Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Visualisering neuroblast cytokines Under Published: March 12, 2014 doi: 10.3791/51188
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University

Summary

Detta protokoll beskriver hur bilden delande celler i en vävnad i Caenorhabditis elegans embryon. Medan flera protokoll beskriver hur bild celldelning i det tidiga embryot, beskriver detta protokoll hur bild celldelning i ett utvecklings vävnad under mitten sen embryogenes.

Abstract

Detta protokoll beskriver användningen av fluorescensmikroskopi bilden delande celler inom utveckla Caenorhabditis elegans embryon. Framför allt fokuserar detta protokoll på hur bilden dela neuroblaster, som finns under de epidermala cellerna och kan vara viktiga för epidermal morfogenes. Vävnadsbildning är avgörande för metazoan utveckling och förlitar sig på yttre signaler från angränsande vävnader. C. elegans är en utmärkt modellorganism för att studera vävnadsmorfogenes in vivo på grund av sin öppenhet och enkel organisation, vilket gör dess vävnader lätt att studera via mikroskopi. Ventral kapsling är den process där den ventrala ytan av embryot är täckt av ett enda skikt av epitelceller. Denna händelse är tänkt att underlättas av de underliggande neuroblaster som ger kemisk vägledning ledtrådar för att medla migrering av de överliggande epitelceller. Men de neuroblaster är mycket proliferativ och även kan handlasom ett mekaniskt substrat för de ventrala epidermala celler. Studier med denna experimentella protokoll kunde avslöja vikten av intercellulära kommunikationen under vävnadsbildning, och kan användas för att avslöja rollerna av gener som är involverade i celldelning i utvecklings vävnader.

Introduction

Även om det finns protokoll som beskriver hur bild celldelning i början C. elegans embryo, beskriver detta protokoll hur bild celldelning i en vävnad under mitten av embryogenes. En av de stora utmaningarna i att avbilda organismer under utveckling har varit deras känslighet för fototoxicitet. Däremot har ökad tillgänglighet till spinning disk konfokala mikroskop eller svepte fältet mikroskop tillåts mer omfattande bildprogram. Båda systemen använder fasta tillståndets lasrar och spritt ljus, begränsa nivån av UV att organismerna är utsatta för. Däremot kan Widefield står fortfarande användas för avbildning in vivo, särskilt om de är utrustade med kameror med hög känslighet (t.ex. EMCCD), bländarkontroll och ljusstyrning (t.ex. lysdioder eller justerbara kvicksilverlampor). Detta protokoll beskriver hur man använder antingen ett konfokala baserat system eller ett widefield-system för bild celldelning inom utvecklings C. elegans </ Em> embryon. Som ett exempel, beskriver vi hur bildneuroblast celldelning. Neuroblaster kan underlätta epidermal morfogenes genom kemiska eller mekaniska signaler till den överliggande hudceller och ger ett utmärkt exempel på vikten av intercellulära kommunikationen i bildandet av vävnader.

Caenorhabditis elegans är en idealisk modell organism för mikroskopi baserade studier på grund av dess öppenhet och enkla vävnad organisation 1. Vidare C. elegans är mottaglig för genetiska metoder och RNAi, och eftersom många av dess gener har humana homologer, kan den användas för att identifiera bevarade mekanismerna för vävnadsbildning 2-5. I C. elegans, bildning av epidermis inträffar under mitten av embryogenes, när embryot har> 300 celler. Epidermal morfogenes består av flera stora faser, då embryot är inneslutna i ett lager av hudceller som sammandra och sträcker sig för att förvandla embryo från en äggformad form till avlång form av en mask 6. Ventral kapsling beskriver en av dessa morfogenetiska händelser, när de ventrala epidermala celler migrerar mot den ventrala mittlinjen för att täcka den ventrala ytan av embryot (Figur 1). Först två par främre belägen framkant celler migrerar mot den ventrala mittlinjen, där de fastnar och säkring med sina kontra grannar 6. Detta följs av migration av de bakre belägen ficka celler, vilka bildar killiknande former skapar en ventral ficka 6-7. Den mekanism som stänger fickan är inte väl förstådd. En möjlighet är att en supracellular aktin-myosin kontraktila struktur slipsar fick cellerna tillsammans i en handväska sträng liknande sätt, liknande sårläknings 8. Intressant är migration av vissa av de fick celler medieras av specifika underuppsättningar av underliggande neuroblaster 9 (neuronala prekursorer som finns på undersidan av epidermis; Figur 1B).

Tidigare studier visade att neuroblaster reglerar ventrala epidermal cell migration och ventrala kapsling. VAB-1 (ephrin receptor) och VAB-2 (ephrin ligand) är starkt uttryck i neuroblaster och underlätta sorteringen av främre och bakre neuroblaster från varandra, och mutationer i VAB-1 eller VAB-2 orsakar ventral kapsling fenotyper 10-13. Dock visade promotor räddningsförsök att VAB-1 också krävs i de överliggande ventrala epidermala celler och receptorer för andra vägledande ledtrådar som utsöndras av neuroblaster uttrycks i de ventrala epidermala cellerna 9. Även mutationer i någon av dessa receptorer orsakar ventrala kapslings fenotyper, är det oklart om fel uppstår på grund av problem i neuroblast positionering eller på grund av fel på den ventrala epidermala celler att svara på vägledning ledtrådar 14. Ändring av fördelningen av neuroblaster wiDC-layout påverkar deras förmåga att utsöndra vägledning ledtrådar kunde belysa rollen av neuroblaster och deras förmåga att ge mekanisk ingång under epidermal morfogenes. Nyligen visade det sig att en celldelning genen ani-1 (anillin) uttrycks starkt i neuroblaster (Figur 2A) och dess uttömning orsakar neuroblast division defekter. Intressant, dessa embryon visar ventrala kapslings fenotyper (Fotopoulos, Wernike och Piękny, opublicerade observationer).

Anillin behövs för celldelning, och särskilt för cytokines, som beskriver den process där en mor cell delar fysiskt in i två dotterceller. Cytokines drives av bildningen av en aktomyosin kontraktila ringen, som måste kontrolleras noggrant i tid och rum för att säkerställa att den är rätt kopplad med systerkromatidseparation segregation. Det stora regulator av metazoan cytokines är RhoA (RHO-1 i C. elegans), ett litet GTPas, som är enctive i dess GTP-bunden form. Den GEF Ect2/ECT-2 aktiverar RhoA, varefter RhoA-GTP interagerar med nedströms effektorer som bildar den kontraktila ringen och förmedlar dess inträngning 15. Anillin är ett multidomänprotein som binder till RhoA via sin C-terminal och till aktin och myosin via dess N-terminal. Anillin krävs för att stabilisera läget för den kontraktila ringen i däggdjurs-eller Drosophila S2-celler 16. Anillin utarmning orsakar kontraktila ringar att genomgå sido svängningar, och cytokines småningom misslyckas bildar multinucleate celler 17-19. Intressant, även C. elegans ani-1 koordinater aktomyosin kontraktilitet i det tidiga embryot, det inte är väsentligt för cytokines. Emellertid, såsom beskrivs ovan, krävs för ani-1 för neuroblast cytokines under mitten av embryogenes (Fotopoulos, Wernike och Piękny, opublicerade observationer). Cytokines misslyckande skulle ändra antal och placering av neuroblaster och kan påverka location av kemiska vägledning ledtrådar, eller det kan förändra de mekaniska egenskaperna hos vävnaden. Båda modellerna belysa nonautonomous roll neuroblaster för ventrala kapsling, samt vikten av vävnad-vävnads kommunikation under fosterutvecklingen.

Denna experimentella protokoll beskriver hur bild celldelning under C. elegans mitten embryogenes med hjälp av fluorescensmikroskopi. Majoriteten av experiment som studerar mekanismerna för celldelning utfördes i enstaka celler i odlingsskålar (t. ex. HeLa eller S2-celler) eller i tidiga embryon med ett begränsat antal celler (t.ex. C. elegans en-cell embryo, Xenopus, eller echinoderm embryon). Det är emellertid viktigt att också studera celldelning inom vävnader, eftersom det finns yttre signaler som kan påverka timing och placeringen av delningsplanet. Dessutom kan celler ger kemiska eller mekaniska signaler för att påverka utvecklingen av intilliggande vävnads, och det är viktigt att förstå hur intercellulär kommunikation hjälper vävnader bildas under utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av plattorna för att upprätthålla Worm Stammar och Performing RNAi

  1. Nematoder tillväxtmedier Plates
    1. Plattor
      1. Förbered Nematoder Growth Media (NGM) plattor för att hålla masken stammar och utföra genetiska korsningar. Kombinera 3 g NaCl, 17 g agar och 2,5 g baktopepton med 1 L av destillerat vatten i en 2-liters kolv och tillsätt en metall omrörarstav.
      2. Autoklavera i kolven för att lösa upp agar och att sterilisera mediet. Placera sedan kolven på en omrörningsplatta och låter mediet svalna under omrörning.
      3. När media har svalnat och är fortfarande något varmt att röra (45-50 ° C), tillsätt 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml 5 mg / ml kolesterol-lösning och 25 ml 1 M kaliumfosfatbuffert (PPB, recept i tabell av reagens / material, filter sterilisera stamlösningar) och omedelbart häll media i små petriskålar (60 mm x 15 mm, fyller disken ~ 3/4 till toppen eller 13 ml / platta USIng en automatisk dispenser). Anm: För långsiktig underhåll av vissa stammar tetracyklin kan tillsättas till plattorna (12,5 ng / ml) för att tillåta Tn10 transposon inaktivering av det bakteriella RNas Ill-genen.
      4. Låt media stelna över natten i rumstemperatur. OBS: Plattor bör hållas i ett biologiskt huva eller i ett område av labbet som är mindre benägna att föroreningar. Dessutom, ta bort eventuell kondens som har byggts upp på locken (t.ex. ren med mjukpapper) för att begränsa svampkontamination. Om Tetracyklin är också till plattorna, täck dem med aluminiumfolie eftersom detta antibiotikum är ljuskänsligt.
      5. Nästa dag, frö de torra NGM plattor med en suspension av E. coli (OP50 stammen, se avsnitt 1.1.2) som har varsamt virvlas. För att göra plattor för parning, tillsätt ~ 50 | il av OP50 till centrum av varje platta (för att bilda en liten cirkel). För att göra plattor för att upprätthålla masken stammar, utsäde varje NGM tallrik med ~ 100-200 l av OP50 (tillsäkerställa att det täcker ett större område av plattan).
      6. Låt de ympade plattorna torr O / N vid rumstemperatur.
      7. Nästa dag, vänder de torkade NGM plattor upp och ner och stapla dem i plastbehållare för lagring vid 4 ° C. OBS: Plattorna är användbara upp till ca 3-4 veckor. Plattor innehållande tetracyklin bör förvaras i mörker.
    2. Mat
      1. Använd E. coli OP50 [från Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http://www.cbs.umn.edu/cgc)] som en näringskälla för C. . elegans OBS: OP50 kan lagras som glycerol lager vid -80 ° C (1:1 i 50% v / v glycerol).
      2. För att göra OP50 för NGM plattor, gör en strimma platta med användning av en liten alikvot av glycerolen lager (<10 pl; använda en steril pipettspets). Sprid bakterierna på en LB-agarplatta (recept i tabell av reagens / material) och lämna den vid 37 ° C ~ 16 timmar. OBS: Om det finns problem med föroreningar, kan streptomycin resistent OP50 användas, ennd streptomycin kan tillsättas till de LB-agarplattor (50 | ig / ml).
      3. Nästa dag, plocka en enda koloni och inokulera 100 ml flytande LB-medium (recept i tabell av reagens / material) i en 500 ml kolv.
      4. Låt kulturen växa O / N vid 37 ° C med skakning.
      5. Nästa dag, använd bakteriesuspensionen för sådd NGM plattor. Anm: OP50 kan alikvoteras i 50 ml koniska rör och lagrades vid 4 ° C under ~ 4-6 veckor.
  2. RNAi
    Utfodring är en av de viktigaste sätten att utföra RNA medierad interferens (RNAi, att knockdown en specifik gen produkt) i C. elegans. C. elegans hermafroditer kan matas E. coli stam HT115 transformeras med en matningsvektor, som uttrycker dsRNA vid induktion. Denna dsRNA (eller dess fragment) överförs till gonad, oftast resulterar i betydande knockdown av den specifika genen målet.
    1. RNAi Plates
      1. Förbered NGM plattor som beskrivits ovan (se avsnitt 1.1.1), men också tillsätt 1 ml 1 M IPTG (isopropyltio-beta-D-galaktosid, för att inducera uttryck av dsRNA) och 500 l av 50 mg / ml ampicillin (Amp, vektor uttrycker dsRNA är Amp resistenta) till den varma medier (45-50 ° C).
      2. När plattorna har torkat, utsäde dem med ~ 50-100 pl E. coli HT115 (se avsnitt 1.2.2). Anm: oympade plattorna kan förvaras vid 4 ° C under ~ 4-5 veckor.
      3. Låt de ympade plattorna torka över natten vid rumstemperatur.
      4. Nästa dag, vänder de torkade RNAi plattorna upp och ned och lagra dem i en plastförvaringsbehållare vid 15-20 ° C. Obs: ympade plattorna behåller RNAi effektivitet för upp till ~ 2-3 veckor.
    2. RNAi Mat
      1. Använd E. coli HT115 (från CGC, se avsnitt 1.1.2) omvandlas med utfodring vektor L4440 eller L4440 innehållande cDNA till en gen av intresse. OBS: Feeding bibliotek som riktar merparten av öppna läsramar i genomethar redan gjorts och finns tillgängliga (kloner i L4440 omvandlas till HT115, t.ex. sådana som innehåller ett fragment från Y49E10.19 för ani -1 20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / sidor / rnai.html). Anm: HT115 kan hållas som glycerolstamlösningar vid -80 ° C (förhållande 1:01 i 50% vol / vol glycerol).
      2. För att generera en ny konstruktion riktar en gen av intresse, se L4440 vektorkarta och klon cDNA mellan de flankerande T7-promotorer, som induceras av IPTG.
      3. Trans HT115 med L4440-konstruktion med hjälp av ett standardprotokoll för transformation (t.ex. göra kemiskt kompetenta bakterier och utför värmechock omvandling).
      4. Såsom beskrevs för OP50 (se avsnitt 1.1.2), bör spalt bakterier från glycerol lager på en LB-agarplatta, men plattan också innehålla 50 ug / ml ampicillin. OBS: Om du använder en redan befintlig L4440 konstruktion, hoppa över avsnitten 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Välj en enda koloni och ympa 5 mlLB medium innehållande 5 ^ ampicillin från en 50 mg / ml lager (LB Amp) och placera den vid 37 ° C med skakning.
      6. Efter ~ 16 h, ympa 5 ml färskt LB-Amp-medium med 50 | il av O / N-kulturen och odla kulturen till 7-8 h med skakning vid 37 ° C.
      7. Centrifugera bakterierna i 1 min vid 4000-8000 xg, kassera supernatanten och suspendera pelleten i 500 l av färska LB Amp media.
      8. Använd denna bakterielösning till utsäde av RNAi plattor som beskrivs ovan (se avsnitt 1.2.1). OBS: HT115 ska användas omedelbart och ska inte lagras.

2. Odla Snäck Stammar

Bibehåll C. elegans stammar som beställs från CGC på NGM plattor enligt standardprotokoll 1. Stammar som används för detta protokoll är: C. elegans var Bristol, vild-typ (stam-ID på CGC N2), UNC-119 (tm4063); wgIs102 [ham-1 UNC-119 (+)] (stam-ID på CGC OP102), UNC-119 (ED3); ltIs44pAA173 [paj-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (stam-ID på CGC OD70), AJM-1 (ok160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (stam-ID på CGC SU159), UNC-119 (ED3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: HMR-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR + UNC-119 (+)] (stam-ID på CGC FT250).

  1. Plocka ~ 3 unga vuxna hermafroditer som visar rätt fenotyp till en fräsch NGM tallrik. Anmärkning: N2 (var. Bristol, vild-typ) kan bibehållas mellan 15-25 ° C, men de kommer att nå densitet snabbare vid högre temperaturer. Nya bestånd bör göras när masken tätheten är hög.
  2. Förvara alla fluorescerande stammar (t.ex. GFP och / eller mCherry-uttryck maskar) vid 20-25 ° C för optimal expression av fluorescerande proteiner. Nya bestånd bör göras när masken tätheten är hög och maten är låg.
  3. Att plocka maskar, använd enplocka tillverkad av en drog glas pipett med en platinatråd smält vid drog änden (~ 3-5 cm i längd). Platta till kabeln med en slät kant. Använd pick till "scoop" upp hermafroditer och överföra dem till nya plattor. Flamma tråden i mellan användning för att undvika korskontaminering av stammarna.

3. RNAi

  1. Performing RNAi
    1. Först till plats ~ 8 L4 hermafroditer på en unseeded NGM platta för ~ 30-60 min bort OP50 bakterier från maskar.
    2. Placera sedan 8 hermafroditer på en NGM Amp IPTG platta ympades med HT115 som bär L4440 plasmid som uttrycker dsRNA till en gen av intresse (t ex ani-1,. Se 1,2) under ~ 24 timmar. Anm: Beroende på genen av intresse, eller de önskade fenotyper (vilket kan bero på styrkan i knockdown), kan maskar lämnas på RNAi plattor för kortare eller längre perioder (efter 24 tim, placera hermafroditer på färsk RNAi plattor).
    3. För en negtiva kontroll, placera maskar på en RNAi tallrik ympats med HT115 bär den tomma L4440 vektor. Anm: Dessa embryon bör inte ha några fenotyper.
    4. För en positiv kontroll, placera maskar på en RNAi platta uttrycka dsRNA som mål en gen med väl karakteriserade fenotyper. Obs! Rho-1 (Y51H4A.3), embryon är 100% dödlig efter 24 timmar och hermafroditer är sterila efter 48 timmar.
  2. RNAi Efficacy
    Nivåerna av knockdown av RNAi ska testas, i synnerhet som vissa vävnader kan vara mer motståndskraftiga än andra. Under tidig mitten embryogenes, de flesta vävnader är RNAi-känsliga, men i slutet av embryo eller larv, nervceller är RNAi-resistenta. Olika stammar kan användas för att förbättra RNAi känslighet (t.ex. RRF-3), eller för att generera vävnadsspecifik RNAi (t.ex. sid-1 i kombination med en transgen som uttrycks av neurala promotor unc-119).
    1. Western Blotting
      Immunoblotting använda C. elegans proteiner kan varautförs i enlighet med standardprotokoll 22.
      1. Efter utförande av RNAi, samla ~ 10 gravid (fylld med embryon) hermafroditer i ett mikrocentrifugrör, tillsätt 20 till 30 ^ il 1 x SDS-PAGE-provbuffert och lyseras genom kokning under ~ 2 min. På samma sätt samlar N2 maskar i ett separat rör för kontrollprovet. Anm: Antalet hermafroditer kan variera beroende på hur känsliga de primära antikropparna.
      2. Skapa utspädningar av kontrollprovet (t ex 3-100%) i provbuffert. Fyll på kontroll och RNAi prover och kör genom SDS-PAGE enligt standardprotokoll (den% gel kommer att variera beroende på storleken av proteinet av intresse).
      3. Överför gelen till ett membran och utför immunoblotting enligt standardprotokoll. Anm: Använd olika primära och sekundära spädantikropps som rekommenderas för varje antikropp.
      4. Utveckla (t.ex. om du använder kemiluminescens) eller scanna (t.ex. om du använder fluorescens) immunobloten och jämföra the densitet av band i N2 körfält vs RNAi körfält, och bestämma nivån av knockdown (t.ex. densiteten för RNAi lane matchar kontrollbanan 12%, tyder detta på att proteinet är reducerad med 88%). OBS: För att se effektiviteten i ANI-1 knockdown, se Maddox et al 23.
    2. Immunfärgning
      Immunfärgning i C. elegans kan utföras i enlighet med standardprotokoll 22.
      1. Efter att ha utfört RNAi, samla gravida hermafroditer och skörd embryon genom att använda en av två metoder. För en av de metoder, placera hermafroditer i M9 buffert (recept i tabell av reagens / material) i 1,5 ml silikoniserade mikrocentrifugrör och pellets via centrifugering (1,000-4,000 xg). OBS: På samma sätt samlar N2 gravida hermafroditer.
      2. Ta bort M9 lösningen.
      3. Spruta embryon genom tillsats 1 ml av blekningslösning (1 M NaOH, 5% blekmedel) till mikrocentrifugrör under 3 min. Likaså blekmedel N2 hanrmaphrodites att göra kontrollglas.
      4. Vortex försiktigt, sedan omedelbart pellets embryon genom centrifugering (4000-8000 xg) och ta bort blekningslösningen. Anm: Den totala tid som maskarna inkuberas med blekmedel bör inte överstiga 5 minuter.
      5. Tvätta embryona 3x med Tris-buffrad saltlösning (TBS, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl) och överföra embryon med hjälp av ett glas pasteurpipett på en poly-L-lysin-belagda objektglas. OBS: För att belägga en glasobjektsglas med poly-L-lysin, torka först bilden, sedan lägga en droppe (~ 20-30 l) av poly-L-lysin och sprida det jämnt över ytan och låt torka. För bästa resultat, belägga glider ytterligare två gånger. En alternativ metod för att samla in embryon (avsnitten 3.2.2.1-3.2.2.5) är att placera en droppe M9 på en poly-L-lysin-belagda objektglas och plocka ~ 10 gravida hermafroditer i droppen.
      6. Lägg ett täckglas ovanpå varje mikroskopobjektglas (för att det område som innehåller de flesta av de embryon) och placerabilderna i flytande kväve. Obs! Hermafroditer placeras direkt i drop, sätta press på täckglas för att bryta upp hermafroditer och utvisa embryon.
      7. Fryst knäcka embryon genom att snärta bort täckglasen direkt efter att frysa dem i flytande kväve.
      8. Placera glasen i iskall metanol i 20 min för att fixa embryona. OBS: För vissa antigener, kan en tvärbindande fixativ såsom paraformaldehyd vara att föredra. Se protokollet från Duerr 22.
      9. Rehydrera och permeabilisera embryon genom att tvätta objektglasen 4x med Tris-buffrad saltlösning innehållande Tween-20 (TBST, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) under 10 min vardera.
      10. Torka varje bild runt området som innehåller de flesta av embryon och rita en cirkel runt embryon med hjälp av en vätska blockering penna (t.ex. PAP penna).
      11. Lägg till ~ 100 l av TBST med 5% normal åsna serum (NDS, block) till varje bild (inringat område) och inkubera20 min vid rumstemperatur. Anm: Placera glasen i en "våt kammare" (t.ex. en skål med lock som innehåller våta pappershanddukar).
      12. Avlägsna det block, tillsätt ~ 50 till 100 | il av primära antikroppar (utspädd i TBST) till varje objektglas (inringat område) och inkubera i 2 h vid RT. Obs: Beroende på antikroppen, kan utspädningen och inkubationstiden varierar. För att detektera GFP, använder vi en anti-mus-anti-GFP-primär antikropp i en 1/200 utspädning. För att upptäcka ANI-1, använder vi en anti-kanin anti-ANI-1 primär antikropp i en 1/1600 utspädning (vänligen tillhandahållen av Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). Vid längre inkubationstider, placera objektglasen vid 4 ° C.
      13. Ta primära antikroppar (om möjligt, hålla för framtida bruk) och tvätta glider 3x med TBS i 5 minuter vardera.
      14. Ta bort den sista tvättningen och tillsätt ~ 50 till 100 | il av sekundära antikroppar (utspädd i TBST) till varje objektglas (inringat område) och inkubera i 2 h vid RT. Anm: Beroende på antikroppen, kan späd variera. För att upptäcka GFP, använder vi en anti-mouse Alexa Fluor 488 sekundär antikropp i en 1/250 utspädning. För att upptäcka ANI-1, använder vi en anti-kanin Alexa Fluor 568 sekundär antikropp i en 1/250 utspädning.
      15. Remove sekundära antikroppar och tvätta slides 3x med TBS under 5 min vardera. OBS: För att färga DNA, till ~ 50-100 pl DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenylindol, 1 mg / ml) vid 1/500 utspädning i TBST i 5 min.
      16. Ta DAPI och tvätta objektglas 2x med TBS i 5 minuter vardera. OBS: Om DAPI färgning inte utförs, hoppa över detta extra tvättsteg.
      17. Utför en snabb tvätt med 0,1 M Tris (pH 9), ta bort och lägga till ~ 15 | il av monteringsmedel förvärmdes till 37 ° C (4% n-propyl-3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate), 50 mM Tris, pH 9 i 50% glycerol) till varje bild (inringat område).
      18. Lägg ett täckglas till varje bild (ovanpå monteringsmedia i det inringade området), veke bort överflödig vätska och täta bilderna med nagellack. OBS: Diabilder kan lagras vid -20 ° C.
      19. Observera embryon påbilderna med hjälp av en widefield fluorescerande mikroskop eller laserskanning konfokalmikroskop. Viktigt justera inställningarna för att samla bilder av optimal pixelintensiteten med hjälp av kontroll (N2 eller icke-RNAi) embryon. Sedan samla bilder RNAi embryon med samma inställningar. Exempel på bilder som samlats in för styrning kontra ani-1 RNAi embryon visas i figur 2B.

4. Beredning av diabilder för Live avbildning och Skörd embryon

  1. Beredning av agaros kuddar för live-avbildning
    1. Placera en ren, pre värmde objektglas mellan två andra bilder, var och en med 1-2 remsor av tejp på dem.
    2. Med användning av en glas pasteurpipett, tillsätt en droppe av 2% vikt / volym agaros (upplöst i uppvärmt destillerat vatten) till bilden.
    3. Placera snabbt ett andra, rent objektglas ovanpå den första bilden i ett vinkelrätt sätt att platta agarosen droppe. Notera: Bandet på grann gledes ger tjockleken på dynan.
    4. Låt agarosen pad torka i en 1-2 minuter innan du tar bort den översta bilden. Skjut av den övre sliden försiktigt för att undvika att bryta under agaros pad. Notera: Ibland dynan överförs till den översta bilden och fortfarande är användbart, så länge som den förblir intakt.
    5. Överför embryon på agarosen pad inom några minuter efter dess beredning som beskrivs nedan (se steg 4.2). OBS: Dynan bör ha en ogenomskinlig utseende, när det är klart, är det för torrt att använda.
  2. Skörd embryon
    1. Använd följande protokoll för insamling av embryon för live-avbildning, som härrör från Sulston et al. 24
    2. Plocka ca 4-6 gravida vuxna (ej utsvultna) från NGM eller RNAi tallrikar och placera dem i 20-30 pl av M9 buffert i en brunn på en depression bild.
    3. Använd en steriliserad skalpell för att skära maskarna på vardera sidan av den spermatheca (eller alternativt nära vulva) tillsläpper embryon i lösningen.
    4. Använd en gummislang med ett munstycke som är ansluten till ett glas kapillär / pipett drog för att ha ett litet hål och sug embryon genom munnen pipettering. Alternativt samla embryon med ett kapillärt glasrör som är ansluten till en pasteurpipett gummi glödlampa.
    5. Överför suctioned embryon till en andra och även innehåller M9 buffert, för att skilja dem från masken skräp.
    6. Därefter, sug embryon på en nygjord agaros pad (se steg 4.1).
    7. Klump embryon tillsammans med användning av en ögonfrans (limmas till en tandpetare) för att öka antalet embryon som kan filmas i ett x, y-planet. OBS: För att undvika syrebrist, inte klumpar mer än 10 embryon tillsammans.
    8. Därefter täcker bilden med ett täckglas och delvis försegla den med pre uppvärmd flytande valap (vaselin, lanolin och paraffin, smält och kombinerad 01:01:01) för att förhindra uttorkning av embryona under avbildning. Obs: Ytterligare M9 buffert can läggas till dynan för att säkerställa att embryon som har en tillräcklig mängd vätska för avbildning. I stället för valap kan vaselin användas för att delvis täta täckglas, men det är mindre stel orsakar täckglas för att halka och kunde få ut de mikroskop mål.

5. Live avbildning

  1. Att visualisera neuroblaster, skaffa en mask stam som uttrycker en neuroblast-specifikt protein fäst vid ett fluorescerande protein (t.ex. HAM-1: GFP, stam-ID på CGC OP102). För att upptäcka cellmembran, använd en mask stam som också uttrycker en proteindomän som erkänner lipider knutna till en annan fluorescerande protein (t.ex. mCherry:. PH, stam-ID på CGC OD70).
  2. Harvest embryon från fluorescerande hermafroditer hålls på kontroll eller ani-1 RNAi plattor (se protokoll 3 och 4), och förbereda diabilder som beskrivs ovan (se protokoll nr 4).
  3. Bild embryon i 4D (x, y, z och tidsförlopp) av epifluorescensmikroskopi. Använd antingen en widefield systemet [automatiserad fluorescerande mikroskop med filter för GFP och TexasRed, mål upp till 60X eller 100X, en högupplöst CCD (Charge Coupled Device) kameran, mycket motoriserade stadium (t.ex.. Piezo Z) och specialiserad förvärv programvara] eller en livescan svepte fält konfokalmikroskop [automatiserad fluorescerande scanning mikroskop med 488 nm och 561 nm lasrar, mål upp till 100X, en EMCCD (elektron multiplicera CCD) kamera, mycket motoriserade stadium (t.ex. Piezo Z) och specialiserad förvärv programvara]. OBS: För widefield systemet, kommer att använda lysdioder och en EMCCD kamera begränsa fototoxicitet. Dessutom kan en snurrande skiva konfokalmikroskop användas i stället för den svepte fältsystemet.
  4. Till bildneuroblast celldelning på endera systemet, finna x, y ramar av embryon med hjälp av 10X eller 20X mål och välja en optimal x, y ram där embryona genomgår rygg inter (steg före ventrala kapsling, Figur 1A) eller är i tidiga skedenav ventral inneslutning (~ 350 min efter den första celldelningen, fig. 1 A).
  5. På den svepte fältet mikroskop, använder 488 nm och 561 nm 100 mW laser vid 40% effekt med en skåra på 50. På widefield-systemet använder du GFP och TexasRed filter med låg-medelhög ljusintensitet (om kontrollerbar). OBS: För widefield systemet, LED har låg fototoxicitet och är att föredra.
  6. På vardera systemet, använd 60X eller 100X oljedopp mål och samla in 20 Z-stackar av 0,2 pm varje 2 min för totalt 10 min. OBS: Även om HAM-1: GFP och mCherry: PH sonder uttrycker på relativt höga nivåer, kommer exponeringstider för varje sond måste optimeras för olika mikroskop. OBS: För widefield systemet är färre Z-stackar rekommenderas att begränsa fototoxicitet och för avbildning över längre tidsperioder, använda färre tidpunkter.
  7. För att minimera fototoxicitet orsakad av exponering av embryon för UV-ljus på widefield-systemet (om du använder en Mercury glödlampa), stänger bländaren till 30% och minska ljusstyrkan (med hjälp av en justerbar belysningssystem). OBS: Även om inte behövs förstärkning med antingen systemet, kan andra mikroskop har ljuskällor med lägre intensitet eller mål med olika bländare, vilket kan kräva användning av vinsten för att få bilder av optimal pixelintensitet. Testa villkor med hjälp av en kontroll embryo för att se till att eventuella observerade fenotyper inte beror på artifactual fototoxicitet.

6. Analys av mikroskopi Data

  1. Att analysera bilder, exportera filer som TIFF och öppna TIFF som en stapel med hjälp av specialiserad programvara som en Java-baserad bildbehandlingsprogram (t.ex. ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Anmärkning: Beroende på förvärvs programvara som används för att samla in bilder, kan filerna bevaras i sin ursprungliga form och öppnas i ImageJ. Detta är att föredra eftersom de metadata hålls med filerna.
  2. Separera den stapelin "bilder" och välj tidpunkter och Z-plan som önskas. OBS: Även om en bunt med 20 Z-plan tas många av de neuroblaster är <1 mikrometer tjockt under mitten sen embryogenes och bara ett fåtal Z-plan behövs.
  3. Bunta utvalda Z-plan för varje tidpunkt och göra separata Z-stack prognoser. Sedan stack de prognoser för varje tidpunkt tillsammans för att göra en tidssekvens.
  4. Gör justeringar av ljusstyrka / och eller kontrasten för varje kanal.
  5. Välj sedan en region av intresse, beskära (och vrid om det behövs) i regionen.
  6. Skapa kopplade bilder med hjälp av de "fusione kanalernas funktion och välja en annan färg för varje kanal. Konvertera kopplade bilder till RGB.
  7. Vänd gråskalebilder för varje kanal från steg 6.3 eller 6.4 (användning "invertera" funktionen under "redigera") för att visualisera bilderna tydligare.
  8. Spara alla slut bilder som 8-bitars TIFF-bilder för att göra figurer i vektorbaserade prog.uppdär program eller som Quicktime-filer för att göra filmer.
  9. Om det behövs mätningar av pixelstorleken (t.ex. för att inkludera en skala bar med bilderna), använd ImageJ, eller annat bildbehandlingsprogram för att mäta storleken på embryot. OBS: Bilder som samlats med hjälp av olika mål kommer att ha olika storlekar pixel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna experimentella protokoll beskriver hur bild celldelning i C. elegans embryon under mitten av embryogenes. I avtalet beskrivs särskilt hur bildneuroblaster, som kan underlätta epidermal morfogenes. Epidermal morfogenes uppstår på grund av en kombination av epidermal cellformförändringar, migration och adhesion, men också beroende av kemiska eller mekaniska signaler från de underliggande neuroblaster (Figur 1B). De neuroblaster utsöndrar vägledning ledtrådar som tas emot av receptorer på ytan av ventrala epidermala celler, som reglerar deras migrations 10,14,25. Dessutom neuroblaster är mycket proliferativ, som kan ge mekaniska krafter som bidrar till migreringen av ventrala epidermalceller 26. Detta protokoll kan användas för att studera neuroblast celldelning under mitten av embryogenes. Först, embryon samuttrycker markörer för att visualisera neuroblaster (HAM-1: GFP) som genomgår cytokines: är (mCherry PH) genererade. HAM-1: GFP uttrycker GFP (grönt fluorescerande protein) märkt protein som lokaliseras till neuroblast kärnorna 27, och är nödvändigt för att använda eftersom det finns många andra celltyper som förekommer under mitten embryogenesen (> 300 celler, fig 3). Detta fungerar också som en bra markör för delande celler, eftersom DNA kondenseras till kromosomer under mitos. mCherry: PH är en mCherry-märkt fluorescerande protein som uttrycks av en maternal promotor (paj-1) och innehåller lipiden bindande domänen från PLC1 ∂ en 28, som lokaliserar till cellmembran. Behövs för detta protein för att visualisera cytokines, när membranet och cytosolen nypa in för att separera modercellen i två dotterceller, Figur 3, Video 1). Även om detta protokoll beskriver hur man avbildar neuroblast division, (visat av HAM-1: GFP-uttryck), kan andra markörer användas för att visualisera andra celltyper.

Att visualisera dela neuroblaster, embryon coexpressing HAM-1: GFP och mCherry: PH avbildas varje 2 min (för totalt 10 min). Varje neuroblast är bara ~ 1-4 mikrometer i diameter, och är <1 mikrometer tjockt, och det är bäst att använda ett objektiv med hög förstoring (t ex. 100X). Dessutom, många Z-stackar (~ 20) samlas in med ett litet steg storlek (0,2 nm) för att säkerställa att de olika vinklar av varje cell (klotformig) avbildas. För att samla så här många bilder utan att kompromissa tidpunkter, är en mycket motoriserad skede (t.ex. Piezo Z Stage) rekommenderas. Efter insamling av en serie bilder, analyseras de för att finna celler inom några Z-stackar som delar sig, det DNA kondenseras, membranet ingressed och de nya dotterceller bildar (tidpunkterna för den projicerade stapeln av sammanslagna kanaler är visas i fig 3A, och valda staplar av sammanslagna kanaler visas i figur 3B; Video 1). För att bättre visualisera cellerna, rekommenderas det atthålla varje kanal i gråskala och invertera bilderna (t.ex. Figur 4).

Bildupplösningen är olika för widefield-systemet med hjälp av en högupplöst CCD-kamera (1344 x 1024 pixlar) vs. den svepta fältsystem med användning av en höghastighets EMCCD kamera med hög känslighet (~ 35 bilder / sek och 512 x 512 bildpunkter). Omvända bilder för att dela neuroblaster från kontroll embryon tagna med båda systemen presenteras för jämförelse (Figur 4 vs. 5). Som visas i figur 4A (widefield system, Video 2), bilderna är tydligare vs figur 5A. (Svepte fältsystem, Video 4). Men när man använder den widefield system embryon är mottagliga för fototoxicitet och snabbare tidpunkter är inte möjligt med den kamera med hög upplösning. Till exempel, för att undersöka förändringar i lokaliseringen av olika proteiner (t ex. To studera förändringar i deras dynamik), kanske tidpunkter måste samlas oftare. Dessutom kan det inte vara möjligt att på bilden för en längre tid utan att minska antalet Z-stackar och tidpunkter. Med användning av en EMCCD kamera på widefield systemet kan tillåta ett större antal bildtillämpningar. Kameror som har både hög upplösning och hög hastighet har utvecklats, men förarna är kanske inte tillgänglig beroende på förvärvet programvara som används, och de fortfarande inte kan vara så känsliga som EMCCD kameror. Ett annat system som ofta används för avbildning C. elegans är i spinnskivan konfokala, som också har lägre fototoxicitet och kan utrustas med antingen EMCCD eller CCD-kameror (se Diskussion).

För att studera gener som krävs för celldelning, är hermafroditer behandlas med RNAi mot en gen av intresse (t.ex. ani-1, se avsnitten 1.2 och 3 i protokollet) och deras embryon avbildas på samma sätt som control embryon. Att jämföra celler från RNAi embryon att kontrollera embryon, är det bäst att bilden på liknande stadier av embryonal utveckling (för att matcha cell former och positioner). Till exempel finns det en större cell som visas i mitten av embryot under ventrala inneslutningen som kan verka som en bra referenspunkt för avbildning neuroblaster (figurerna 4 och 5). Den gen som studeras här, ani-1 (anillin), organiserar aktomyosin kontraktilitet, men krävs inte för cytokines i det tidiga embryot 23,29-30. Anillin ter homologer emellertid krävs för cytokines i högre eukaryoter 16 och ani-1 krävs för neuroblast cytokines (Fotopoulos, Wernike och Piękny, opublicerade observationer). Såsom visas i fig. 4B (Video 3) och 5B (Video 5), flera neuroblaster initiera cytokines och deras membran nypa in, men i stället för att bilda två separata dotterceller, deras membran regredierar och blir cellerna multinucleate (> en kärna / cell). Det bör noteras att ani-1 kan krävas för divisionen eller formförändring av andra celltyper, som inte avslöjas av detta protokoll. Dessutom går detta protokoll inte visa resultat från vävnadsspecifika RNAi (se diskussion).

Figur 1
Figur 1. Ventral utrymmet under C. elegans epidermal morfogenes. A) Z-stack projektioner (3 Z-stackar av 0,5 mikrometer i tjocklek) av en styr AJM-1: GFP (adherens markör för att visualisera epidermal cellgränser, stam-ID på CGC SU159) embryo genomgår rygginterkala (vänster, rygg view ) och en kontroll AJM-1: GFP embryo genomgår ventrala kapsling (höger, ventrala vy). Bilder inverteras till bättre visualize cellgränserna. B) Cartoons visar ventrala utsikt över C. elegans embryon genomgår ventral kapsling. Först två par spetsceller (blå) använder aktin rik filopodia (svarta linjer) för att migrera mot den ventrala mittlinjen (embryo till vänster). Därefter de bakre ventrala pocket celler (röd) migrera mot mittlinjen skapar ett hål på den ventrala yta som kan stängas med en handväska sträng som mekanism (B ', svart streckad linje / cirkel, som påminner om sårläkning) 25. Dessutom visas de underliggande neuroblaster (som grå cirklar). Den andra embryot (B ") visar hur migration av specifika undergrupper av epidermala celler förmedlas av en" bro "som bildats av ombildning av PLX-2/plexin och VAB-1/Ephrin receptoruttryckande" plexin band "celler (gröna cirklar). Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2
Figur 2. ANI-1 lokalisering i C. elegans embryon. A) En fast C. elegans embryo som uttrycker HMR-1: GFP (E-cadherin, markör för epidermal cellgränserna) costained för GFP (grönt) och ANI-1 (röd). Konfokala bilder av de yttre cellager (4 Z-stackar av 0,2 um i tjocklek) visar liggande hudceller och underliggande neuroblaster som är ANI-1 positiva B) Fast N2 och N2;. Ani-1 RNAi embryon co färgas för ANI-1. ANI-1 minskar kraftigt i ani-1-utarmat embryo. Skala barer:. 10 mikrometer Klicka här för att visa en större bild.


Figur 3. Visualisering dividera neuroblast under C. elegans embryogenes. (A) Z-stack projektioner (20 Z-stackar av 0,2 mikrometer i tjocklek) visas från en kontroll embryo samuttrycker HAM-1: GFP (att visualisera neuroblast kärnor, grön) och mCherry: PH (att visualisera cellmembran, röd) . Många neuroblaster och andra celltyper är synliga i prognoserna (B) Z-stack prognoser med hjälp av ett mindre antal Z-plan visas från en annan kontroll embryo samuttrycker HAM-1:. GFP (grönt) och mCherry: PH (röd). Ett område är inzoomad (vita rutan) för att tydligare visa en enskild skiljeneuroblast. Vita pilar pekar på tränger plasmamembranet av en skiljecell och gröna cirklar belysa den kondenserade DNA under mitos och nyligenbildar dotterkärnor mot slutet av mitos. Den stora cellen fungerar som en referenspunkt (vit asterisk) för att fastställa utvecklingsstadiet och plats i embryot. Skala barer:. 10 mikrometer (vit) och 3,5 m (gul) Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4
Figur 4. Visualisering neuroblast cytokines under C. elegans embryogenes med användning av ett vidvinkel-systemet. A) Inverterade Z-stack prognoser (2 Z-stackar av 0,2 mikrometer i tjocklek) visas från en kontroll embryo samuttrycker HAM-1: GFP och mCherry: PH samlats in från widefield-systemet med hjälp av en CCD-kamera med hög upplösning. Röda pilspetsar pekar på delande neuroblaster med ingressing cellmembranen. Gröna cirklar belysa kondenserad DNA under tidiga faserna av mitos eller nybildade dotterkärnor mot slutet av mitos / cytokines. Den stora cellen fungerar som en referenspunkt (gul asterisk) för att fastställa utvecklingsstadiet. B) bilder som visas liknar A), men är från ett embryo som behandlats med ani-1 RNAi. Cellmembranet ingresser i som cellen fortsätter genom mitos, men slappnar strax efter, lämnar en multinucleate cell. Skala bar:. 10 mikrometer (svart), 3,5 m (gul) Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5
Figur 5. Visualisering neuroblast cytokines under C. elegans embryogenes använder en svept fältsystem. A) Inverterade Z-stack projektioner av 2 Z-stackar av 0,2 m (totalt 0,4 um) visas från ett embryo samuttrycker HAM-1: GFP och mCherry: PH samlats in från svepte fältet systemet med hjälp av en EMCCD kamera med hög känslighet, men lägre upplösning. De röda pilspets pekar på en neuroblast genomgår cytokines. Gröna cirklar belysa kondenserad DNA under mitos och det nybildade dotter kärnor efter cytokines. Den stora cellen fungerar som en referenspunkt (gul asterisk) för att fastställa utvecklingsstadiet. B) bilder som visas liknar A), men är från ett embryo som behandlats med ani-1 RNAi, och 3 Z-stackar används (totalt 0,6 um ). Såsom beskrivits ovan, slappnar membran ingresser i såsom cellskrider genom mitos, men sedan bringa cellen att bli multinucleate. Skala bar: 10 m (svart), 3,5 m (gul).188/51188fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Video 1. Visualisera delande neuroblaster under C. elegans embryogenes. Z-stack projektioner av två Z-plan (0,4 um / plan) från en kontroll embryo samuttrycker HAM-1: GFP (grönt) och mCherry: PH (röd). Bilder som tagits på widefield mikroskop visas för båda kanalerna. Videon motsvarar embryot som visas i den tredje panelen i figur 3B. Klicka här för att se på video.

Video 2. Visualisera delande neuroblaster under C. elegans embryogenes. Z-stack projektioner av två Z-plan (0,4 um / plan) från en kontroll embryo samuttrycker HAM-1: GFP (grönt) och mCherry: PH (röd). Videon motsvarar inverterade bilder som samlats in från widefield mikroskop för mCherry: PH kanal only (embryo i figur 4A). Klicka här för att se på video.

Video 3. Visualisera delande neuroblaster under C. elegans embryogenes. Z-stack projektioner av två Z-plan (0,4 um / plan) från en ani-1 RNAi behandlad embryo samuttrycker HAM-1: GFP (grönt) och mCherry: PH (röd). Videon motsvarar inverterade bilder som samlats in från widefield mikroskop för mCherry:. Endast PH-kanal (embryo i figur 4B) Klicka här för att titta på video.

Video 4. Visualisera dela neuroblast under C. elegans embryogenes. Z-stack projektioner av två Z-plan (0,4 um / plan) från en kontroll embryo samuttrycker HAM-1: GFP (grönt) och mCherry: PH (röd). Videon motsvarar inverteraed bilder som samlats in från den svepte fältet konfokalmikroskop för mCherry:. endast PH-kanal (embryo i Figur 5A) Klicka här för att titta på video.

Video 5. Visualisera dela neuroblast under C. elegans embryogenes. Z-stack projektioner av tre Z-plan (0,4 um / plan) från en ani-1 RNAi behandlad embryo samuttrycker HAM-1: GFP (grönt) och mCherry: PH (röd). Videon motsvarar inverterade bilder som samlats in från den svepte fältet konfokalmikroskop för mCherry:. Endast PH-kanal (embryo i figur 5B) Klicka här för att titta på video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver användningen av olika typer av mikroskopi för att bilden celldelningar under mitten av embryogenes. I synnerhet belyser detta protokoll hur bilden fördelningen av neuroblaster, celler som kan underlätta epidermal morfogenes. Cell-cell kommunikation är viktig för vävnadsbildning under metazoan utveckling och C. elegans är en utmärkt modell för att studera vävnadsbildning in vivo. En händelse som fint skildrar samspelet mellan vävnader är epidermal morfogenes, som omfattar embryo i ett lager av epitelceller. Framför allt är ventral kapsling den process där de ventrala epidermala cellerna migrerar att innesluta den ventrala ytan av embryot, och förlitar sig på de bakomliggande neuroblaster. De neuroblaster ger kemiska eller mekaniska signaler, och ventrala kapsling äventyras om positionen av neuroblaster förändras. Antalet (eller polaritet) av neuroblaster kan också vara avgörande för ventrala kapsling ske på rätt sätt,och det är viktigt att förstå de mekanismer som reglerar deras division. Detta protokoll beskriver hur bild celldelning i en levande vävnad med hjälp av C. elegans embryon samuttrycker två fluorescerande prober (mCherry: PH att beskriva plasmamembran och HAM-1: GFP att märka neuroblast kärnor).
De viktigaste stegen för att bilden levande C. elegans embryon som uttrycker fluorescerande prober är: i) använda friska, unga vuxna hermafroditer som uttrycker de önskade fluorescerande markörer (som upprätthålls vid 20-25 ° C), ii) använda mutanter eller RNAi för att studera gen krav under vävnadsbildning, iii) samla in embryon i rätt scen för mikroskopi (t ex. mitten embryogenes), och iv) utföra fluorescensmikroskopi med optimerade inställningar för att hålla fototoxicitet låg, men en fortsatt hög bildkvalitet.

För att identifiera specifika celler och / eller intracellulära fack inom en vävnad av intresse, använder maskar uttrycker markörer taggade med fluorescerande probes. Den Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http://www.cbs.umn.edu/cgc) erbjuder en mängd olika stammar som samtidigt uttrycka flera markörer. Emellertid kan två stammar (vardera uttrycker en enskild markör av intresse) måste passeras och screenas med ett fluorescerande mikroskop under flera generationer för att generera en stam som stabilt uttrycker båda sonderna. Till exempel, för att genomföra detta försöksprotokoll, en stam som uttrycker en markör för att visualisera cellmembran (mCherry: pH; OP70) korsades med en stam som uttrycker en markör för att visualisera neuroblast kärnor (HAM-1: GFP; OP102) för att generera en stam samuttrycker båda.

Det bästa sättet att studera gen krav under fosterutvecklingen är att utföra förlust av funktionsexperiment, där genen produkten nedslagen eller muterade. Denna försöksprotokoll beskriver utföra RNAi mot anillin (ani-1) för att minska endogena ANI-1-nivåer i alla embryonala vävnader. Det finns ingen väl karakteriserade hypomorphic allelerav ani-1. Därför är RNAi det bästa alternativet för att undersöka ani-1: s förlust av funktions fenotyper och bestämma dess funktion under fosterutvecklingen. Vanligtvis är det bättre att använda mutanter istället för RNAi, eftersom effektiviteten i knockdown kan variera och är sällan noll. En av de vanligaste problemen med utfodring RNAi protokoll är föroreningar, som kommer att minska RNAi effektivitet. För att minska risken för kontaminering, förbereda RNAi tallrikar och mat under aseptiska förhållanden. Föroreningar kan upptäckas genom screening några av plattorna före användning, och plattor med milky / ogenomskinliga söker bakterier ska kasseras. Ett annat problem som kan minska RNAi effektivitet är genom att inte välja hermafroditer vid rätt utvecklingsstadiet. Det är bäst att använda L4-staged eller yngre vuxna maskar (framkallnings vulva visas som en vitaktig cirkel / hål på den ventrala sidan av masken), som inte har någon / några befruktade embryon. Vidare är de RNAi tillstånd och behandlingar may variera för olika genprodukter. Olika sätt att öka eller minska styrkan hos den RNAi är genom att återsuspendera de pelleterade HT115 bakterier i olika mängder av LB-Amp-media (se avsnitt 1.2.2), och genom att ändra varaktigheten av RNAi behandling (tidslängd som maskar hålls på RNAi plattor, se protokoll 3). För att ge optimala ani-1 RNAi fenotyper för detta protokoll, har bakterier suspenderade i 500 l av LB Amp media och maskar hölls på RNAi plattor för 2 dagar (ani-1 RNAi har tidigare präglats av Maddox et al. 23). RNAi är resistenta eller känsliga stammar (t.ex.. Rde-1, Sid-1 eller RRF-3) kan även användas för att ändra styrkan av RNAi. Ännu viktigare, kan dessa stammar kopplas till vävnadsspecifika uttryck för deras vildtyp gener för att skapa vävnad känsliga stammar. Till exempel, för att utföra neuroblast specifika RNAi, kan man använda sid-1 mutant embryon (RNAi-resistent) uttrycker wt UNC-119 promotorn (stam-ID på CGC TU3401) 31.

Detta protokoll beskriver hur bildneuroblast celldelning under mitten av embryogenes. Det finns flera aspekter av det protokoll som kräver noggrant övervägande, till exempel utvecklingsstadiet av embryona, samla lämpliga Z-stackar och optimera avbildningsförhållanden för att minimera fototoxicitet utan att kompromissa med bildkvaliteten. För att fånga tidpunkter vid rätt utvecklingsstadium (t.ex. ventral kapsling), bör embryon filmas från rygg inter (par av dorsala hudceller interdigitate och säkring för att bilda ett enda lager av epidermis på ryggsidan av embryot, figur 1A6). Vid denna tidpunkt är de neuroblaster snabbt delande. Eftersom mellanstationer embryon kan vara svårt i låg förstoring (t.ex. med hjälp av en dissekera mikroskop), hjälper det att samla många embryon i olika stadier och embryon vidrätt skede kan väljas med större förstoring.

Neuroblaster är relativt liten och tunn, och finns i hela mitten av embryot. Det är viktigt att optimera antalet och storleken på Z-stackar för att se till att hela cellen fångas under division. Till exempel kommer att samla in för många bilder exponera embryon till mer ljus och göra dem benägna att fototoxicitet. Emellertid kunde samla för få Z-stackar eller använder tjocka Z sektioner gör det svårt att på ett korrekt bild en hel skiljeneuroblast cell.
Detta protokoll beskriver användningen av ett svept fält konfokalmikroskop eller widefield systemet till bilden neuroblast celldelning. Såsom beskrivits tidigare är en av de huvudsakliga begränsningarna med att använda en widefield epifluorescent mikroskop potentialen för fototoxicitet. Även om det är mycket rekommenderat att använda en snurrande skiva konfokala eller sopas fält konfokala för avbildning C. elegans embryon, kan vissa laboratorier har begränsad tillgång till dessa system. Denna protocol ger några förslag för att begränsa fototoxicitet vid användning Widefield system, till exempel att stänga öppningen till 30%, sänka intensiteten av ljuset från kvicksilverlampan (eller helst med lysdioder), med hjälp av en EMCCD kamera, och öka vinsten eller binning att tillåta en minskning av exponeringstid. Antalet Z-stackar och tidpunkter också begränsas med hjälp av ett widefield-system. Även om det inte beskrivs i detta protokoll är den snurrande skiva konfokalmikroskop vanligen används för live-avbildning eftersom det orsakar lägre fototoxicitet i jämförelse med en widefield mikroskop. I likhet med den sopade fältsystem, använder den fasta tillståndets lasrar och sprider ljus (även på ett annat sätt jämfört med den svepta fältet). Antingen CCD eller EMCCD kameror kan användas med spinning disksystem, vilket ofta har flera kamera portar för att tillåta dubbla avbildning. I likhet med den svepte fältmikroskop kan bilder tagna med exponeringstider 50-90% lägre jämfört med widefield-systemet.
Detta protokollol kan användas för att studera funktionen hos olika gener som reglerar celldelningen under vävnadsbildning. Tiden mellan varje bild skulle kunna kortas (t. ex. Varje 15-30 sek vs. 2-3 min) för att bättre visualisera mitotiska fenotyper. Olika prober skulle kunna användas (t ex istället för att använda HAM-1:. GFP, kan fluorescent-märkta H2B användas för att visualisera DNA och / eller fluorescerande märkt tubulin kunde användas för att visualisera mitotiska spolar). Antalet Z-stackar och tjockleken för varje stapel kan också ändras (t.ex. fler travar av ett mindre stegstorlek). Såsom beskrivits ovan, att välja lämpliga inställningar är avgörande för att begränsa fototoxicitet och optimera bildkvaliteten. Även om mCherry: PH-och HAM-1: GFP sonder uttrycker på relativt höga nivåer, samla snabbare tidpunkter, öka antalet Z-stackar eller bildhantering för längre tid vs det som beskrivs i detta protokoll får inte vara möjligt På en vidvinkel-systemet.
En Java-baserad imålder behandlingsprogram (ImageJ, NIH) kan användas för att bearbeta bilder som samlats in av de olika mikroskop och bilder kan exporteras som TIFF. Men beroende på vilken programvara som används för förvärv, filerna kan redan vara kompatibla med bearbetningen mjukvaran. Det är bättre att öppna originalfilerna vs exporterade bilder (t.ex. TIFF), eftersom metadata hålls med de ursprungliga filerna. Bearbetning programvara kan användas för att manipulera bilder för att göra siffror eller filmer. Dessutom även kvantitativa analyser kan utföras, till exempel mätning av pixelintensiteter i valda områden. Optimal programvara bör väljas beroende på analysen, till exempel bildbehandling Toolbox (MathWorks, Matlab) eller 3D och 4D Real-Time Interactive Data Visualization (Imaris, Bitplane).
Med hjälp av detta protokoll, har ani-1 visat sig krävas för neuroblast cytokines, även om det inte krävs för cytokines i det tidiga embryot. Intressant, genom att styra number och placering av neuroblaster, ani-1 kan reglera migration av ventrala epidermal celler för ventrala kapsling, eftersom neuroblaster ger kemiska eller mekaniska signaler till de överliggande epitelceller. Det är dock inte känt om det krävs ani-1 för divisionen eller formförändring av andra celltyper under mitten sen embryogenes. Visar hur den totala sammansättningen av en vävnad påverkar angränsande vävnader betonar vikten av vävnad kommunikation under metazoan utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för att detta arbete stöddes av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) bidrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada Inc. #AGR001.1 For making C. elegans NGM and RNAi plates
Agar Bio Basic Inc. #9002-18-0 For making bacteria LB agar plates
Agarose BioShop Canada Inc. #AGA001.500
Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11029
Anti-mouse anti-GFP antibody Roche Applied Science #11814460001
Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11011
Ampicillin BioShop Canada Inc. #AMP201.5 Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C
Bactopetone  (peptone-A) Bio Basic Inc. #G213
CaCl2 (calcium chloride) BioShop Canada Inc. #C302.1
Cholesterol BioShop Canada Inc. #CHL380.25 Dissolve in ethanol
DAPI  Sigma-Aldrich #D9542 Use to stain nucleic acids (DNA)
Glycerol BioShop Canada Inc. #GLY001.1
IPTG (isopropylthio-β-galactoside) Bio Basic Inc. #367-93-1 Store powder and dissolved IPTG at -20 °C
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) BioShop Canada Inc. #PPM666.1
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) BioShop Canada Inc. #PPD303.1
L4440  (feeding vector) Addgene #1654 Keep as glycerol stock at -80 °C
MgSO4   (magnesium sulfate) BioShop Canada Inc. #MAG511.500
NaCl (sodium chloride) Bio Basic Inc. #7647-14-5
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. #7558-79-4
Normal Donkey Serum (NDS) Wisent Bioproducts #035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) Alfa Aesar #A10877
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich #P8920 For optimal results coat microscope slides three times 
Streptomycin BioShop Canada Inc. #STP101.50 Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C
Tetracyclin BioShop Canada Inc. #TET701.10 Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C
Tween-20 Bio Basic Inc. CAS#9005-64-5
Tryptone BioShop Canada Inc. #TRP402.500
Yeast Extract Bio Basic Inc. #8013-01-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  3. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  4. Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
  5. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
  7. Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
  8. Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
  9. Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
  10. Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
  11. Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
  12. Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
  13. Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
  14. Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
  15. Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
  16. Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
  17. Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
  18. Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
  19. Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
  20. Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  21. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  22. Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
  23. Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
  24. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
  25. Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
  26. Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
  27. Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
  28. Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
  29. Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
  30. Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
  31. Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).

Tags

Neuroscience , Morfogenes cytokines neuroblaster anillin mikroskopi celldelning
Visualisering neuroblast cytokines Under<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenesis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wernike, D., van Oostende, C.,… More

Wernike, D., van Oostende, C., Piekny, A. Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis. J. Vis. Exp. (85), e51188, doi:10.3791/51188 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter