार रहता है.
    5. कुछ ही मिनटों के भीतर agarose पैड पर भ्रूण स्थानांतरण इसकी तैयारी के बाद (4.2 कदम देखें) नीचे वर्णित के रूप में. नोट: पैड एक अपारदर्शी उपस्थिति होनी चाहिए, यह स्पष्ट है, एक बार इसका इस्तेमाल करने के लिए भी सूखा है.
  2. फसल काटने वाले भ्रूण
    1. Sulston एट अल. 24 से ली गई है, जो रहते इमेजिंग के लिए भ्रूण इकट्ठा करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का प्रयोग करें
    2. एन जी एम या आरएनएआई प्लेटों से (भूखे नहीं) लगभग 4-6 गर्भवती वयस्कों उठाओ और एक अवसाद स्लाइड पर एक कुएं में M9 बफर के 20-30 μl में उन्हें जगह है.
    3. करने के लिए (या वैकल्पिक रूप से योनी के पास) spermatheca के दोनों तरफ कीड़े काटने के लिए एक निष्फल स्केलपेल का उपयोगसमाधान में भ्रूण जारी.
    4. एक गिलास केशिका / पिपेट से जुड़े एक मुँह टुकड़ा के साथ एक रबर नली का उपयोग एक छोटे बोर है और मुंह pipetting द्वारा भ्रूण चूषण खींच लिया. वैकल्पिक रूप से, एक पाश्चर पिपेट रबर बल्ब से जुड़ा हुआ है कि एक केशिका ग्लास ट्यूब के साथ भ्रूण लीजिए.
    5. कीड़ा मलबे से उन्हें अलग करने में मदद करेगा, यह भी M9 बफर युक्त एक दूसरे को अच्छी तरह से करने के लिए suctioned भ्रूण स्थानांतरण.
    6. फिर, सक्शन एक नया तैयार agarose पैड पर भ्रूण (4.1 कदम देखें).
    7. एक साथ एक एक्स, वाई विमान में फिल्माया जा सकता है कि भ्रूण की संख्या में वृद्धि करने के लिए (एक दांत लेने से चिपके) एक बरौनी उपयोग कर पेड़ों का झुरमुट भ्रूण. नोट: ऑक्सीजन के अभाव से बचने के लिए एक साथ 10 से अधिक भ्रूण पेड़ों का झुरमुट नहीं है.
    8. इसके बाद, एक coverslip साथ स्लाइड कवर और आंशिक रूप से पूर्व गर्म तरल VALAP साथ इसे सील, इमेजिंग के दौरान भ्रूण के निर्जलीकरण को रोकने के लिए (पेट्रोलियम जेली, लानौलिन और आयल पिघल गए और 01:01:01 संयुक्त). नोट: अतिरिक्त M9 बफर सीएn भ्रूण इमेजिंग के लिए पर्याप्त तरल है कि यह सुनिश्चित करने के लिए पैड के लिए जोड़ दिया. VALAP की जगह में, पेट्रोलियम जेली आंशिक रूप से coverslips सील करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह coverslips पर्ची के लिए और माइक्रोस्कोप उद्देश्यों पर मिल सकता है के कारण कम कठोर है.

5. लाइव इमेजिंग

  1. Neuroblasts कल्पना, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़ी एक Neuroblast विशेष प्रोटीन व्यक्त करता है कि एक कीड़ा तनाव प्राप्त (जैसे HAM-1: GFP, CGC OP102 में तनाव आईडी). , कोशिका झिल्ली का पता लगाने के लिए भी एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़ी लिपिड पहचानता है कि एक प्रोटीन डोमेन व्यक्त करता है कि एक कीड़ा तनाव का उपयोग करने के लिए (जैसे mCherry:. पीएच, CGC OD70 में तनाव आईडी).
  2. फ्लोरोसेंट hermaphrodites से फसल भ्रूण (प्रोटोकॉल 4 देखें) (प्रोटोकॉल 3 और 4 देखें), और ऊपर वर्णित के रूप में स्लाइड तैयार नियंत्रण या ani-1 आरएनएआई प्लेटों पर रखा.
  3. Epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा 4D में छवि भ्रूण (एक्स, वाई, जेड और समय चूक). एक वाई या तो प्रयोग करेंdefield प्रणाली [GFP और TexasRed के लिए फिल्टर, 60X या 100X, एक उच्च संकल्प सीसीडी (चार्ज कपल्ड डिवाइस) कैमरा करने के उद्देश्यों के साथ स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, अत्यधिक चरण मोटर चालित (जैसे. Piezo जेड) और विशेष अधिग्रहण सॉफ्टवेयर] या एक livescan क्षेत्र बह confocal खुर्दबीन [100X, एक EMCCD (इलेक्ट्रॉन गुणा सीसीडी) कैमरा करने के लिए 488 एनएम और 561 एनएम लेज़रों, उद्देश्यों के साथ फ्लोरोसेंट खुर्दबीन स्कैनिंग स्वचालित, अत्यधिक (जैसे Piezo जेड) और विशेष अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चरण मोटर चालित]. नोट: widefield प्रणाली के लिए, एल ई डी और एक EMCCD कैमरे का उपयोग कर phototoxicity सीमित कर देगा. इसके अलावा, एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन बह क्षेत्र प्रणाली के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है.
  4. या तो सिस्टम पर छवि Neuroblast कोशिका विभाजन के लिए, एक्स पाते, वाई 10x या 20X उद्देश्यों का उपयोग भ्रूण के फ्रेम, और एक इष्टतम एक्स, भ्रूण पृष्ठीय मध्यनिवेश के दौर से गुजर रहे हैं, जहां Y फ्रेम का चयन (कदम से पहले उदर बाड़े करने के लिए, चित्रा 1 ए) या ​​कर रहे हैं प्रारंभिक दौर मेंउदर बाड़े की (~ पहली कोशिका विभाजन के बाद 350 मिनट, चित्रा 1 ए).
  5. बह क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर, 50 साल की एक भट्ठा के साथ 40% बिजली पर 488 एनएम और 561 एनएम 100 मेगावाट लेसरों का उपयोग करें. Widefield प्रणाली में, कम मध्यम तीव्रता प्रकाश (चलाया हुआ हो) के साथ GFP और TexasRed फिल्टर का उपयोग करें. नोट: widefield प्रणाली के लिए, एल ई डी कम phototoxicity है और बेहतर कर रहे हैं.
  6. या तो सिस्टम पर, 60X या 100X तेल विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग और 10 मिनट की कुल के लिए 0.2 माइक्रोन हर 2 मिनट 20 जेड के ढेर इकट्ठा. नोट: हालांकि HAM-1: GFP और mCherry: पीएच जांच अपेक्षाकृत उच्च स्तर पर व्यक्त, हर जांच के लिए जोखिम बार अलग सूक्ष्मदर्शी के लिए अनुकूलित किया जाना होगा. नोट: widefield प्रणाली के लिए, कम से Z-ढेर phototoxicity सीमित करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं और समय की लंबी अवधि में इमेजिंग के लिए, कम समय अंक का उपयोग करें.
  7. एक MERC का उपयोग अगर (widefield प्रणाली पर पराबैंगनी प्रकाश में भ्रूण के जोखिम के कारण phototoxicity कम करने के लिएUry बल्ब), 30% करने के लिए एपर्चर बंद और () एक समायोज्य रोशनी प्रणाली का उपयोग कर प्रकाश की तीव्रता में कमी. नोट: लाभ प्रणाली का उपयोग जरूरत नहीं है, हालांकि, अन्य सूक्ष्मदर्शी अनुकूलतम पिक्सेल तीव्रता की छवियों को प्राप्त करने के लिए लाभ का उपयोग की आवश्यकता सकता है जो अलग संख्यात्मक apertures, के साथ कम तीव्रता या उद्देश्यों के साथ प्रकाश स्रोतों हो सकता है. किसी भी मनाया phenotypes artifactual phototoxicity की वजह से नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक नियंत्रण भ्रूण का उपयोग कर स्थितियों का परीक्षण करें.

6. माइक्रोस्कोपी डेटा का विश्लेषण

  1. झगड़े के रूप में चित्र, निर्यात फ़ाइलों का विश्लेषण और इस तरह के एक जावा आधारित छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम (जैसे ImageJ, एनआईएच, http://rsbweb.nih.gov/ij/) के रूप में विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक ढेर के रूप में झगड़े खोलने के लिए. नोट: छवियों को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, फ़ाइलों को उनके मूल रूप में रखा जा सकता है और ImageJ में खोला गया. मेटाडाटा फ़ाइलों के साथ रखा जाता है यह बेहतर है.
  2. ढेर अलग करें'छवियों' और समय का चयन अंक और वांछित के रूप में जेड विमानों में. नोट: 20 जेड विमानों के एक ढेर में लिया जाता है, neuroblasts के कई <1 मध्य देर embryogenesis दौरान मोटी माइक्रोन और केवल कुछ ही जेड विमानों की जरूरत है कर रहे हैं.
  3. हर समय बिंदु के लिए चयनित जेड विमानों Restack और अलग जेड ढेर अनुमानों बनाने. फिर, हर समय के लिए अनुमानों एक समय अनुक्रम बनाने के लिए एक साथ बिंदु हो चुकी है.
  4. प्रत्येक चैनल के लिए चमक / और या इसके विपरीत समायोजन करें.
  5. फिर, ब्याज, फसल का एक क्षेत्र का चयन करें (और यदि आवश्यक हो तो बारी बारी से) क्षेत्र.
  6. 'विलय कर दिया चैनल' समारोह का उपयोग मर्ज किए गए चित्र बनाने और हर चैनल के लिए एक अलग रंग का चयन करें. आरजीबी के विलय छवियों कन्वर्ट.
  7. अधिक स्पष्ट रूप से छवियों कल्पना करने के लिए कदम 6.3 या 6.4 ('संपादन' के अंतर्गत प्रयोग 'पलटना' समारोह) से प्रत्येक चैनल के लिए स्केल छवियों उलटें.
  8. वेक्टर आधारित softw में आंकड़े बनाने के लिए 8 बिट झगड़े के रूप में सभी अंतिम छवियों को बचाओकार्यक्रम या QuickTime फ़ाइलें फिल्में बनाने के रूप में कर रहे हैं.
  9. पिक्सेल आकार की माप (जैसे छवियों के साथ एक पैमाने पर पट्टी शामिल करने के लिए) की जरूरत है, भ्रूण के आकार को मापने के लिए ImageJ, या अन्य छवि संसाधन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें. नोट: विभिन्न उद्देश्यों का उपयोग एकत्र छवियों को अलग पिक्सेल आकार होगा.

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Representative Results

इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल कैसे सी. में छवि कोशिका विभाजन का वर्णन एलिगेंस मध्य embryogenesis दौरान भ्रूण. विशेष रूप से, यह एपिडर्मल morphogenesis सुविधा हो सकती है जो कि कैसे छवि neuroblasts करने का वर्णन करता है. एपिडर्मल morphogenesis कारण एपिडर्मल सेल आकार में परिवर्तन, प्रवास और आसंजन, लेकिन यह भी अंतर्निहित neuroblasts (चित्रा 1 बी) से रासायनिक या यांत्रिक cues पर निर्भर करता है की एक संयोजन के कारण होता है. neuroblasts उनके प्रवास 10,14,25 को नियंत्रित करता है जो उदर एपिडर्मल कोशिकाओं की सतह पर रिसेप्टर्स द्वारा प्राप्त होते हैं जो मार्गदर्शन संकेत छिपाना. इसके अलावा, neuroblasts उदर एपिडर्मल कोशिकाओं 26 के प्रवास के लिए योगदान है कि यांत्रिक बलों प्रदान कर सकता है, जो अत्यधिक proliferative हैं. इस प्रोटोकॉल मध्य embryogenesis दौरान Neuroblast कोशिका विभाजन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सबसे पहले, neuroblasts कल्पना करने के लिए मार्कर coexpressing भ्रूण: cytokinesis के दौर से गुजर (HAM-1 GFP) (mCherry: पीएच) उत्पन्न कर रहे हैं. HAM-1: GFP GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) नाभिक 27 Neuroblast लिए localizes कि प्रोटीन में चिह्नित व्यक्त करता है, और मध्य embryogenesis दौरान उपस्थित कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं (> 300 कोशिकाओं, चित्रा 3) के बाद से वहाँ का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. डीएनए पिंजरे का बँटवारा दौरान गुणसूत्रों में संघनित के बाद से यह भी, कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए एक अच्छा मार्कर के रूप में कार्य करता है. mCherry: पीएच एक मातृ प्रमोटर (पाई -1) द्वारा व्यक्त की है कि एक mCherry टैग फ्लोरोसेंट प्रोटीन है, और झिल्ली सेल localizes जो PLC1 ∂ 1 28 से लिपिड बाध्यकारी डोमेन शामिल हैं. चित्रा 3; वीडियो 1) इस प्रोटीन झिल्ली और cytosol दो बेटी कोशिकाओं में माँ सेल को अलग करने में चुटकी जब, cytokinesis कल्पना करने की जरूरत है. अन्य मार्करों अन्य प्रकार की कोशिकाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: इस प्रोटोकॉल कैसे (GFP अभिव्यक्ति हैम 1 से दिखाया गया है) छवि Neuroblast डिवीजन, के लिए वर्णन करता है.

Neuroblasts विभाजित कल्पना, भ्रूण coexpressing HAM-1: GFP और mCherry: पीएच (10 मिनट की कुल के लिए) हर 2 मिनट imaged हैं. प्रत्येक Neuroblast व्यास में केवल ~ 1-4 सुक्ष्ममापी है, और 1 माइक्रोन मोटी <है, और यह उच्च वृद्धि (जैसे. 100x) के साथ एक उद्देश्य का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है. इसके अलावा, कई Z-ढेर (~ 20) (आकार में गोलाकार) प्रत्येक कोशिका के विभिन्न कोणों imaged रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए एक छोटा सा कदम आकार (0.2 माइक्रोन) के साथ एकत्र कर रहे हैं. समय अंक समझौता किए बिना यह कई छवियों को इकट्ठा करने के लिए, एक अत्यधिक मोटर चालित चरण (जैसे Piezo जेड स्टेज) की सिफारिश की है. छवियों की एक श्रृंखला इकट्ठा करने के बाद, वे डीएनए, सघन है झिल्ली ingressed है और नए बेटी कोशिकाओं (विलय कर चैनलों का अनुमान ढेर के समय अंक हैं बना रहे हैं, विभाजित कर रहे हैं कि कुछ Z-ढेर के भीतर कोशिकाओं को खोजने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं ) वीडियो 1, चित्रा 3 में दिखाया गया है, और विलय चैनलों के चयनित ढेर चित्रा 3 बी में दिखाया गया. बेहतर कोशिकाओं कल्पना करने के लिए, यह करने के लिए सिफारिश की हैस्केल में हर चैनल रखने और (जैसे चित्रा 4) छवियों पलटना.

छवि संकल्प एक उच्च संकल्प सीसीडी कैमरा (1344 x 1024 पिक्सल) बनाम का उपयोग widefield प्रणाली के लिए अलग है. उच्च संवेदनशीलता (~ 35 फ्रेम / सेकंड और 512 x 512 पिक्सल) के साथ एक उच्च गति EMCCD कैमरे का उपयोग कर बह क्षेत्र प्रणाली. दोनों प्रणालियों के साथ लिया नियंत्रण भ्रूण से neuroblasts विभाजित के उल्टे छवियों तुलना (. 5 बनाम चित्रा 4) के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. चित्रा -4 ए (widefield सिस्टम, वीडियो 2) में दिखाया गया है., छवियों चित्रा 5A बनाम स्पष्ट कर रहे हैं (बह क्षेत्र प्रणाली, वीडियो 4). Widefield प्रणाली का उपयोग हालांकि, जब भ्रूण phototoxicity जल्दी हो जाता है और तेजी से समय अंक उच्च संकल्प कैमरा के साथ संभव नहीं हैं. उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रोटीन का स्थानीयकरण (जैसे. टी में परिवर्तन की जांच करने के लिएओ) उनकी गतिशीलता में परिवर्तन का अध्ययन, समय अंक अधिक बार एकत्र करने की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, यह जेड के ढेर और समय अंक की संख्या को कम करने के बिना समय की लंबी अवधि के लिए छवि के लिए संभव नहीं हो सकता. Widefield प्रणाली पर एक EMCCD कैमरे का उपयोग इमेजिंग आवेदनों की एक व्यापक श्रृंखला की अनुमति दे सकता है. उच्च संकल्प और उच्च गति है कि दोनों कैमरा विकसित किया गया है, लेकिन ड्राइवरों इस्तेमाल किया जा रहा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के आधार पर उपलब्ध नहीं हो सकता, और वे अभी भी EMCCD कैमरों के रूप में संवेदनशील नहीं हो सकता है. सामान्यतः इमेजिंग सी के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक अन्य प्रणाली एलिगेंस भी कम phototoxicity है और (चर्चा देखें) EMCCD या सीसीडी या तो कैमरों के साथ outfitted जा सकता है जो कताई डिस्क confocal है.

(; धारा 1.2 और प्रोटोकॉल के 3 देखें जैसे ani-1) और उनके भ्रूण विवाद के रूप में एक ही रास्ते में imaged हैं कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक हैं कि जीनों का अध्ययन, hermaphrodites ब्याज की एक जीन के खिलाफ आरएनएआई के साथ व्यवहार कर रहे हैंएल भ्रूण. भ्रूण को नियंत्रित करने के लिए आरएनएआई भ्रूण से कोशिकाओं की तुलना करने के लिए, यह (मैच सेल आकृति और पदों की मदद करने के लिए) भ्रूण के विकास के समान चरणों में छवि के लिए सबसे अच्छा है. उदाहरण के लिए, कि इमेजिंग neuroblasts के लिए एक अच्छा संदर्भ बिंदु के रूप में कार्य (आंकड़े 4 और 5) कर सकते हैं उदर बाड़े दौरान भ्रूण के केंद्र में दिखाई एक बड़ा सेल है. जीन यहां अध्ययन, आईएएनएस -1 (anillin), actomyosin सिकुड़ना आयोजन है, लेकिन जल्दी भ्रूण 23,29-30 में cytokinesis के लिए आवश्यक नहीं है. Anillin के homologues, हालांकि, उच्च eukaryotes 16 में cytokinesis के लिए आवश्यक हैं, और ani-1 Neuroblast cytokinesis (Fotopoulos, Wernike और Piekny, अप्रकाशित टिप्पणियों) के लिए आवश्यक है. आंकड़े 4 बी में दिखाया गया है (वीडियो) 3 और 5 ब (वीडियो 5), कई neuroblasts cytokinesis आरंभ और उनके झिल्ली में चुटकी, लेकिन बजाय दो अलग बेटी के गठन कीकोशिकाओं, उनके झिल्ली निकासी और कोशिकाओं (> 1 नाभिक / सेल) multinucleate हो जाते हैं. यह ani-1 इस प्रोटोकॉल द्वारा खुलासा नहीं कर रहे हैं जो अन्य प्रकार की कोशिकाओं के विभाजन या आकार बदलने के लिए, के लिए आवश्यक हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल ऊतक विशिष्ट आरएनएआई (चर्चा देखने के लिए) से परिणाम प्रदर्शित नहीं करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. सी. के दौरान उदर बाड़े एलिगेंस एपिडर्मल morphogenesis. एक नियंत्रण AJM -1 के ए) Z-ढेर अनुमानों (0.5 मोटाई में माइक्रोन से 3 Z-ढेर): GFP (एपिडर्मल सेल सीमाओं कल्पना करने adherens जंक्शन मार्कर, CGC SU159 में तनाव आईडी) भ्रूण के दौर से गुजर पृष्ठीय मध्यनिवेश (बाएं, पृष्ठीय देखें ) और एक नियंत्रण AJM-1: GFP भ्रूण के दौर से गुजर उदर बाड़े (सही, उदर देखें). छवियों को बेहतर विज़ को उलटा कर रहे हैंसेल सीमाओं ualize. बी) कार्टून सी. के उदर दृश्य दिखाने उदर बाड़े के दौर से गुजर एलिगेंस भ्रूण. सबसे पहले, अग्रणी धार कोशिकाओं (नीला) के दो जोड़े उदर midline (बाईं ओर भ्रूण) की ओर विस्थापित करने के लिए actin अमीर filopodia (काली लाइनें) का उपयोग करें. (; काला बिंदीदार रेखा / वृत्त, घाव भरने की याद ताजा बी ') 25 अगला, पीछे उदर जेब कोशिकाओं (लाल) एक तंत्र की तरह एक पर्स तार से बंद कर सकते हैं कि उदर की सतह पर छेद बनाने midline की ओर पलायन. इसके अलावा (ग्रे हलकों के रूप में) अंतर्निहित neuroblasts हैं दिखाया. दूसरा भ्रूण (बी ") एपिडर्मल कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट के प्रवास PLX-2/plexin और VAB-1/Ephrin रिसेप्टर व्यक्त 'plexin बैंड' कोशिकाओं (हरे रंग की पुनर्व्यवस्था से गठित एक 'पुल' से मध्यस्थता कर रहे हैं कैसे पता चलता है हलकों). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
सी. में चित्रा 2. आईएएनएस -1 स्थानीयकरण एलिगेंस भ्रूण. ए) एक निश्चित सी. HMR -1 व्यक्त एलिगेंस भ्रूण: GFP, GFP (हरा) और ani-1 (लाल) के लिए costained (ई cadherin एपिडर्मल सेल सीमाओं के मार्कर). . बाहरी सेल परतों (मोटाई में 0.2 माइक्रोन से 4 Z-ढेर) के confocal छवियों एन 2 और एन 2 फिक्स्ड overlying एपिडर्मल कोशिकाओं और ani-1 सकारात्मक बी हैं जो अंतर्निहित neuroblasts,) दिखा, ani-1 आरएनएआई भ्रूण के लिए दाग सह रहे हैं आईएएनएस-1. आईएएनएस-1 बहुत ani-1-समाप्त हो भ्रूण में कम हो जाता है. स्केल सलाखों:. 10 माइक्रोन बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.


चित्रा 3. Visualizing सी. दौरान Neuroblast विभाजित एलिगेंस embryogenesis. ; और mCherry GFP (हरा Neuroblast नाभिक कल्पना करने के लिए): (ए) Z-ढेर अनुमानों (मोटाई में 0.2 माइक्रोन से 20 जेड के ढेर) हैम -1 coexpressing एक नियंत्रण भ्रूण से दिखाए जाते हैं पीएच (कोशिका झिल्ली कल्पना करने के लिए, लाल) . कई neuroblasts और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के अनुमानों में दिखाई दे रहे हैं जेड विमानों की एक छोटी संख्या का उपयोग (बी) Z-ढेर अनुमानों coexpressing एक और नियंत्रण भ्रूण से दिखाए जाते हैं HAM-1:. GFP (हरा) और mCherry: पीएच (लाल). एक क्षेत्र में अधिक स्पष्ट रूप से एक व्यक्ति के विभाजन Neuroblast दिखाने के लिए (सफेद बॉक्स) में तेजी से बढ़ी है. सफेद तीर सिर नव पिंजरे का बँटवारा दौरान गाढ़ा डीएनए पर प्रकाश डाला और एक विभाजित सेल और हरी हलकों की ingressing प्लाज्मा झिल्ली को इंगितपिंजरे का बँटवारा के अंत की ओर बेटी नाभिक बनाने. बड़े सेल भ्रूण के भीतर विकास मंच और स्थान निर्धारित करने के लिए एक संदर्भ बिंदु (सफेद तारांकन) के रूप में कार्य करता है. स्केल सलाखों:. 10 माइक्रोन (सफेद) और 3.5 माइक्रोन (पीला) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. सी. दौरान Neuroblast cytokinesis Visualizing एलिगेंस एक widefield प्रणाली का उपयोग कर embryogenesis. ए) उल्टे Z-ढेर अनुमानों (मोटाई में 0.2 माइक्रोन से 2 Z-ढेर) coexpressing एक नियंत्रण भ्रूण से दिखाए जाते हैं HAM-1: GFP और mCherry: उच्च संकल्प के साथ एक सीसीडी कैमरे का उपयोग कर widefield प्रणाली से एकत्र पीएच. लाल तीर के साथ मैं विभाजित neuroblasts को इंगितकोशिका झिल्ली ngressing. हरी हलकों पिंजरे का बँटवारा के प्रारंभिक चरणों के दौरान गाढ़ा डीएनए उजागर या नव पिंजरे का बँटवारा / cytokinesis के अंत की ओर बेटी नाभिक बनाने. दिखाया बड़े सेल विकास मंच का निर्धारण करने के लिए एक संदर्भ बिंदु (पीला तारांकन) के रूप में कार्य करता है. बी) छवियाँ) ए के समान हैं, लेकिन ani-1 आरएनएआई के साथ इलाज एक भ्रूण से कर रहे हैं. कोशिका झिल्ली सेल पिंजरे का बँटवारा होकर गुज़रता है, लेकिन एक multinucleate सेल छोड़ने के कुछ ही समय बाद आराम के रूप में ingresses. स्केल बार:. 10 माइक्रोन (काला), 3.5 माइक्रोन (पीला) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. सी. दौरान Neuroblast cytokinesis Visualizing एलिगेंस एक बह क्षेत्र प्रणाली का उपयोग कर embryogenesis. 0.2 माइक्रोन (कुल 0.4 माइक्रोन से 2 जेड के ढेर) के एक) उल्टा Z-ढेर अनुमानों हैम 1 coexpressing एक भ्रूण से दिखाए जाते हैं: GFP और mCherry: उच्च संवेदनशीलता के साथ एक EMCCD कैमरे का उपयोग कर बह क्षेत्र प्रणाली से एकत्र पीएच, लेकिन कम संकल्प. एक Neuroblast दौर से गुजर cytokinesis को लाल Arrowhead अंक. हरी हलकों पिंजरे का बँटवारा और cytokinesis के बाद नव निर्मित बेटी नाभिक दौरान गाढ़ा डीएनए पर प्रकाश डाला. बड़े सेल विकास मंच का निर्धारण करने के लिए एक संदर्भ बिंदु (पीला तारांकन) के रूप में कार्य करता है. दिखाया बी) छवियाँ) ए के समान हैं, लेकिन ani-1 आरएनएआई के साथ इलाज एक भ्रूण से कर रहे हैं, और 3 जेड के ढेर (कुल 0.6 माइक्रोन उपयोग किया जाता है ). ऊपर वर्णित है, तो झिल्ली पिंजरे का बँटवारा सेल के माध्यम से आय के रूप में ingresses, लेकिन सेल multinucleate बनने के लिए पैदा आराम. स्केल बार: 10 माइक्रोन (काला), 3.5 माइक्रोन (पीला).188/51188fig5highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 1. सी. के दौरान विभाजित neuroblasts Visualizing एलिगेंस embryogenesis. हैम 1 coexpressing एक नियंत्रण भ्रूण से दो जेड विमानों (0.4 माइक्रोन / विमान) के Z-ढेर अनुमानों: GFP (हरा) और mCherry: पीएच (लाल). Widefield माइक्रोस्कोप से एकत्र छवियां दोनों चैनलों के लिए दिखाए जाते हैं. वीडियो चित्रा 3 बी के तीसरे पैनल में दिखाया भ्रूण से मेल खाती है. वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 2. सी. के दौरान विभाजित neuroblasts Visualizing एलिगेंस embryogenesis. हैम 1 coexpressing एक नियंत्रण भ्रूण से दो जेड विमानों (0.4 माइक्रोन / विमान) के Z-ढेर अनुमानों: GFP (हरा) और mCherry: पीएच (लाल). वीडियो mCherry के लिए widefield माइक्रोस्कोप से एकत्र औंधा छवियों से मेल खाती है: पीएच चैनल onlवाई (चित्रा -4 ए में भ्रूण). वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 3. सी. के दौरान विभाजित neuroblasts Visualizing एलिगेंस embryogenesis. एक ani-1 आरएनएआई इलाज भ्रूण से दो जेड विमानों (0.4 माइक्रोन / विमान) के Z-ढेर अनुमानों coexpressing HAM-1: GFP (हरा) और mCherry: पीएच (लाल). वीडियो mCherry के लिए widefield माइक्रोस्कोप से एकत्र औंधा छवियों से मेल खाती है:. पीएच चैनल केवल (4B चित्रा में भ्रूण) वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 4. सी. दौरान Neuroblast विभाजित Visualizing एलिगेंस embryogenesis. हैम 1 coexpressing एक नियंत्रण भ्रूण से दो जेड विमानों (0.4 माइक्रोन / विमान) के Z-ढेर अनुमानों: GFP (हरा) और mCherry: पीएच (लाल). वीडियो पलटना से मेल खाती हैmCherry के लिए बह क्षेत्र confocal खुर्दबीन से एकत्र छवियों: एड. पीएच चैनल केवल (चित्रा 5A में भ्रूण) वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 5. सी. दौरान Neuroblast विभाजित Visualizing एलिगेंस embryogenesis. एक ani-1 आरएनएआई इलाज भ्रूण से तीन जेड विमानों (0.4 माइक्रोन / विमान) के Z-ढेर अनुमानों हैम 1 coexpressing: GFP (हरा) और mCherry: पीएच (लाल). वीडियो mCherry के लिए बह क्षेत्र confocal खुर्दबीन से एकत्र औंधा छवियों से मेल खाती है:. पीएच चैनल केवल (चित्रा 5 ब में भ्रूण) वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल मध्य embryogenesis दौरान छवि कोशिका विभाजन को माइक्रोस्कोपी के विभिन्न प्रकार के उपयोग का वर्णन करता है. विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल कैसे एपिडर्मल morphogenesis सुविधा हो सकती है कि neuroblasts के विभाजन, कोशिकाओं छवि को उजागर करता है. सेल सेल संचार metazoan विकास और सी. के दौरान ऊतक गठन के लिए महत्वपूर्ण है एलिगेंस vivo में ऊतक गठन का अध्ययन करने के लिए एक शानदार मॉडल है. अच्छी तरह से ऊतकों की परस्पर क्रिया का चित्रण एक घटना है कि उपकला कोशिकाओं की एक परत में भ्रूण को शामिल किया गया है, जो एपिडर्मल morphogenesis है. विशेष रूप से, उदर बाड़े उदर एपिडर्मल कोशिकाओं भ्रूण के उदर सतह लगा देना की ओर पलायन जहां प्रक्रिया है, और अंतर्निहित neuroblasts पर निर्भर करता है. neuroblasts रासायनिक या यांत्रिक cues प्रदान करते हैं, और neuroblasts की स्थिति बदल रही है, तो उदर बाड़े समझौता किया है. उदर बाड़े ठीक से घटित करने के लिए neuroblasts की संख्या (या ध्रुवता) भी आवश्यक हो सकता हैऔर यह उनके विभाजन को नियंत्रित करने वाले तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल कैसे छवि कोशिका विभाजन के लिए सी. का उपयोग एक जीवित ऊतक के भीतर का वर्णन एलिगेंस दो फ्लोरोसेंट जांच (mCherry: पीएच प्लाज्मा झिल्ली और हैम -1 की रूपरेखा तैयार करने के लिए: Neuroblast नाभिक लेबल करने के लिए GFP) coexpressing भ्रूण.
सी. रहने वाले छवि को सबसे जरूरी कदम एलिगेंस फ्लोरोसेंट जांच व्यक्त भ्रूण हैं: मैं) द्वितीय) ऊतक गठन के दौरान जीन आवश्यकताओं का अध्ययन करने के लिए म्यूटेंट का उपयोग करें या आरएनएआई, 20-25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा वांछित फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त स्वस्थ, युवा वयस्क hermaphrodites () का उपयोग करें, तृतीय) में भ्रूण लीजिए माइक्रोस्कोपी के लिए सही मंच (उदाहरण. मध्य embryogenesis), और चतुर्थ) कम phototoxicity रखने के लिए अनुकूलित सेटिंग्स का उपयोग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन, लेकिन उच्च छवि गुणवत्ता बनाए रखने के लिए.

विशिष्ट कोशिकाओं और / या ब्याज की एक ऊतक के भीतर intracellular डिब्बों की पहचान करने के लिए, फ्लोरोसेंट समर्थक के साथ टैग मार्करों व्यक्त कीड़े का उपयोगbes. Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) एकाधिक मार्कर coexpress कि उपभेदों की एक किस्म प्रदान करता है. हालांकि, दो उपभेदों (प्रत्येक ब्याज की एक एकल मार्कर व्यक्त) stably दोनों जांच व्यक्त एक तनाव उत्पन्न करने के लिए कई पीढ़ियों को पार कर गया और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से जांच की जानी करना पड़ सकता है. Neuroblast नाभिक कल्पना करने के लिए एक मार्कर व्यक्त तनाव के साथ पार कर गया था, उदाहरण के लिए, इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, कोशिका झिल्ली (OP70 पीएच mCherry) कल्पना करने के लिए एक मार्कर व्यक्त तनाव बाहर ले जाने के लिए (HAM-1: GFP, OP102) उत्पन्न करने के लिए एक दोनों coexpressing तनाव.

भ्रूण के विकास के दौरान जीन आवश्यकताओं का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा तरीका जीन उत्पाद नीचे गिरा या उत्परिवर्तित है जहां समारोह प्रयोगों के नुकसान प्रदर्शन करना है. इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल anillin (आईएएनएस -1) सभी भ्रूण के ऊतकों में अंतर्जात आईएएनएस -1 के स्तर को कम करने के खिलाफ आरएनएआई प्रदर्शन का वर्णन करता है. कोई अच्छी तरह से होती hypomorphic alleles कर रहे हैंani-1 की. इसलिए, आरएनएआई समारोह phenotypes की ani-1 के नुकसान की जांच और भ्रूण के विकास के दौरान अपने कार्य को निर्धारित करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प है. आमतौर पर, यह पछाड़ना की दक्षता चर हो सकता है, बजाय आरएनएआई की म्यूटेंट उपयोग करने के लिए बेहतर है और शायद ही कभी अशक्त है. आरएनएआई प्रोटोकॉल खिलाने के साथ सामना करना पड़ा सबसे आम समस्याओं में से एक आरएनएआई की क्षमता को कम करेगा, जो संदूषण है. , संदूषण का जोखिम कम सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में आरएनएआई प्लेट और भोजन तैयार करने के लिए. संदूषण उपयोग करने से पहले प्लेटों के कुछ स्क्रीनिंग से पता लगाया जा सकता है, और दूधिया / अपारदर्शी देख बैक्टीरिया के साथ प्लेटें खारिज किया जाना चाहिए. आरएनएआई की क्षमता को कम कर सकते हैं कि एक और समस्या अभी विकास के चरण में hermaphrodites चुनने नहीं कर रहा है. यह कोई / कुछ निषेचित भ्रूण है जो L4 मंचन या युवा वयस्क कीड़े (विकासशील योनी कीड़ा के उदर पक्ष पर एक सफेद सर्कल / छेद के रूप में प्रकट होता है), का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है. इसके अलावा, आरएनएआई शर्तों और उपचार हूँप्र अलग जीन उत्पादों के लिए अलग अलग. आरएनएआई की शक्ति में वृद्धि या कमी के लिए विभिन्न तरीके कीड़े पर रखा जाता है (धारा 1.2.2 देखें) लेग एम्प मीडिया के विभिन्न मात्रा में pelleted HT115 बैक्टीरिया resuspending, और आरएनएआई उपचार (समय की लंबाई की अवधि बदलकर से है आरएनएआई प्लेटें,) प्रोटोकॉल 3 देखें. इस प्रोटोकॉल के लिए इष्टतम ani-1 आरएनएआई phenotypes उपज के लिए, बैक्टीरिया लेग एम्प मीडिया और कीड़े के 500 μl में resuspended थे (आईएएनएस -1 आरएनएआई पहले से मैडॉक्स एट अल. 23 की विशेषता थी) 2 दिनों के लिए आरएनएआई प्लेटों पर रखा गया था. आरएनएआई प्रतिरोधी या संवेदनशील उपभेदों (जैसे. RDE-1, सिड -1 या RRF-3) भी आरएनएआई की ताकत में परिवर्तन किया जा सकता है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन उपभेदों ऊतक संवेदनशील उपभेदों बनाने के लिए उनके जंगली प्रकार के जीन की ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ मिलकर किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, Neuroblast विशिष्ट आरएनएआई प्रदर्शन करने के लिए, एक WT व्यक्त सिड-1 उत्परिवर्ती भ्रूण (आरएनएआई प्रतिरोधी) इस्तेमाल कर सकते हैं सिड-1-UNC 119 प्रमोटर (CGC TU3401 पर तनाव आईडी) 31 के तहत.

इस प्रोटोकॉल कैसे छवि Neuroblast कोशिका विभाजन के मध्य embryogenesis दौरान वर्णन करता है. उचित Z-ढेर इकट्ठा करने और छवि गुणवत्ता से समझौता किए बिना phototoxicity कम करने के लिए इमेजिंग परिस्थितियों को अनुकूलित, इस तरह के भ्रूण के विकास मंच के रूप में, सावधानी से विचार करने की आवश्यकता है कि प्रोटोकॉल के कई पहलू हैं. सही विकास मंच (जैसे उदर बाड़े) में समय अंक पर कब्जा करने के लिए, भ्रूण (चित्रा 1A6 भ्रूण के पृष्ठीय पक्ष पर एपिडर्मिस की एक भी परत के रूप में पृष्ठीय एपिडर्मल कोशिकाओं के जोड़े दोनों हाथों की आपस में अंगुलियाँ फंसाना और फ्यूज) पृष्ठीय मध्यनिवेश से फिल्माया जाना चाहिए. इस समय, neuroblasts तेजी से विभाजित कर रहे हैं. भ्रूण मंचन (जैसे एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग) कम वृद्धि के तहत मुश्किल हो सकता है, इस पर अलग चरणों और भ्रूण के कई भ्रूण को इकट्ठा करने में मदद करता हैसही मंच उच्च वृद्धि का उपयोग कर चुना जा सकता है.

Neuroblasts अपेक्षाकृत छोटे और पतले होते हैं, और भ्रूण के बीच में पाए जाते हैं. यह पूरे कोशिका विभाजन के दौरान कब्जा कर लिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए Z-ढेर की संख्या और आकार का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए, बहुत से छवियों का संग्रह और अधिक प्रकाश करने के लिए भ्रूण को बेनकाब और phototoxicity उन्हें प्रवण कर देगा. हालांकि, बहुत कुछ Z-ढेर इकट्ठा करने या मोटी जेड वर्गों का उपयोग कर यह मुश्किल एक पूरी डिवाइडिंग Neuroblast सेल ठीक से छवि के लिए कर सकता है.
इस प्रोटोकॉल छवि Neuroblast कोशिका विभाजन के लिए एक बह क्षेत्र confocal खुर्दबीन या widefield प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है. जैसा कि पहले बताया, एक widefield epifluorescent खुर्दबीन का उपयोग करने का मुख्य सीमाओं में से एक phototoxicity के लिए संभावित है. यह अत्यधिक इमेजिंग सी के लिए एक कताई डिस्क confocal या बह क्षेत्र confocal उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, जबकि एलिगेंस भ्रूण, कुछ लैब्स इन प्रणालियों के लिए सीमित पहुँच हो सकती है. यह पीrotocol इस तरह, 30% करने के लिए एपर्चर समापन पारा बल्ब (या बेहतर एल ई डी का प्रयोग करके) से प्रकाश की तीव्रता को कम करने, एक EMCCD कैमरे का उपयोग, और लाभ में वृद्धि या अनुमति देने के लिए binning रूप widefield प्रणाली, का उपयोग करते समय phototoxicity सीमित करने के लिए कुछ सुझाव देता है समय जोखिम में कमी. जेड के ढेर और समय बिंदुओं की संख्या भी एक widefield प्रणाली का उपयोग सीमित हो जाएगा. यह इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं किया गया था हालांकि यह एक widefield माइक्रोस्कोप की तुलना में कम phototoxicity का कारण बनता है, के रूप में कताई डिस्क confocal खुर्दबीन आमतौर पर रहते इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है. बह क्षेत्र प्रणाली के समान है, यह ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण का उपयोग करता है और प्रकाश scatters (हालांकि बह क्षेत्र बनाम एक अलग तरीके से). सीसीडी या EMCCD या तो कैमरों अक्सर दोहरी इमेजिंग की अनुमति के लिए कई कैमरे बंदरगाहों है जो कताई डिस्क प्रणाली, के साथ प्रयोग किया जा सकता है. बह क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए इसी प्रकार, छवियों widefield प्रणाली बनाम जोखिम बार 50-90% कम से कब्जा कर लिया जा सकता है.
इस protocराजभाषा ऊतक गठन के दौरान पिंजरे का बँटवारा विनियमित कि विभिन्न जीनों के समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रत्येक छवि के बीच के समय को छोटा किया जा सकता है (उदाहरण के लिए.. 2-3 मिनट बनाम हर 15-30 सेकंड) बेहतर mitotic phenotypes कल्पना करने के लिए. अलग अलग जांच इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के बजाय HAM-1 का उपयोग कर की. GFP, फ्लोरोसेंट टैग H2B डीएनए कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और / या फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन mitotic spindles कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में चिह्नित). जेड के ढेर और प्रत्येक ढेर के लिए मोटाई की संख्या भी (एक छोटे कदम आकार का उदाहरण अधिक के ढेर) बदला जा सकता है. उचित सेटिंग्स को चुनने, जैसा कि ऊपर वर्णित phototoxicity सीमित और छवि गुणवत्ता के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि mCherry: पीएच और हैम-1: GFP जांच संभव नहीं हो सकता है इस प्रोटोकॉल में वर्णित है बनाम समय की लंबी अवधि के लिए Z-ढेर या इमेजिंग की संख्या बढ़ रही है, तेजी से समय अंक एकत्रित करना, अपेक्षाकृत उच्च स्तर पर व्यक्त एक widefield सिस्टम पर.
एक जावा आधारित है imउम्र संसाधन प्रोग्राम (ImageJ, एनआईएच) विभिन्न सूक्ष्मदर्शी और छवियों से एकत्र छवियों की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता झगड़े के रूप में निर्यात किया जा सकता है. हालांकि, अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, फाइल पहले से ही प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ संगत हो सकता है. मेटाडाटा मूल फाइलों के साथ रखा जाता है, क्योंकि यह मूल फाइल बनाम निर्यात छवियों (जैसे झगड़े) खोलने के लिए बेहतर है. प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर आंकड़े या फिल्में बनाने के लिए छवियों में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, मात्रात्मक विश्लेषण भी इस तरह के चयनित क्षेत्रों में पिक्सेल तीव्रता मापने के रूप में, प्रदर्शन किया जा सकता है. इष्टतम सॉफ्टवेयर ऐसी छवि प्रसंस्करण उपकरण बॉक्स (Mathworks, Matlab) या 3 डी और 4 डी वास्तविक समय इंटरैक्टिव डेटा विज़ुअलाइज़ेशन (Imaris, Bitplane) के रूप में, विश्लेषण के आधार पर चुना जाना चाहिए.
इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, आईएएनएस -1 यह जल्दी भ्रूण में cytokinesis के लिए आवश्यक नहीं है, भले ही Neuroblast cytokinesis के लिए आवश्यक होना दिखाया गया था. दिलचस्प है, परमाणु नियंत्रित करने सेneuroblasts overlying उपकला कोशिकाओं को रासायनिक या यांत्रिक cues प्रदान क्योंकि mber और neuroblasts की स्थिति, आईएएनएस -1, उदर बाड़े लिए उदर एपिडर्मल कोशिकाओं के प्रवास को विनियमित करते हैं. Ani-1 के मध्य देर embryogenesis दौरान विभाजन या अन्य प्रकार की कोशिकाओं के आकार को बदलने के लिए आवश्यक है, तो हालांकि, यह ज्ञात नहीं है. एक ऊतक के समग्र संरचना पड़ोसी ऊतकों को प्रभावित करता दिखा कैसे metazoan विकास के दौरान ऊतक संचार के महत्व पर जोर दिया.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक इस काम प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा () NSERC अनुदान इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था कि स्वीकार करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada Inc. #AGR001.1 For making C. elegans NGM and RNAi plates
Agar Bio Basic Inc. #9002-18-0 For making bacteria LB agar plates
Agarose BioShop Canada Inc. #AGA001.500
Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11029
Anti-mouse anti-GFP antibody Roche Applied Science #11814460001
Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11011
Ampicillin BioShop Canada Inc. #AMP201.5 Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C
Bactopetone  (peptone-A) Bio Basic Inc. #G213
CaCl2 (calcium chloride) BioShop Canada Inc. #C302.1
Cholesterol BioShop Canada Inc. #CHL380.25 Dissolve in ethanol
DAPI  Sigma-Aldrich #D9542 Use to stain nucleic acids (DNA)
Glycerol BioShop Canada Inc. #GLY001.1
IPTG (isopropylthio-β-galactoside) Bio Basic Inc. #367-93-1 Store powder and dissolved IPTG at -20 °C
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) BioShop Canada Inc. #PPM666.1
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) BioShop Canada Inc. #PPD303.1
L4440  (feeding vector) Addgene #1654 Keep as glycerol stock at -80 °C
MgSO4   (magnesium sulfate) BioShop Canada Inc. #MAG511.500
NaCl (sodium chloride) Bio Basic Inc. #7647-14-5
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. #7558-79-4
Normal Donkey Serum (NDS) Wisent Bioproducts #035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) Alfa Aesar #A10877
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich #P8920 For optimal results coat microscope slides three times 
Streptomycin BioShop Canada Inc. #STP101.50 Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C
Tetracyclin BioShop Canada Inc. #TET701.10 Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C
Tween-20 Bio Basic Inc. CAS#9005-64-5
Tryptone BioShop Canada Inc. #TRP402.500
Yeast Extract Bio Basic Inc. #8013-01-2

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तंत्रिका विज्ञान अंक 85, Morphogenesis cytokinesis neuroblasts anillin माइक्रोस्कोपी कोशिका विभाजन
दौरान Neuroblast cytokinesis Visualizing<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; Embryogenesis
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Wernike, D., van Oostende, C.,… More

Wernike, D., van Oostende, C., Piekny, A. Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis. J. Vis. Exp. (85), e51188, doi:10.3791/51188 (2014).

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