Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Visualisering neuroblast Cytokinesis Under Published: March 12, 2014 doi: 10.3791/51188
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan du bilde dele celler i en vev i Caenorhabditis elegans embryoer. Mens flere protokoller beskrive hvordan bildet celledeling i tidlig embryo, beskriver denne protokollen skal avbilde celledeling innenfor et utviklings vev under midten sent embryogenese.

Abstract

Denne protokollen beskriver bruk av fluorescens mikroskopi til bilde dele celler i å utvikle Caenorhabditis elegans embryoer. Spesielt fokuserer denne protokollen på hvordan bilde dele neuroblasts, som er funnet under epidermal cellene og kan være viktige for epidermal morphogenesis. Vev dannelse er avgjørende for metazoan utvikling og er avhengig av eksterne signaler fra nabo vev. C. elegans er en utmerket modellorganisme for å studere vev morphogenesis in vivo på grunn av sin gjennomsiktighet og enkel organisasjon, noe som gjør dens vev lett å studere via mikroskopi. Ventral kapsling er prosessen hvor den ventrale overflaten av embryoet er dekket av et enkelt lag av epitelceller. Dette arrangementet er tenkt å bli understøttet av den underliggende neuroblasts, som gir kjemisk lede signaler for å mediere migrering av de overliggende epitelceller. Imidlertid neuroblasts er svært proliferative og også kan opptresom en mekanisk substrat for de ventrale epidermale celler. Studier ved hjelp av denne eksperimentelle protokollen kunne avdekke betydningen av intercellulær kommunikasjon under vev formasjon, og kan brukes for å avsløre rollene av gener som er involvert i celle-deling innenfor utviklings vev.

Introduction

Mens det finnes protokoller som beskriver hvordan du bilde celledeling i tidlig C. elegans embryo, beskriver denne protokollen skal avbilde celledeling i en vev under midten embryogenese. En av de store utfordringene i bildebehandling organismer under utvikling har vært deres følsomhet for fototoksisitet. Imidlertid har økt tilgjengelighet til spinnende disk confocal mikroskoper eller feide feltmikroskop tillatt mer utbredte bildebehandlingsprogrammer. Begge systemer bruker faststoff-lasere og spredt lys, å begrense nivåene av UV at organismene er utsatt for. Imidlertid kan Widefield står fortsatt brukes for imaging in vivo, særlig hvis de er utstyrt med kameraer med høy følsomhet (f.eks EMCCD), blenderkontroll og lyskontroll (f.eks LED eller justerbare kvikksølvpærer). Denne protokollen beskriver hvordan du bruker enten en confocal basert system eller et widefield system til bilde celledeling innen utvikling C. elegans </ Em> embryoer. Som et eksempel, beskriver vi hvordan du bilde neuroblast celledeling. Neuroblasts kan lette epidermal morphogenesis ved å gi kjemiske eller mekaniske signaler til de overliggende epidermale celler, og gir et utmerket eksempel på viktigheten av interkommunikasjon i dannelsen av vev.

Caenorhabditis elegans er en ideell modell organisme for mikros baserte studier på grunn av sin åpenhet og enkel vev organisasjon en. Videre C. elegans er mottagelig for genetiske metoder og RNAi, og siden mange av sine gener har humane homologer, kan den brukes til å identifisere konserverte mekanismer for vevsdannelse 2-5. I C. elegans, dannelsen av epidermis oppstår under midten embryogenese, når fosteret har> 300 celler. Epidermal morphogenesis består av flere hovedfasene, hvor fosteret er omsluttet av et lag av epidermale celler som constrict og strekker seg til å transformere embryo fra en ovoid form til den langstrakte form av en snekke 6.. Ventral kapsling beskriver en av disse morfogenetiske arrangementer, da de ventrale epidermale celler migrere mot den ventrale midtlinje for å dekke den ventrale overflaten av embryoet (figur 1). Først, to par anterior ligger forkanten celler migrere mot ventral midtlinjen, hvor de holder og sikring med sine kontralateral naboer seks. Dette er fulgt av migrering av de bakre beliggende lomme-celler, som danner kilelignende former skaper en ventral lomme 6-7. Mekanismen som lukker lommen er ikke godt forstått. En mulighet er at en supracellular aktin myosin kontraktile struktur binder pocket cellene sammen i en håndveske streng som mote, ligner på sårtilheling åtte. Interessant, er migrasjon av noen av lommecellene formidlet av bestemte undergrupper av underliggende neuroblasts 9 (nevrale forløpere som er funnet under epidermis; Figur 1B).

Tidligere studier viste at neuroblasts regulere ventral epidermal cellemigrering og ventral kabinett. VAB-1 (Efrin reseptor) og VAB-2 (Efrin ligand) blir høyt uttrykt i neuroblasts og forenkle sorteringen av fremre og bakre neuroblasts fra hverandre, og mutasjoner i VAB-en eller VAB-2 årsak ventral kabinett fenotyper 10-13. Men arrangøren rednings eksperimenter viste at VAB-en er også nødvendig i de overliggende ventral epidermale celler og reseptorer for andre veilednings signaler skilles ut av neuroblasts er uttrykt i ventrale epidermale celler ni. Selv om mutasjoner i noen av disse reseptorene føre ventral kabinett fenotyper, er det ikke klart om defekter oppstår på grunn av problemer i neuroblast posisjonering eller på grunn av svikt i ventral epidermale celler å svare på veiledning Køer 14. Endring av delingen av neuroblasts without påvirker deres evne til å skille ut veilednings signaler kunne kaste lys over rollen som neuroblasts og deres evne til å gi mekanisk innspill under epidermal morphogenesis. Nylig ble det oppdaget at en celledeling genet, ani-1 (anillin) blir høyt uttrykt i neuroblasts (figur 2A) og dets uttømming forårsaker neuroblast delingsfeil. Interessant, disse embryoer vise ventral kabinett fenotyper (Fotopoulos, Wernike og piękny, upubliserte observasjoner).

Anillin er nødvendig for celledeling, og spesielt for cytokinese, som beskriver en prosess der en mor celle fysisk deler seg i to datterceller. Cytokinesis er drevet av dannelsen av en actomyosin kontraktile ring, som må være strengt kontrollert i rom og tid for å sikre at det er riktig kombinert med søsterkromatidutveksling segregering. Hoved regulator av metazoan cytokinese er RhoA (RHO-en i C. elegans), en liten GTPase som er enctive i sin GTP-bundet skjema. GEF Ect2/ECT-2 aktiverer RhoA, etter som RhoA-GTP samhandler med nedstrøms effektorer som danner kontraktile ring og megle sin tätningssats 15. Anillin er en multidomeneprotein som binder til RhoA via sin C-terminus, og til aktin og myosin via sin N-terminus. Anillin er nødvendig for å stabilisere stillingen av kontraktile ring i pattedyr eller Drosophila S2-celler 16. Anillin uttømming fører kontraktile ringer for å gjennomgå laterale svingninger, og cytokinese slutt svikter forming multinucleate celler 17-19. Interessant, selv om C. elegans ani-en koordinerer actomyosin kontraktilitet i tidlig embryo, det er ikke avgjørende for cytokinese. Men, som beskrevet ovenfor, er ani-en som kreves for neuroblast cytokinese under mid-embryogenese (Fotopoulos, Wernike og piękny, upubliserte observasjoner). Cytokinesis fiasko vil endre antallet og plasseringen av neuroblasts og kunne påvirke locasjon av kjemiske veiledning pekepinner, eller det kan endre de mekaniske egenskapene til vevet. Begge modellene markere nonautonomous rolle neuroblasts for ventral kabinett, og viktigheten av vev-vev kommunikasjon under embryonal utvikling.

Dette eksperimentelle protokollen beskriver hvordan bilde celledeling under C. elegans mid embryogenese bruker fluorescens mikroskopi. De fleste av forsøkene som studerer mekanismene for celledeling ble utført på enkelt-celler i kultur retter (f.eks. HeLa-eller S2-celler), eller i tidlige embryoer med et begrenset antall celler (f.eks C. elegans én-celle-embryo, Xenopus eller echinoderm embryo). Imidlertid er det også viktig å studere celledeling i vev, så er det eksterne signaler som kan påvirke timing og plassering av divisjonen planet. Videre kan celler gi kjemiske eller mekaniske signaler for å påvirke utviklingen av nabo vevs, og det er viktig å forstå hvordan intercellulær kommunikasjon hjelper vev til å danne under utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utarbeidelse av plater for å opprettholde Worm Stammer og Performing RNAi

  1. Nematode vekstmedier Plates
    1. Tallerkener
      1. Forbered nematode vekstmedier (NGM) plater for å opprettholde ormen stammer og å utføre genetiske kors. Kombiner 3 g NaCl, 17 g agar og 2,5 g Bactopeptone med 1 liter destillert vann i en 2 L kolbe og tilsett en metallrørestav.
      2. Autoklaver i kolben for å oppløse agaren og steriliseres mediet. Deretter plasserer kolben på en røre plate og la media avkjøles under omrøring.
      3. Når medie er avkjølt og er fortsatt noe varmt å ta på (45-50 ° C), tilsett 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSo4, 1 ml 5 mg / ml kolesterol løsning og 25 ml 1 M kalium fosfat buffer (PPB; oppskrift i tabell av reagenser / materialer; filter sterilisere lager løsninger) og umiddelbart hell media i små petriskåler (60 mm x 15 mm, fyll rettene ~ 3/4 til toppen eller 13 ml / plate USIng en automatisert dispenser). Merk: For langvarig opprettholdelse av noen stammer tetracyklin kan tilsettes til de plater (12,5 pg / ml) for å tillate Tn10 transposon inaktivering av bakterie-RNase III-genet.
      4. La media stivne over natten ved romtemperatur. Merk: Platene bør holdes i et biologisk hette eller i et område av labben som er mindre utsatt for kontaminasjon. Også fjerne eventuell kondens som har bygget opp på lokkene (f.eks rene med silkepapir) å begrense soppsporer. Hvis Tetracyclin er også lagt til platene, og deretter dekke dem med aluminiumsfolie som dette antibiotika er lysfølsom.
      5. Den neste dag, seede de tørre NGM platene med en suspensjon av E. coli (OP50 belastning, se avsnitt 1.1.2) som har blitt forsiktig blandet. For å lage plater for parring, tilsett ~ 50 ul av OP50 til midten av hver plate (for å danne en liten sirkel). For å gjøre plater for å opprettholde ormen stammer, frø hver NGM plate med ~ 100-200 mL av OP50 (tilsikre at den dekker et større område av platen).
      6. La de seeded platene tørre O / N ved romtemperatur.
      7. Den neste dagen, slår de tørkede NGM platene opp ned og stable dem i plast lagercontainere ved 4 ° C. Merk: Platene er brukbare opp til ~ 3-4 uker. Plater som inneholder Tetracycline bør holdes i mørket.
    2. Mat
      1. Bruk E. coli OP50 [fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] som en matkilde for C. . elegans Merk: OP50 kan lagres som glyserol aksjer ved -80 ° C (i forholdet 01:01 i 50% v / v glycerol).
      2. For å gjøre OP50 for NGM plater, gjør en strek plate ved hjelp av en liten delmengde av glyserol lager (<10 mL, bruke en steril pipette tips). Spre bakterier på en LB agar plate (oppskrift i tabell av reagenser / materialer) og la den på 37 ° C for ~ 16 hr. Merk: Hvis det er problemer med forurensning, kan streptomycin resistente OP50 brukes, ennd streptomycin kan tilsettes til de LB agar plater (50 pg / ml).
      3. Den neste dagen, velg en enkelt koloni og inokulere 100 ml flytende LB-medium (oppskriften i tabell med reagenser / materialer) i en 500 ml kolbe.
      4. La kulturen vokse O / N ved 37 ° C med risting.
      5. Den neste dag, bruker bakteriell suspensjon for seeding NGM plater. Merk: OP50 kan alikvotert i 50 ml koniske rør og lagret ved 4 ° C i ~ 4-6 uker.
  2. RNAi
    Mate er en av de viktigste måter å utføre RNA mediert interferens (RNAi; å knockdown et bestemt genprodukt) i C. elegans. C. elegans hermafroditter kan mates E. coli stamme HT115 transformert med en fôring vektor som uttrykker dsrna ved induksjon. Dette dsRNA (eller dets fragmenter) blir overført til den gonade, som vanligvis fører til betydelig knockdown av den spesifikke gen-målet.
    1. RNAi Plates
      1. Forbered NGM plater som beskrevet ovenfor (se seksjon 1.1.1), men også legge til 1 ml av 1 M IPTG (isopropyltio-beta-D-galaktosid, for å indusere ekspresjon av dsRNA), og 500 pl av 50 mg / ml ampicillin (Amp; de vektorer som uttrykker dsRNA er Amp -resistent) til den varme medier (45-50 ° C).
      2. Etter at platene har tørket, frø dem med ~ 50 til 100 pl av E. coli HT115 (se avsnitt 1.2.2). Merk: unseeded plater kan lagres ved 4 ° C for ~ 4-5 uker.
      3. La de seeded platene tørke over natten ved romtemperatur.
      4. Den neste dagen, slår de tørkede RNAi platene opp ned og lagre dem i en plastboks container ved 15-20 ° C. Note: Last plater beholde RNAi effektivitet for opp til ~ 2-3 uker.
    2. RNAi Mat
      1. Bruk E. coli HT115 (fra CGC, se avsnitt 1.1.2) transformert med fôring vektor L4440, eller L4440 inneholder cDNA til et gen av interesse. Merk: Feeding bibliotekene som er rettet mot de fleste av åpne leserammer i genomethar allerede blitt gjort, og er tilgjengelig (kloner i L4440 forvandlet til HT115, f.eks inneholder et fragment fra Y49E10.19 for ani -1 20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / pages / rnai.html). Merk: HT115 kan holdes så glyserol aksjer ved -80 ° C (i forholdet 01:01 i 50% v / v glycerol).
      2. For å generere en ny konstruksjon rettet mot et gen av interesse, se L4440 vektorkart og klone cDNA mellom de flankerer T7 arrangører, som er induserbar av IPTG.
      3. Transform HT115 med L4440 konstruere ved hjelp av en standard protokoll for transformasjon (f.eks lage kjemisk kompetente bakterier og utføre varme sjokk transformasjon).
      4. Som beskrevet for OP50 (se avsnitt 1.1.2), bør stripe bakterier fra glycerol lager på en LB-agarplate, men plate også inneholde 50 ug / ml Ampicillin. Merk: Hvis du bruker en pre eksisterende L4440 konstruere, hoppe Seksjoner 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Plukk en enkelt koloni og vaksinere 5 mlav LB media inneholder 5 mL av ampicillin fra en 50 mg / ml lager (LB Amp), og plassere den ved 37 ° C med risting.
      6. Etter ~ 16 timer, inokulere 5 ml frisk LB Amp media med 50 pl av O / N-kultur og vekst i kultur i 7-8 timer med risting ved 37 ° C.
      7. Sentrifuger bakterier i 1 min på 4,000-8,000 xg, kast supernatanten og resuspender pellet i 500 mL frisk LB Amp media.
      8. Bruk denne bakteriell løsning for å seede de RNAi plater som beskrevet ovenfor (se avsnitt 1.2.1). Merk: HT115 bør brukes umiddelbart, og bør ikke lagres.

2. Dyrker Worm Stammer

Oppretthold C. elegans stammer bestilt fra CGC på NGM plater i henhold til standard protokoll 1. Stammene som ble brukt for denne protokollen er: C. elegans Div. Bristol, vill-type (stamme ID på CGC N2); unc-119 (tm4063); wgIs102 [skinke-en unc-119 (+)] (stamme ID på CGC OP102); unc-119 (ED3); ltIs44pAA173 [pie-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (stamme ID på CGC OD70); AJM-en (ok160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (stamme ID på CGC SU159); unc-119 (ED3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: HMR-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR + unc-119 (+)] (stamme ID på CGC FT250).

  1. Plukk ~ 3 unge voksne hermafroditter som viser riktig fenotype til en frisk NGM plate. Bemerk: N2 (var. Bristol, vill-type) kan opprettholdes mellom 15-25 ° C, men de vil komme tetthet raskere ved høyere temperaturer. Nye aksjer bør gjøres når ormen tettheten er høy.
  2. Hold alle fluorescerende stammer (f.eks GFP og / eller mCherry-uttrykker ormer) ved 20-25 ° C for optimalt uttrykk for fluorescerende proteiner. Nye aksjer bør gjøres når ormen tettheten er høy og mat er lav.
  3. Å plukke ormer, bruke enpick laget av et trukket glass pipette med en platinatråd smeltet ved uttrukket ende (~ 3-5 cm i lengde). Flat ut ledningen med en jevn kant. Bruk pick å "scoop" opp hermafroditter og overføre dem til nye plater. Flamme ledningen i mellom bruk for å unngå smitte av påkjenningen.

Tre. RNAi

  1. Utføre RNAi
    1. Først til sted ~ 8 L4 hermafroditter på en unseeded NGM plate for ~ 30-60 min fjerne OP50 bakterier fra ormer.
    2. Deretter plasserer de åtte hermafroditter på en NGM Amp IPTG plate seeded med HT115 som bærer L4440 plasmid uttrykker dsrna til et gen av interesse (f.eks ani-en;. Se 1.2) for ~ 24 hr. Merk: Avhengig av genet av interesse, eller de ønskede fenotyper (som kan være avhengig av styrken på knockdown), kan ormer stå på RNAi plater for kortere eller lengre perioder av gangen (etter 24 timer, plassere hermafroditter på fersk RNAi plater).
    3. For en negAtive kontroll, sted ormer på en RNAi plate seeded med HT115 bærer tom L4440 vektor. Merk: Disse embryoene skal ikke ha noen fenotyper.
    4. For en positiv kontroll, plasserer ormer på en RNAi plate uttrykker dsrna som er rettet mot et gen med godt karakterisert fenotyper. Merk: For rho-en (Y51H4A.3), embryoer er 100% dødelig etter 24 timer og hermafroditter er sterile etter 48 hr.
  2. RNAi Effekt
    Nivåene av knockdown etter RNAi skal testes, særlig siden noen vev kan være mer motstandsdyktige enn andre. I løpet av tidlig mid embryogenesen fleste vev er RNAi-sensitive, men på slutten av embryo eller larve, nevroner er RNAi-resistente. Forskjellige stammer kan brukes for å forbedre RNAi følsomhet (f.eks RRF-3), eller for å generere vev-spesifikk RNAi (f.eks sid-1 i kombinasjon med en transgenet uttrykt av det nevrale promoter unc-119).
    1. Western Blotting
      Immunoblotting hjelp C. elegans proteiner kan væreutført i henhold til standard protokoll 22.
      1. Etter å ha utført RNAi, samle ~ 10 gravid (fylt med embryoer) hermafroditter i en mikrosentrifuge tube, tilsett 20-30 mL 1x SDS-PAGE prøvebuffer og lyse ved å koke for ~ 2 min. Tilsvarende samler N2 ormer i et eget rør for kontrollprøven. Merk: Antallet hermaphrodites kan variere avhengig av følsomheten av de primære antistoffer.
      2. Lag fortynninger av kontrollprøven (f.eks 3-100%) i prøvebuffer. Legg kontroll og RNAi eksempler og drives ved hjelp av SDS-PAGE i henhold til standardprotokollen (i% gel vil variere avhengig av størrelsen av proteinet av interesse).
      3. Overfør gelen til en membran og utføre immunoblotting som per standard protokoll. Merk: Bruk forskjellige primære og sekundære antistoff fortynninger som anbefales for hvert antistoff.
      4. Utvikle (for eksempel hvis du bruker chemiluminescence) eller skanne (for eksempel hvis du bruker fluorescens) immunoavtrykket og sammenligne the tettheten av band i N2 baner g. RNAi lane, og bestemme nivået av knockdown (for eksempel tettheten av RNAi lane stemmer overens med 12% kontroll lane, tyder dette på at proteinet er redusert med 88%). Merk: For å se effektiviteten av ANI-en knockdown, se Maddox et al 23.
    2. Immunostaining
      Farging i C. elegans kan utføres i henhold til standard protokoll 22.
      1. Etter å ha utført RNAi, samler av gravid hermafroditter og høste embryoer ved hjelp av én av to metoder. For en av de metoder, sted hermafroditter i M9 buffer (oppskrift i tabell av reagenser / materialer) i 1,5 ml Siliconisert mikrosentrifugerør og pellet via sentrifugering (1000-4000 xg). Merk: På samme måte samle N2 av gravid hermafroditter.
      2. Fjern M9 løsning.
      3. Innholdet trykkes ut embryoer ved å tilsette 1 ml av blekeløsning (1 M NaOH, 5% blekemiddel) i mikrosentrifugerør i 3 min. Tilsvarende bleike N2 hanrmaphrodites å foreta kontroll lysbilder.
      4. Vortex forsiktig, deretter umiddelbart pellet embryoene via sentrifugering (4,000-8,000 xg) og fjern bleking løsning. Merk: Den totale tiden som ormene inkuberes med blekemiddel bør ikke overstige 5 min.
      5. Vask embryoene 3x med Tris-bufret saltvann (TBS, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl) og overføre embryoer ved hjelp av en glass Pasteur-pipette til en poly-L-lysin-belagte objektglass. Merk: For å belegge et glass objektglass med poly-L-lysin, først tørke lysbildet, og deretter legge en dråpe (~ 20-30 mL) av poly-L-lysin og spre den jevnt over overflaten og la tørke. For optimale resultater, frakk lysbildene to flere ganger. En alternativ metode for å samle embryo (kapitlene 3.2.2.1-3.2.2.5) er å plassere en dråpe M9 på en poly-L-lysin-belagte objektglass og plukke ~ 10 av gravid hermafroditter inn drop.
      6. Legg et dekkglass på toppen av hver objektglass (til området som inneholder det meste av embryoene) og stedlysbildene i flytende nitrogen. Merk: For hermafroditter plassert direkte i fallet, legge press på dekk å bryte åpne hermafroditter og utvise embryoene.
      7. Fryse-knekke embryoene ved å dra av Dekk umiddelbart etter å fryse dem i flytende nitrogen.
      8. Plasser lysbildene i iskald metanol i 20 min å fikse embryoer. Merk: For enkelte antigener, kan et tverrbindings bindemiddel slik som paraformaldehyd være å foretrekke. Se protokollen fra Duerr 22.
      9. Rehydrere og permeabilize embryoene ved å vaske objektglassene 4x med Tris bufret saltvann inneholdende Tween-20 (TBST, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) i 10 minutter hver.
      10. Tørk hvert lysbilde rundt området som inneholder det meste av embryoene og tegne en sirkel rundt embryoene ved hjelp av en flytende blokkering penn (f.eks PAP penn).
      11. Legg ~ 100 mL av TBST med 5% normal esel serum (NDS; blokk) til hvert bilde (innringet område) og inkuberes20 min ved RT. Merk: Plasser lysbildene i en "våt kammer" (f.eks et fat med lokk som inneholder våte tørkepapir).
      12. Fjern blokken, legge ~ 50-100 mL av primære antistoffer (fortynnet i TBST) til hvert bilde (innringet område) og inkuberes i 2 timer ved romtemperatur. Merk: Avhengig av antistoffet, kan fortynningen og inkubasjonstid variere. For å detektere GFP, bruker vi en anti-mus-anti-GFP primære antistoff i en 1/200 fortynning. For å oppdage ANI-en, bruker vi en anti-kanin anti-ANI-en primær antistoff i en 1/1600 fortynning (vennlig levert av Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). For lengre inkubasjonstid, plasserer lysbilder ved 4 ° C.
      13. Fjern primære antistoffer (hvis det er mulig, holde for fremtidig bruk) og vaske lysbilder 3x med TBS for 5 min hver.
      14. Fjern siste vask og legge ~ 50-100 mL av sekundære antistoffer (fortynnet i TBST) til hvert bilde (innringet område) og inkuberes i 2 timer ved romtemperatur. Merk: Avhengig av antistoff, kan utvanning variere. For å oppdage GFP, bruker vi en enNTI-mus Alexa Fluor 488 sekundært antistoff i en 1/250 fortynning. For å detektere ANI-1, bruker vi en anti-kanin Alexa Fluor 568 sekundært antistoff i en 1/250 fortynning.
      15. Fjern sekundære antistoffer og vaske lysbilder 3x med TBS for 5 min hver. Bemerk: For å sette flekker på DNA, tilsett ~ 50-100 ul av DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole, 1 mg / ml) i 1/500 fortynning i TBST i 5 min.
      16. Fjern DAPI og vask slides 2x med TBS i 5 minutter hver. Merk: Hvis DAPI farging ikke er utført, hoppe over dette ekstra vasketrinn.
      17. Utfør en rask vask med 0.1m Tris (pH 9), fjerne og legge til ~ 15 mL av monterings media forvarmet til 37 ° C (4% n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate), 50 mM Tris, pH 9 i 50% glyserol) til hvert bilde (innringet område).
      18. Legg et dekkglass til hvert bilde (på toppen av montering media i sirklet området), veke av overflødig væske og forsegle lysbildene med neglelakk. Merk: Lysbilder kan lagres ved -20 ° C.
      19. Observer embryoene pålysbildene med en widefield fluorescerende mikroskop eller laserskanning confocal mikroskop. Viktigere, justere innstillingene for å samle bilder av optimal piksel intensitet ved hjelp av kontroll (N2 eller ikke-RNAi) embryoer. Deretter samle bilder fra RNAi embryoer med de samme innstillingene. Eksempler på bilder som samles for kontroll vs ani-en RNAi embryoer er vist i figur 2B.

4. Utarbeidelse av Slides for Live Imaging og Høsting embryo

  1. Utarbeidelse av agarose pads for live bildebehandling
    1. Plasser en ren, pre varme mikroskop lysbilde mellom to andre lysbilder, hver med 1-2 strimler av tape på dem.
    2. Ved hjelp av en glass Pasteur-pipette, tilsettes en dråpe av 2% w / v agarose (oppløst i oppvarmet destillert vann) til objektglasset.
    3. Raskt plassere en andre, rent objektglass på toppen av det første lysbildet i en vinkelrett måte å flate agarose dråpe. Merk: Den tape på nabo gledes gir tykkelsen for puten.
    4. La agarose pad tørr for en 1-2 min før du fjerner den øverste lysbildet. Skyv av toppen lysbilde nøye for å unngå å bryte agarose pad under. Merk: Noen ganger puten overføres til toppen lysbilde og er fortsatt brukes, så lenge det forblir intakt.
    5. Overfør embryoene på agarose puten i løpet av få minutter etter dens fremstilling, som beskrevet nedenfor (se trinn 4.2.) Merk: Puten skal ha en ugjennomsiktig utseende, når det er klart, er det for tørt til å bruke.
  2. Høsting embryoer
    1. Anvende følgende fremgangsmåte for innsamling av embryoer for direkte avbildning, som er avledet fra Sulston et al. 24.
    2. Plukk ca 4-6 av gravid voksne (ikke sultet) fra NGM eller RNAi plater og plassere dem i 20-30 mL av M9 buffer i en brønn på en depresjon lysbilde.
    3. Bruk en sterilisert skalpell for å kutte ormene på hver side av spermatheca (eller alternativt ved vulva) tilslipper embryoer i løsningen.
    4. Bruk en gummislange med et munnstykke koblet til en glasskapillærer / pipette trukket å ha en liten diameter og suge embryoene gjennom munnen pipettering. Alternativt kan samle embryoer med et kapillær glassrør som er festet til en Pasteur pipette gummipære.
    5. Overfør suges embryo til en andre brønn også inneholdende M9-buffer, for å skille dem fra snekke rusk.
    6. Deretter suge embryoene mot en nylaget agarose pad (se trinn 4.1).
    7. Klump embryoer sammen ved hjelp av en øyenvippe (limt til en tann hakke) for å øke antall embryo som kan bli filmet i en x, y planet. Merk: For å unngå oksygenmangel, ikke klumpe seg mer enn ti embryoer sammen.
    8. Deretter dekker lysbilde med et dekkglass og delvis forsegle den med pre oppvarmet væske VALAP (vaselin, lanolin og parafin, smeltet og kombinert 01:01:01) for å hindre dehydrering av embryoene under bildebehandling. Merk: Ytterligere M9 buffer can tilsettes til puten for å sikre at embryoer har tilstrekkelig væske for avbildning. I stedet for VALAP, kan vaselin brukes til delvis tetter dekkglass, men det er mindre rigid forårsaker Dekk å skli og kunne komme inn på mikroskopet mål.

5. Levende Imaging

  1. For å visualisere neuroblasts, få en orm belastning som uttrykker en neuroblast-bestemt protein festet til et fluorescerende protein (f.eks HAM-1: GFP, belastning ID på CGC OP102). For å oppdage cellemembraner, bruke en orm belastning som også uttrykker et protein domene som gjenkjenner lipider som er knyttet til et annet fluorescerende protein (f.eks mCherry:. PH, belastning ID på CGC OD70).
  2. Slakte embryoer fra fluorescerende hermafroditter holdt på kontroll eller ani-en RNAi plater (se protokoller 3 og 4), og forberede lysbilder som beskrevet ovenfor (se protokoll 4).
  3. Bilde embryoer i 4D (x, y, z og time-lapse) ved epifluorescence mikroskopi. Bruk enten en widefield system [automatisert fluorescerende mikroskop med filtre for GFP og TexasRed, mål opp til 60X eller 100X, en høyoppløselig CCD (charge coupled device) kamera, svært motorisert stadium (f.eks. Piezo Z) og spesialisert oppkjøpet programvare] eller en livescan feide felt konfokalmikroskop [automatisert fluorescerende scanning mikroskop med 488 nm og 561 nm lasere, mål opp til 100X, en EMCCD (elektron multiplisere CCD) kamera, svært motorisert stadium (f.eks Piezo Z) og spesialisert oppkjøpet programvare]. Merk: For widefield-systemet, vil ved hjelp av lysdioder og en EMCCD kamera begrense fototoksisitet. Dessuten kan et roterende disk konfokalmikroskop bli brukt i stedet for det sveipede feltsystem.
  4. Til bilde neuroblast celledeling på enten systemet, finne x, y rammer av embryoer ved hjelp av 10x eller 20X mål, og velge et optimalt x, y ramme hvor embryoene er under rygg intercalation (trinn før ventral kabinett, Figur 1a) eller er på tidlige stadierav ventral kabinett (~ 350 minutter etter den første celledeling, figur 1A).
  5. På den feide feltet mikroskop, bruker 488 nm og 561 nm 100 mW lasere på 40% effekt med en spalte på 50. På Widefield-systemet, bruke GFP og TexasRed filtre med lav-middels lysintensitet (hvis kontrollerbar). Merk: For Vidvinkel system, LED har lav fototoksisitet og er å foretrekke.
  6. På begge system, bruker 60X eller 100X olje immersion mål og samle 20 Z-stabler av 0,2 mikrometer hver 2 min for totalt 10 min. Merk: Selv om HAM-1: GFP og mCherry: PH prober uttrykke på relativt høye nivåer, vil de eksponeringstider for hver sonde må være optimalisert for forskjellige mikroskoper. Merk: For widefield-systemet, er det færre Z-stabler anbefales å begrense fototoksisitet og for bildebehandling over lengre perioder av gangen, bruke færre tidspunkter.
  7. For å minimere fototoksisitet forårsaket av eksponering av befruktede egg for UV lys på widefield-systemet (hvis du bruker en mercury pære), lukke åpningen til 30% og redusere lysintensiteten (ved hjelp av en justerbar belysning system). Merk: Selv om forsterkningen ikke er nødvendig å bruke enten systemet, kan andre mikroskoper har lyskilder med lav intensitet eller mål med forskjellige numeriske åpninger, noe som kan kreve bruk av forsterkningen for å oppnå bilder av optimal pikselintensiteten. Test betingelsene ved hjelp av en kontroll embryo for å sikre at eventuelle observerte fenotyper er ikke på grunn av kunstig fototoksisitet.

6. Analyse av Mikros data

  1. Å analysere bildene, eksportere filer som TIFF og åpne TIFF som en stabel hjelp av spesialisert programvare som en Java-basert bildebehandlingsprogram (f.eks ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Merk: Avhengig av oppkjøpet programvare som brukes til å samle inn bildene, kan filene bli holdt i sin opprinnelige form og åpnet i ImageJ. Dette er å foretrekke som metadata er holdt med filene.
  2. Separer bunkeninn i "bilder" og velg tidspunkter og Z-flyene som ønsket. Merk: Selv om en stabel av 20 Z-planene er tatt, er mange av neuroblasts er <1 mikrometer tykke under midten sen embryogenese og bare noen få Z-planene er nødvendig.
  3. Stable de valgte Z flyene for hvert tidspunkt og lage separate Z-stack anslag. Deretter stable anslagene for hver gang peke sammen for å lage en tidssekvens.
  4. Foreta justeringer av lysstyrke / og eller kontrast for hver kanal.
  5. Deretter velger en region av interesse, beskjære (og rotere hvis nødvendig) regionen.
  6. Lag sammenslåtte bilder ved hjelp av 'fusjonerte kanaler' funksjon og velge en annen farge for hver kanal. Konverter sammenslåtte bilder til RGB.
  7. Vend gråtonebilder for hver kanal fra trinn 6,3 eller 6,4 (bruk "invert" funksjonen under "rediger") for å visualisere bilder klarere.
  8. Lagre alle endelige bildene som 8-bits TIFF å lage figurer i vektorbasert prog.vareer programmer eller som Quicktime-filer for å lage filmer.
  9. Ved målinger av pikselstørrelse er nødvendig (for eksempel for å inkludere en skala bar med bilder), bruker ImageJ eller annen bildebehandling for å måle størrelsen av embryoet. Merk: Bildene som samles inn ved hjelp av ulike mål vil ha forskjellige pikselstørrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette eksperimentelle protokollen beskriver hvordan du bilde celledeling i C. elegans embryoer under midten embryogenese. Spesielt beskriver det hvordan bilde neuroblasts, som kan legge til rette for epidermal morphogenesis. Epidermal morfogenese oppstår på grunn av en kombinasjon av epidermal celle form endringer, migrasjon og vedheft, men også avhengig av kjemiske eller mekaniske signaler fra de underliggende neuroblasts (Figur 1b). De neuroblasts utsondre veiledning signaler som er mottatt av reseptorer på overflaten av ventral epidermale celler, som regulerer deres migrasjon 10,14,25. Videre neuroblasts er meget proliferative, noe som kan gi mekaniske krefter som bidrar til migrering av ventrale epidermale celler 26. Denne protokollen kan brukes til å studere neuroblast celledeling under midten embryogenese. Først embryoer coexpressing markører for å visualisere neuroblasts (HAM-1: GFP) gjennomgår cytokinese: er (mCherry PH) generert. HAM-1: GFP uttrykker GFP (grønt fluorescerende protein) tagget protein som lokaliserer til neuroblast atomkjerner 27, og er nødvendig for å bruke siden det er mange andre celletyper stede under midten embryogenese (> 300 celler, figur 3). Denne fungerer også som en god markør for å dele celler, siden DNA kondenserer til kromosomer under mitose. mCherry: pH er en mCherry-merket fluorescerende protein som er uttrykt ved en maternal promoter (pie-1), og som inneholder lipid bindende domene fra PLC1 ∂ en 28 som lokaliserer til cellemembraner. Dette proteinet er nødvendig for å visualisere cytokinese, når membranen og cytosol klype for å separere modercellen i to datterceller, Fig. 3; Video 1). Selv om denne protokollen beskriver hvordan du bilde neuroblast divisjon, (vist av HAM-1: GFP uttrykk), kunne andre markører brukes til å visualisere andre celletyper.

For å visualisere dele neuroblasts, embryoer coexpressing HAM-1: GFP og mCherry: pH er avbildes hvert 2 min (for en total av 10 min). Hver neuroblast er bare ~ 1-4 mikrometer i diameter, og er <1 mikrometer tykke, og det er best å bruke et mål med høy forstørrelse (f.eks. 100X). Videre er tallrike Z-stabler (~ 20) er samlet med en liten trinnstørrelse (0,2 mm) for å sikre at de forskjellige vinkler av hver celle (sfærisk form) er avbildes. Å samle så mange bilder uten å gå på akkord tidspunkter, er en svært motorisert stadium (f.eks Piezo Z Stage) anbefales. Etter oppsamling av en serie med bilder, blir de analysert for å finne celler i løpet av noen få Z-stabler som deler seg, DNA blir kondensert, membranen er ingressed og de nye datterceller er dannet (tidspunkter av det projiserte stabel av flettede kanaler er vist i figur 3A, og utvalgte stabler av flettede kanaler er vist i figur 3B, Video 1). For bedre å visualisere cellene, er det anbefalt åholde hver kanal i gråtoner og snu bildet (f.eks figur 4).

Bildeoppløsningen er forskjellig for widefield-systemet med en høyoppløselig CCD-kamera (1344 x 1024 piksler) vs. Feie feltet systemet med en høy hastighet EMCCD kamera med høy følsomhet (~ 35 bilder / sek og 512 x 512 piksler). Inverterte bilder av dele neuroblasts fra kontroll embryoer tatt med begge systemene presenteres for sammenligning (figur 4 vs. 5). Som vist i figur 4A (widefield system; Video 2), bildene er klarere vs Figur 5A. (Feide feltet system; Video 4). Men når du bruker widefield-systemet, embryoer er utsatt for fototoksisitet og raskere tidspunkter er ikke mulig med kamera med høy oppløsning. For eksempel, for å se på endringer i lokaliseringen av forskjellige proteiner (f.eks. To studere endringer i sine dynamikk), kan tidspunkter må hentes oftere. Dessuten kan det ikke være mulig å avbilde i lengre perioder uten å redusere antall Z-stabler og tidspunkter. Ved hjelp av en EMCCD kamera på widefield-systemet kan tillate et bredere spekter av bildebehandlingsprogrammer. Kameraer som har både høy oppløsning og høy hastighet har blitt utviklet, men driverne er kanskje ikke tilgjengelig, avhengig av oppkjøpet programvare som brukes, og de fortsatt ikke kan være så følsom som EMCCD kameraer. Et annet system som vanligvis brukes for bildebehandling C. elegans er den roterende disk confocal, som også har lavere fototoksisitet og kan være utstyrt med enten EMCCD eller CCD-kameraer (se diskusjon).

For å studere gener som er nødvendig for celledeling, er hermaphrodites behandlet med RNAi mot et gen av interesse (for eksempel ani-1, se avsnitt 1.2 og 3 av protokollen) og deres embryoer blir fotografert på samme måte som kontrol embryoer. Å sammenligne celler fra RNAi embryo å kontrollere embryoer, er det best å image på lignende stadier av embryoutvikling (for å hjelpe kamp celleformer og posisjoner). For eksempel er det et større celle synlig i sentrum av den ventrale embryo under kabinett som kan fungere som et godt referansepunkt for avbildnings neuroblasts (figur 4 og 5). Genet studert her, ani-en (anillin), organiserer actomyosin kontraktilitet, men er ikke nødvendig for cytokinese i tidlig embryo 23,29-30. Anillin er homologer, men er nødvendig for cytokinese i høyere eukaryoter 16, og ani-en er nødvendig for neuroblast cytokinese (Fotopoulos, Wernike og Piekny, upubliserte observasjoner). Som vist på figurene 4B (Video 3) og 5B (Video 5), flere neuroblasts initiere cytokinese og deres membraner knip i, men i stedet for å danne to separate datterceller, deres membraner regress og cellene blir multinucleate (> 1 nucleus / celle). Det må bemerkes at ani-1.5 være nødvendig for divisjon eller formendring av andre celletyper, noe som ikke er avdekket av denne protokoll. Videre gjør denne protokollen viser ikke resultater fra vev spesifikk RNAi (se diskusjon).

Figur 1
Figur 1. Ventral kabinett under C. elegans epidermal morphogenesis. A) Z-stack anslag (3 Z-stabler med 0,5 mikrometer i tykkelse) av en kontroll AJM-1: GFP (adherens krysset markør for å visualisere epidermal cellegrenser; belastning ID på CGC SU159) embryo gjennomgår rygg innføynings (venstre, rygg view ) og en kontrollgruppe AJM-1: GFP embryo gjennomgår ventral kabinett (høyre, ventral view). Bilder blir invertert til bedre visualize cellegrenser. B) Tegneserier viser ventral utsikt over C. elegans embryo gjennomgår ventral kabinett. Først, to par ledende celler (blått) bruker aktin rik filopodia (svarte linjer) for å migrere mot ventral midtlinjen (embryo til venstre). Neste de bakre ventral pocket celler (røde) migrere mot midtlinjen skape et hull på baks overflate som kan stenge av en håndveske streng som mekanisme (B '; svart stiplet linje / sirkel; minner om sårtilheling) 25. Også vist er de underliggende neuroblasts (som grå sirkler). Den andre embryo (B ") viser hvordan migrasjon av spesifikke undergrupper av epidermal cellene blir formidlet av en" bro "dannet fra omorganisering av PLX-2/plexin og VAB-1/Ephrin reseptor-uttrykke 'plexin bandet' celler (grønne sirkler). Klikk her for å se større bilde.

Fig. 2
Figur 2. ANI-en lokalisering i C. elegans embryoer. A) Et fast C. elegans embryo uttrykker HMR-1: GFP (E-cadherin, markør for epidermal cellegrenser) costained for GFP (grønt) og ANI-en (rød). Confocal bilder av de ytre cellelag (4 Z-stabler med 0,2 mikrometer i tykkelse) viser de overliggende epidermale celler og underliggende neuroblasts, som er ANI-en positiv B) Faste N2 og N2;. Ani-en RNAi embryoer er co farget for ANI-en. ANI-en er sterkt redusert i ani-1-utarmet embryo. Scale barer:. 10 mikrometer Klikk her for å se større bilde.


Figur 3. Visualisering dele neuroblast under C. elegans embryogenese. (A) Z-stack anslag (20 Z-stabler med 0,2 mikrometer i tykkelse) er vist fra en kontroll embryo coexpressing HAM-1: GFP (å visualisere neuroblast kjerner, grønn) og mCherry: PH (å visualisere cellemembraner, rød) . Mange neuroblasts og andre celletyper er synlige i anslagene (B) Z-stack anslag ved hjelp av et mindre antall Z flyene er vist fra en annen kontroll embryo coexpressing HAM-en:. GFP (grønt) og mCherry: PH (rød). Et område er zoomet inn (hvit boks) for å tydeligere vise et individ skille neuroblast. Hvite piler peker til ingressing plasma membran av en dele celle og grønne sirkler markere kondensert DNA under mitose og nyligforming datter kjerner mot slutten av mitose. Den store celle fungerer som et referansepunkt (hvit stjerne) for å fastslå utviklingsstadiet og plassering i embryo. Scale barer:. 10 mikrometer (hvite) og 3,5 mikrometer (gul) Klikk her for å se større bilde.

Figur 4
Figur 4 Visualisering neuroblast cytokinese under C.. elegans embryogenese bruker en widefield system. A) Inverted Z-stack anslag (2 Z-stabler med 0,2 mikrometer i tykkelse) er vist fra en kontroll embryo coexpressing HAM-1: GFP og mCherry: PH hentet fra widefield-systemet med en CCD-kamera med høy oppløsning. Røde pilspisser peke på skille neuroblasts med ingressing cellemembranene. Grønne sirkler markere kondensert DNA under tidlige faser av mitose eller nylig forming datter kjerner mot slutten av mitose / cytokinese. Den store celle fungerer som et referansepunkt (gul stjerne) for å fastslå utviklingsstadiet. B) Bildene som vises er lik A), men er fra et embryo behandlet med ani-en RNAi. Cellemembranen ingresses i så cellen fortsetter gjennom mitose, men slapper kort tid etter, og etterlater en multinucleate celle. Målestokk:. 10 mikrometer (svart), 3,5 mikrometer (gul) Klikk her for å se større bilde.

Figur 5
Figur 5. Visualisering neuroblast cytokinese under C. elegans embryogenese bruker en feide feltsystemet. A) Inverted Z-stack projeksjoner av to Z-stabler av 0,2 mikrometer (totalt 0,4 mikrometer) er vist fra et embryo coexpressing HAM-1: GFP og mCherry: PH hentet fra feide feltet systemet ved hjelp av en EMCCD kamera med høy følsomhet, men lavere oppløsning. De røde pilspiss peker på en neuroblast gjennomgår cytokinese. Grønne sirkler markere kondensert DNA under mitose og den nylig forming datteren atomkjerner etter cytokinese. Den store celle fungerer som et referansepunkt (gul stjerne) for å fastslå utviklingsstadiet. B) Bildene som vises er lik A), men er fra et embryo behandlet med ani-en RNAi, og 3 Z-stabler brukes (totalt 0,6 mikrometer ). Som beskrevet ovenfor, slapper membran ingresses som i cellen går gjennom mitose, men da slik at cellen blir multinucleate. Målestokk: 10 mikrometer (svart), 3,5 mikrometer (gul).188/51188fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Video 1. Visualisering skille neuroblasts under C. elegans embryogenese. Z-stack projeksjoner av to Z fly (0,4 mikrometer / fly) fra en kontroll embryo coexpressing HAM-1: GFP (grønt) og mCherry: PH (rød). Bilder hentet fra widefield mikroskop vises for begge kanaler. Video tilsvarer den embryo vist i det tredje panel ifølge figur 3B. klikk her for å se video.

Video to. Visualisering skille neuroblasts under C. elegans embryogenese. Z-stack projeksjoner av to Z fly (0,4 mikrometer / fly) fra en kontroll embryo coexpressing HAM-1: GFP (grønt) og mCherry: PH (rød). Videoen tilsvarer speilvendte bilder samlet inn fra widefield mikroskop for mCherry: PH kanal only (embryo i figur 4A). Klikk her for å se video.

Video 3. Visualisering skille neuroblasts under C. elegans embryogenese. Z-stack projeksjoner av to Z fly (0,4 mikrometer / fly) fra en ani-en RNAi behandlet embryo coexpressing HAM-1: GFP (grønt) og mCherry: PH (rød). Videoen tilsvarer speilvendte bilder samlet inn fra widefield mikroskop for mCherry:. PH-kanal bare (embryo i Figur 4B) Klikk her for å se video.

Video 4. Visualisering dele neuroblast under C. elegans embryogenese. Z-stack projeksjoner av to Z fly (0,4 mikrometer / fly) fra en kontroll embryo coexpressing HAM-1: GFP (grønt) og mCherry: PH (rød). Videoen tilsvarer invertereed bilder hentet fra den feide feltet konfokalmikroskop for mCherry:. PH-kanal bare (embryo i figur 5A) Klikk her for å se video.

Video fem. Visualisering dele neuroblast under C. elegans embryogenese. Z-stack projeksjoner av tre Z fly (0,4 mikrometer / fly) fra en ani-en RNAi behandlet embryo coexpressing HAM-1: GFP (grønt) og mCherry: PH (rød). Videoen tilsvarer speilvendte bilder hentet fra den feide feltet konfokalmikroskop for mCherry:. PH-kanal bare (embryo i figur 5B) Klikk her for å se video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver bruken av ulike typer mikros til bildecelledel under midten embryogenese. Spesielt fremhever denne protokollen skal avbilde delingen av neuroblasts, celler som kan legge til rette for epidermal morphogenesis. Celle-celle-kommunikasjon er viktig for vev formasjon under metazoan utvikling og C. elegans er en utmerket modell for å studere vev dannelse in vivo. En hendelse som pent skildrer samspillet av vev er epidermal morfogenese, som dekker fosteret i et lag av epitelceller. Spesielt er ventral kapsling prosessen der ventrale epidermale celler migrere til å omslutte den ventrale overflaten av embryoet, og er avhengig av de underliggende neuroblasts. De neuroblasts gi kjemiske eller mekaniske signaler, og ventral kabinett er kompromittert hvis plasseringen av neuroblasts er endret. Nummeret (eller polariteten) av neuroblasts også kan være avgjørende for ventral kapsling til å oppstå på riktig måte,og det er viktig å forstå mekanismene som regulerer sin divisjon. Denne protokollen beskriver hvordan du bilde celledeling innenfor et levende vev ved hjelp av C. elegans embryoer coexpressing to fluorescerende prober (mCherry: PH å skissere plasmamembraner og HAM-1: GFP å merke neuroblast kjerner).
De mest grunnleggende trinnene til bilde levende C. elegans embryoer uttrykker fluorescerende prober er: i) bruke friske, unge voksne hermafroditter uttrykker de ønskede fluorescerende markører (vedlikeholdt ved 20-25 ° C), ii) bruke mutanter eller RNAi å studere genet krav under vev formasjon, iii) samle embryo på riktig scene for mikroskopi (f.eks. mid embryogenesis), og iv) utføre fluorescerende mikroskopi med innstillinger som er optimalisert for å holde fototoksisitet lav, men for å opprettholde høy bildekvalitet.

For å identifisere spesifikke celler og / eller intracellulære rom i en vev av interesse, bruk ormer uttrykke markører merket med fluoriserende proBES. Den Caenorhabditis Genetics Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) tilbyr en rekke stammer som coexpress flere markører. Men kan to stammer (hver uttrykker en enkelt markør av interesse) må krysses og skjermet med et fluorescerende mikroskop over flere generasjoner til å generere en belastning stabilt uttrykker begge sonder. For eksempel, for å utføre denne eksperimentelle protokoll, en stamme som uttrykker en markør for å visualisere cellemembraner (mCherry: PH; OP70) ble krysset med en stamme som uttrykker en markør for å visualisere neuroblast kjerner (HAM-1: GFP; OP102) for å generere en belastning coexpressing begge.

Den beste måten å studere genet krav under embryonal utvikling er å utføre tap av funksjons eksperimenter, der genet produktet er slått ned eller mutert. Dette eksperimentelle protokollen beskriver utfører RNAi mot anillin (ani-1) for å redusere endogene ANI-1 nivåer i alle embryonale vev. Det er ingen godt karakteriserte hypomorphic allelerav ani-en. Derfor er RNAi det beste alternativet for å undersøke ani-en 's tap av funksjon fenotyper og bestemme dens funksjon under embryonal utvikling. Vanligvis er det bedre å bruke mutanter i stedet for RNAi, da effektiviteten av knockdown kan være variabel, og er sjelden null. Et av de vanlige problemer med å mate RNAi-protokoller er forurensning, noe som vil redusere RNAi effektivitet. For å redusere risikoen for forurensning, forberede RNAi plater og mat i aseptiske forhold. Forurensning kan oppdages ved screening noen av platene før bruk, og plater med melke / ugjennomsiktig jakt bakterier skal kastes. Et annet problem som kan redusere RNAi effektivitet er ved å ikke velge hermafroditter på rett utviklingsstadiet. Det er best å bruke L4-iscenesatt eller unge voksne ormer (utviklings vulva ser ut som en hvitaktig sirkel / hull på den ventrale siden av ormen), som har ingen / få befruktede embryoer. Videre RNAi forhold og behandlinger may variere for forskjellige genprodukter. Forskjellige måter å øke eller redusere styrken av RNAi er ved å oppslemme de pelleterte HT115 bakterier i forskjellige mengder LB Amp media (se avsnitt 1.2.2), og ved å endre varigheten av RNAi-behandling (tiden som spiraler er fort RNAi plater, se protokoll 3). For å gi optimale ani-en RNAi fenotyper for denne protokollen, ble bakteriene resuspendert i 500 mL av LB Amp media og ormer ble holdt på RNAi plater for to dager (ani-en RNAi tidligere preget av Maddox et al. 23). Kan også brukes RNAi resistente eller sensitive stammer (f.eks. Rde-1, sid-en, eller RRF-3) for å endre styrken av RNAi. Enda viktigere, kan disse påkjenninger bli kombinert med vevsspesifikk ekspresjon av deres villtype gener for å skape vev følsomme stammer. For eksempel, å gjennomføre neuroblast bestemt RNAi, kunne man bruke sid-en mutant embryoer (RNAi-resistent) uttrykker wt unc-119 promoter (stamme ID på CGC TU3401) 31.

Denne protokollen beskriver hvordan du bilde neuroblast celledeling under midten embryogenese. Det er flere aspekter ved den protokoll som krever nøye vurdering, slik som utviklingsstadiet av embryoene, samle de riktige Z-stabler og optimalisere bildeforhold for å minimere fototoksisitet uten at bildekvaliteten. For å fange tidspoeng på rett utviklingsstadiet (f.eks ventral vedlegg), bør embryo bli filmet fra rygg intercalation (par av rygg epidermal cellene interdigitate og smelter sammen til et enkelt lag av epidermis på dorsal side av embryoet, figur 1A6). På denne tiden, er de neuroblasts raskt dele. Siden iscenesettelse embryoene kan være vanskelig under lavt forstørrelse (f.eks ved hjelp av en dissekere mikroskop), hjelper det å samle mange embryoer av varierende stadier og embryoer påriktig stadium kan velges ved hjelp av høyere forstørrelse.

Neuroblasts er forholdsvis liten og tynn, og er funnet i løpet av midten av embryoet. Det er essensielt for å optimalisere mengden og størrelsen av Z-stabler for å sikre at hele cellen er fanget under delingen. For eksempel vil samle så mange bilder eksponere embryoene mer lys og gjør dem utsatt for fototoksisitet. Men innsamling for få Z-stabler eller bruker tykke Z seksjoner kan gjøre det vanskelig å riktig bilde en hel skillevegg neuroblast celle.
Denne protokollen beskriver bruken av et berørt felt konfokalmikroskop eller widefield system til bilde neuroblast celledeling. Som beskrevet tidligere, er en av de viktigste begrensninger ved hjelp av en Vidvinkel epifluorescent mikroskop er potensialet for fototoksisitet. Mens det er sterkt anbefalt å bruke en roterende disk confocal eller feide feltet confocal for bildebehandling C. elegans embryoer, kan enkelte laboratorier har begrenset tilgang til disse systemene. Dette protocol gir noen forslag for å begrense fototoksisitet ved bruk av Widefield-systemer, som for eksempel å lukke blenderåpning til 30%, senke intensiteten av lys fra kvikksølv pære (eller helst ved hjelp av lysdioder), ved hjelp av en EMCCD kamera, og øke gevinsten eller binning å tillate en nedgang i eksponeringstid. Antallet Z-stabler og tidspunkter også vil være begrenset ved hjelp av en Vidvinkel system. Selv om det ikke ble beskrevet i denne protokollen, er den roterende disk konfokalmikroskop vanligvis brukes for live bildebehandling som det fører til lavere fototoksisitet i forhold til en widefield mikroskop. I likhet med det sveipede felt system, bruker den faststoff-lasere og sprer lyset (selv på en annen måte sammenlignet med det berørte felt). Enten CCD eller EMCCD kameraer kan brukes med roterende disk system, som ofte har flere kamera porter for å tillate dual avbildning. I likhet med den feide feltet mikroskop, kan bilder tatt med eksponeringstider 50-90% lavere vs Widefield system.
Dette protocol kan brukes til å studere funksjonen av forskjellige gener som regulerer mitose under vevsdannelse. Tiden mellom hvert bilde kan bli forkortet (f.eks. Hvert 15-30 sek vs. 2-3 min) å bedre visualisere mitotiske fenotyper. Forskjellige følere kan brukes (f.eks stedet for å bruke HAM-1:. GFP, kan fluorescent-merkede H2B bli brukt til å visualisere DNA, og / eller fluoriserende merkede tubulin kunne brukes til å visualisere mitotiske spindler). Antallet Z-stabler og tykkelse for hver stabel kan også endres (for eksempel flere stabler av en mindre trinnstørrelse). Som beskrevet ovenfor, velge de riktige innstillingene er avgjørende for å begrense fototoksisitet og optimalisere bildekvaliteten. Selv om mCherry: PH og HAM-1: GFP sonder uttrykke på relativt høye nivåer, samle raskere tidspunkter, øke antall Z-stabler eller bildebehandling for lengre perioder av gangen kontra det som er beskrevet i denne protokoll kan ikke være mulig på en widefield system.
En Java-basert imalder behandlingsprogram (ImageJ, NIH) kan brukes til å behandle bilder samlet inn av de forskjellige mikroskoper og bilder kan eksporteres som TIFF. Imidlertid, avhengig av den programvare som benyttes for innsamling, filene kan allerede være forenlig med prosessprogramvare. Det er bedre å åpne originalfilene vs eksporterte bilder (f.eks TIFF), siden metadata holdes med originalfilene. Prosessering programvare kan brukes til å manipulere bilder for å lage figurer eller filmer. I tillegg kvantitative analyser, kan også utføres, slik som måling av pikselintensiteten i utvalgte områder. Optimal programvare bør velges avhengig av analysen, som for eksempel bildebehandling Toolbox (MathWorks, Matlab) eller 3D og 4D Real-Time Interactive Data Visualisering (Imaris, bitplane).
Ved hjelp av denne protokollen, ble ani-en vist seg å være nødvendig for neuroblast cytokinese, selv om det ikke er nødvendig for cytokinese i tidlig embryo. Interessant nok, ved å styre number og plassering av neuroblasts, ani-1-regulere migrasjon av ventral epidermale celler for ventral kabinett, fordi de neuroblasts gi kjemiske eller mekaniske signaler til de overliggende epitelceller. Imidlertid er det ikke kjent om ani-1 er nødvendig for divisjon eller formendring av andre celletyper under midten sen embryogenese. Viser hvordan den totale sammensetningen av en vev påvirker nabo vev understreker viktigheten av vev kommunikasjon under metazoan utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne at dette arbeidet ble støttet av naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC) stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada Inc. #AGR001.1 For making C. elegans NGM and RNAi plates
Agar Bio Basic Inc. #9002-18-0 For making bacteria LB agar plates
Agarose BioShop Canada Inc. #AGA001.500
Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11029
Anti-mouse anti-GFP antibody Roche Applied Science #11814460001
Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11011
Ampicillin BioShop Canada Inc. #AMP201.5 Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C
Bactopetone  (peptone-A) Bio Basic Inc. #G213
CaCl2 (calcium chloride) BioShop Canada Inc. #C302.1
Cholesterol BioShop Canada Inc. #CHL380.25 Dissolve in ethanol
DAPI  Sigma-Aldrich #D9542 Use to stain nucleic acids (DNA)
Glycerol BioShop Canada Inc. #GLY001.1
IPTG (isopropylthio-β-galactoside) Bio Basic Inc. #367-93-1 Store powder and dissolved IPTG at -20 °C
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) BioShop Canada Inc. #PPM666.1
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) BioShop Canada Inc. #PPD303.1
L4440  (feeding vector) Addgene #1654 Keep as glycerol stock at -80 °C
MgSO4   (magnesium sulfate) BioShop Canada Inc. #MAG511.500
NaCl (sodium chloride) Bio Basic Inc. #7647-14-5
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. #7558-79-4
Normal Donkey Serum (NDS) Wisent Bioproducts #035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) Alfa Aesar #A10877
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich #P8920 For optimal results coat microscope slides three times 
Streptomycin BioShop Canada Inc. #STP101.50 Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C
Tetracyclin BioShop Canada Inc. #TET701.10 Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C
Tween-20 Bio Basic Inc. CAS#9005-64-5
Tryptone BioShop Canada Inc. #TRP402.500
Yeast Extract Bio Basic Inc. #8013-01-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  3. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  4. Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
  5. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
  7. Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
  8. Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
  9. Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
  10. Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
  11. Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
  12. Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
  13. Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
  14. Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
  15. Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
  16. Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
  17. Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
  18. Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
  19. Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
  20. Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  21. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  22. Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
  23. Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
  24. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
  25. Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
  26. Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
  27. Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
  28. Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
  29. Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
  30. Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
  31. Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).

Tags

Neuroscience , Morphogenesis cytokinese neuroblasts anillin mikroskopi celledeling
Visualisering neuroblast Cytokinesis Under<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wernike, D., van Oostende, C.,… More

Wernike, D., van Oostende, C., Piekny, A. Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis. J. Vis. Exp. (85), e51188, doi:10.3791/51188 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter