Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

Published: April 11, 2014 doi: 10.3791/51220
Automatic Translation
1, 1
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

Summary

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

Abstract

הכרומטין הוא מורכב nucleoprotein מאוד דינמי עשויים דנ"א וחלבונים השולט בתהליכי ה-DNA תלוי שונים. מבנה הכרומטין ותפקוד באזורים מסוימים מוסדר על ידי ההעשרה המקומית של שינויי היסטון לאחר translational (hPTMs) וגרסאות, מחייב חלבוני הכרומטין, ובכלל זה גורמי שעתוק, ומתילציה בדנ"א. אפיון proteomic של הרכב הכרומטין באזורים פונקציונליים שונים כבר הקשו עד כה על ידי חוסר פרוטוקולים יעילים להעשיר תחומים כגון בטוהר והכמות המתאימים לניתוח מעמיק לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). אנו מתארים כאן אסטרטגיה חדשה תוכננה פרוטאומיקה הכרומטין, בשם ChroP (roteomics P matin chro), לפיה immunoprecipitation הכרומטין preparative משמש כדי לבודד אזורי הכרומטין ברורים שתווים, במונחים של hPTMs, וריאנטים הקשורים שותף חלבונים שאינו histonic, הם נותח על ידי טרשת נפוצה. אנו ממחישים הואמחדש הקמת ChroP להעשרה והניתוח של אזורי heterochromatic תעתיק שקטים, שסומנה על ידי נוכחותו של Tri-מתילציה של ליזין 9 בהיסטון H3. התוצאות שהושגו להדגים את הפוטנציאל של ChroP באפיון יסודיות proteome heterochromatin ולהוכיח את זה כאסטרטגיה אנליטיים רבת עוצמה להבנת אופן שבו גורמי החלבון הייחודיים של הכרומטין אינטראקציה וsynergize להקים תצורות מבניות ותפקודיות מוקד ספציפי.

Introduction

הכרומטין הוא מורכב nucleoprotein דינמי מאוד כי הוא מעורב כתבנית ראשונית לכל התהליכים בתיווך ה-DNA. הנוקלאוזום הוא היחידה הבסיסית החוזרת ונשנית של הכרומטין והוא מורכב מליבת octameric חלבוניים המכילה שתי מולקולות של כל H2A הקנונית היסטון, H2B, H3 ו-H4, שסביבו 147 נ"ב של ה-DNA עטופים 1,2. כל ההיסטונים הליבה בנויים כתחום כדורי ו" זנב "N-מסוף גמיש שבולט מחוץ להנוקלאוזום. אחד המנגנונים העיקריים להסדרת מבנה הכרומטין ודינמיקה מבוסס על שינויים קוולנטיים לאחר translational (PTMs), שבעיקר להתרחש על N-Termini של ההיסטונים 3,4. שינויי היסטון יכולים לתפקד גם על ידי שינוי מבנה הכרומטין סדר גבוה יותר, על ידי שינוי קשרים בין ההיסטונים-DNA או בין nucleosomes, ובכך שליטה על הנגישות של חלבוני ה-DNA מחייבת (מנגנוני cis), או על ידי מתנהג כמו dockinאתרים גרם לחלבונים רגולטוריים, או כיחידות בודדות, או משובץ במתחמי Multimeric. חלבוני ויסות כזה יכול להפעיל את תפקידם בדרכים שונות: על ידי ויסות ישירות ביטוי גנים (כלומר חלבוני TAF), או על ידי שינוי מיקום הנוקלאוזום (כלומר הכרומטין שיפוץ מכלולים) או על ידי שינוי שאריות אחרות היסטון (כלומר חלבונים עם מתיל-transferase או אצטיל פעילות transferase) (מנגנוני טרנס) 5. התצפית כי אשכול דפוסים ברור PTM בלוקוסי הכרומטין ספציפיים הוביל לפירוט של את ההשערה כי שינויים שונים באתרים שונים עשויים synergize ליצור קוד מולקולרי המתווך את המצב התפקודי של ה-DNA הבסיסי. "ההשערה של קוד היסטון" צברה קונסנסוס גדול בשנים, אבל אימות ניסיוני שלה כבר התאפקה על ידי מגבלות טכניות 6,7.

פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה (MS) התפתחהכלי רב עוצמה למפה דפוסי שינוי היסטון ולאפיין מחייב חלבוני הכרומטין 8. MS מזהה שינוי כΔmass ספציפי בין המסה הניסיונית ותיאורטית של פפטיד. ברמה של ההיסטונים בודדים, MS מספק שיטה משוחדת ומקיפה למפה PTMs, המאפשר זיהוי של שינויים חדשים וinterplays החושפני ביניהם 9-14.

בשנים האחרונות, מספר האסטרטגיות פותחו כדי לנתח את הרכב proteomic של הכרומטין, כולל האפיון של כרומוזומים שלמים המיטוטי 15, זיהוי של חלבוני קושרי hPTM המסיסים 16-18 והבידוד והניתוח של אזורי הכרומטין הספציפיים (כלומר הטלומרים) 19,20. עם זאת, החקירה של סינרגיות המוקד ספציפי בין PTMs היסטון, גרסאות, והחלבונים הקשורים הכרומטין היא עדיין לא הושלמה. כאן, אנו מתארים גישה חדשה, בשם ChroP (roteomics chro P matin) 21, שפיתחנו כדי לאפיין ביעילות תחומים הכרומטין תפקודי מובהקים. גישה זו מתאים את עצמו immunoprecipitation הכרומטין (שבב), פרוטוקול מבוסס היטב בשימוש במחקר אפיגנטיים, לניתוח proteomic מבוסס MS יעיל של המדגם המועשר. פיתחנו שני פרוטוקולים שונים, בהתאם לסוג של הכרומטין משמש כקלט והשאלה מופנה על ידי MS; בפרט: 1) שבב של הכרומטין ילידים מבולבל מתעכל עם MNase מועסק לטהר מונו nucleosomes ולנתח את hPTMs שיתוף שיוך (N-ChroP); 2) שבב של הכרומטין crosslinked מקוטע על ידי sonication משמש בשילוב עם אסטרטגית interactomics מבוסס SILAC לאפיין כל הכרומטין שיתוף ההעשרה מחייב חלבונים (X-ChroP). אנו מדגימים כאן שילוב של N-ו-X-ChroP להעשרת ולימוד heterochromatin, באמצעות H3K9me3 כפיתיון לצעדי immunoprecipitation. השימוש בChroP יכול להתארךללמוד או אזורים שונים על הכרומטין, או שינויים בהרכב הכרומטין בתוך האזור אותו במהלך המעבר למצב תפקודי שונה, ובכך סלל את הדרך ליישומים שונים באפיגנטיקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תא תרבות

  1. מדיום סטנדרטי לשבב ילידים
    1. לגדל תאי הלה במדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% שור סרום עוברי (FBS), 1% גלוטמין, 1% פן / סטרפטוקוקוס ו10 HEPES מ"מ pH 7.5.
  2. תיוג SILAC לcrosslinking שבב
    1. לגדל תאי הלה במדיום SILAC DMEM, המדולדל של ליזין וארגינין, בתוספת 10% FBS dialyzed, 1% גלוטמין, 1% פן / סטרפטוקוקוס, 10 HEPES מ"מ pH 7.5 וגם L-ליזין האור (ליס 0) ו-L- ארגינין (ARG 0) או עמיתיהם הכבדים, L-ליזין (Lys 8) ו-L-ארגינין (ARG 10) (לוח חומרים), בריכוזים הסופיים של 73 מ"ג / ליטר ו42 מ"ג / ליטר, בהתאמה.
    2. לגדל תאים לתקופה של עד שמונה דורות במדיום SILAC כדי להבטיח שילוב חומצות אמינו המסומן באיזוטופ מלאה. עובר תאים כל יומיים, כאשר הם מגיעים לצפיפות של 1.0-1.5 x 10 6 תאים / מיליליטר, זריעתם בaconcentration של 3 x 10 5 תאים / מיליליטר.
    3. להעריך את צמיחת תאים ואת הכדאיות במדיום SILAC לאינדיבידואציה כל שינוי אפשרי מפיזיולוגיה שעלולה לנבוע מההרכב העני יותר של מדיום SILAC; כדי לעשות זאת:
      1. ראייה לבדוק תאי המורפולוגיה במיקרוסקופ כל יום במהלך התיוג.
      2. ספירת תאים ועקומות גדילת עלילה של תאים גדל בSILAC לעומת בינוני סטנדרטי.

2. Native הכרומטין immunoprecipitation (N-שבב)

  1. הכנת גרעינים מהתאים בתרבית
    1. השתמש 1-2 x 10 8 תאי HeLaS3 ללא תווית לכל ניסוי. קציר תאים, להפוך aliquot של 50 x 10 6 תאים ב50 צינורות מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 340 10 דקות ב 4 ° C, לשטוף אותם עם PBS קר כקרח.
    2. Resuspend כל תא גלולה ב 8 מיליליטר תמוגה חוצץ (טבלת 1) ו דגירה של 10 דקות ב 4 ° C על גלגל מסתובב. יוצקים carefully כל lysate סלולארי על כרית סוכרוז (טבלת 1) ו צנטריפוגות ברוטור את נדנדה, ב3,270 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C, כדי להפריד בין גרעינים מציטופלסמה.
    3. בטל supernatants, לשמור על כדורים גרעיניים ולשטוף אותם פעמים PBS קר כקרח על ידי צנטריפוגה, להשליך supernatant בכל שטיפה.
  2. Micrococcal Nuclease עיכול (MNase) (בקנה מידה קטנה) ובקרת איכות של הכרומטין לאחר עיכול
    1. Resuspend את הכדור הגרעיני שטף ב1 מיליליטר עיכול חוצץ (טבלת 1); לחלק בשני aliquots של 500 μl ולשמור על קרח.
    2. מדוד את הצפיפות אופטית (OD) ב 260 ננומטר של aliquot, מדולל 1:200 ב0.2% סולפט dodecyl נתרן (SDS) הערה:. OD = 1 מתאים לכ -50 מיקרוגרם / מיליליטר של DNA הכרומטין. בדרך כלל, החל מ 2 x 10 8 תאים, OD הוא בטווח של 40-60.
    3. קח 1% מגרעינים, להוסיף אנזים MNase לריכוז סופי של 0.005 U של אנזים / μl של גרעינים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך נסיגות זמן שונות (0, 10, 20, 40, 60 דקות).
    4. בכל נקודת זמן, לאסוף 4 μl של גרעינים מתעכלים ולהוסיף 1 mM EDTA כדי לעצור את תגובת MNase. שמור על קרח.
    5. לחלץ דגימות DNA על ידי ערכת טיהור PCR וelute ב50 μl TE חוצץ (טבלת 1).
    6. קח 20 μl של כל דגימת DNA, להוסיף 10 μl טוען חוצץ (טבלת 1) ולטעון את הדגימות על 1% (w / v) agarose ג'ל המכיל Ethidium ברומיד, עם סמן ה-PCR כביקורת גודל.
    7. בדוק את עיכול הערכת סולם הנוקלאוזום הכרומטין המיוצר על ידי הדגירה MNase.
    8. בחר את הזמן האופטימלי לעיכול, המבוסס על השכיחות של מוני nucleosomes בהכנה. . בדרך כלל ל0.005 U של האנזים / μl של גרעיני הזמן האופטימלי של מערכת העיכול MNase הוא 60 דקות (איור 1 ב פנל, עזב) הערה: MNase האופטימלי הריכוז / השעה של digestiעל עשוי להיות מותאם בהתאם לסוג התא הרצוי ועל הגודל של nucleosomes מתיחה.
  3. עיכול Large-scale/preparative MNase והחלמה של שברים הכרומטין מסיסים
    1. הוסף לכל aliquot (ראה 2.2.1) 5 MNase μl, המקביל לריכוז סופי של 0.005 U של האנזים / μl של גרעינים; מערבב בעדינות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות (או באופן כללי למרווח הזמן האופטימלי, המבוססים על הניסוי בקנה המידה הקטנה).
    2. הוסף 1 mM EDTA כדי לעצור את התגובה ולשמור על קרח. גלולה הגרעינים מתעכלים על ידי צנטריפוגה ב7,800 XG ב C ° 4 ל10 דקות. העבר supernatants (S1 שבריר) בצינור חדש ולאחסן בהערת 4 ° C.: S1 מכיל את החלק הראשון מסיס של הכרומטין, הכולל מונו nucleosomes. הוסף את מעכבי פרוטאז (טבלת 1).
    3. כדורי resuspend בזהירות ב1 מיליליטר דיאליזה חוצץ (טבלת 1) וdialyze לילה בשעה 4 ° C (גut הנחה של צינור הדיאליזה הוא 3.5 KDA), ב3 L דיאליזה הצפת, עם ערבוב קל מתמיד. לאסוף חומר וצנטריפוגות dialyzed ב7,800 XG 10 דקות ב 4 ° C. מעביר את supernatant (חלק S2) בצינור Eppendorf חדש ולאחסן ב 4 ° C. הערה: S2 כולל di-לEPTA-nucleosomes, בהתאם לעיכול מידת MNase.
  4. בקרת איכות של הכרומטין לפני immunoprecipitation
    1. קח aliquot המקביל ל 5 מיקרוגרם של שברים הכרומטין S1 ו S2 (לכמת על ידי מדידת OD ב 260 ננומטר במערכת NanoDrop). תמצית ה-DNA על ידי ערכת טיהור PCR וelute ב50 μl TE חוצץ (טבלת 1).
    2. קח 20 μl של S1 ו S2-DNA, לערבב עם 10 μl טוען חוצץ (טבלת 1) ולטעון אותם על 1% (w / v) agarose ג'ל. בדוק את האיכות ויעילות של MNase עיכול על ידי בדיקה ויזואלית של סולם nucleosomes הערה:. חלק S1 הוא מאודמועשר במונה nucleosomes, תוך שבריר S2 מכיל בעיקר פולי nucleosomes (איור 1, פנל מימין).
  5. דגירה של הכרומטין עם נוגדן
    1. חנות ב C ° -20 50 μl של שבריר S1 לניתוח ספקטרומטריית מסה שלאחר מכן.
    2. הוסף 1 נפח של שבב דילול חוצץ (טבלת 1) לS1 שבריר.
    3. מוסיף את הנוגדנים נגד hPTM (או חלבון) של עניין; דגירה הלילה על גלגל מסתובב ב 4 ° C. הערה: בדרך כלל, השתמש 10 מיקרוגרם ל20 מיקרוגרם של נוגדנים ל2 x 10 8 תאים. היחס האופטימלי בין כמות הנוגדנים ומספר תאים שמתחיל יש להגדיר בזהירות כל מקרה לגוף, בהתאם לשפע של hPTM / החלבון המשמש כפיתיון בתוך המדגם ועל יעילות הנוגדן. אופטימיזציה היא ניסיונית, המבוסס על הבדיקות הבאות:
      1. השווה את כמות hPTM / החלבון של עניין בין הקלט וזרימת הדרך (FT,ראה 2.7.2) על ידי כתם המערבי או MS כדי לוודא שimmunoprecipitation מעשירה חלק משמעותי מאזור הכרומטין הספציפי הערה:. זה בדרך כלל מושגת כאשר לפחות 50% מפיתיון hPTM / החלבון יגמר בFT (איור 1 ג) .
      2. בדוק שחלבון immunoprecipitated של עניין הוא לגילוי על ג'ל SDS-PAGE, אשר מבטיח כי כמות מספקת של חומר זמינה לניתוח MS הערה:. הנוכחות על הג'ל של הלהקות המתאימות לארבעה ההיסטונים הליבה בstoichiometry הנכון מצביע על כך שהנוקלאוזום שלם כבר immunoprecipitated ידי N-ChroP (1D איור). חוסר stoichiometry הנכון הוא למעשה מעיד על שיבוש חלקי / התגלגלות של הנוקלאוזום.
    4. במקביל, להכין את חרוזים המגנטיים מצמידים חלבון G (ראה 2.6).
  6. איזון וחסימה של חרוזים מגנטיים בשילוב חלבון G
  7. לאזן של חלבון 100 μl חרוזים מגנטיים בשילוב-G בלועים בחסימת פתרון (טבלת 1), הערה שטיפת שלוש פעמים ודוגרות אותם לילה בשעה 4 ° C על גלגל מסתובב:. בעקבות יכולת הקשירה של חרוזים, שימוש בתרחיף 100 μl עבור 2-20 מיקרוגרם של נוגדנים.
  8. שטוף את החרוזים נחסמו פעם אחת עם פתרון חסימה ולאחר מכן פעמיים עם שבב דילול חוצץ (טבלת 1).
  • בידוד של הכרומטין באמצעות חרוזים מגנטיים
    1. הוספה של חרוזים חסמו 100 μl למדגם הכרומטין S1 ו דגירה אותם על גלגל מסתובב ב-C ° 4 ל -3 שעות. צנטריפוגה ב XG 340 דקות 1 לספין למטה המדגם מהמכסה של הטיפים. שים במעמד מגנטי כדי גלולה את החרוזים.
    2. מעביר את supernatant לצינור חדש Eppendorf. זוהי הזרימה דרך (FT), כלומר את החלק היחסי של הכרומטין שלא להיקשר לנוגדנים.
    3. שטוף את החרוזים ארבעהפעמים בכביסה חוצץ (טבלת 1) הגדלת ריכוז המלח בכל שטיפה (75, 125 ו175 מ"מ NaCl).
    4. לelute הכרומטין immunoprecipitated, דגירה חרוזים ב30 μl של מדגם LDS הצפת, בתוספת dithiothreitol מ"מ 50 (DTT) במשך 5 דקות ב70 ° C. הפרד את חלבוני eluted על 4-12% ג'ל שיפוע Bis-טריס acrylamide-SDS טרומי וכתם ג'ל עם ערכת קולואיד Coomassie מכתים (1D איור).

    • 3. Crosslinking הכרומטין immunoprecipitation (X-שבב)

    1. Crosslinking של תאים עם פורמלדהיד
      1. הוסף פורמלדהיד 0.75% לתאים שכותרתו SILAC, לערבב בקצרה ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר. להרוות פורמלדהיד ידי הוספת 125 גליצין מ"מ ודגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
      2. לחלק תאים ב5 x 10 7 aliquots; לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS קר כקרח על ידי צנטריפוגה ב430XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו השלכת supernatants לאחר כל שטיפה. בשטיפה האחרונה, להשליך supernatant ולשמור את הכדור. הערה: ברגע שהתאים crosslinked, הם יכולים להיות מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס, אם לא נעשה שימוש באופן מיידי.
    2. הכנת גרעינים
      1. Resuspend כל גלולה תא ב10 מיליליטר תמוגה חוצץ (טבלת 1). דגירה של 10 דקות ב 4 ° C עם רוטציה. צנטריפוגה ב430 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. מחק את supernatants; לשמור על כדורים גרעיניים.
      2. Resuspend כל גלולה גרעינית ב10 מיליליטר כביסה חוצץ (טבלת 1). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות על גלגל מסתובב.
      3. צנטריפוגה ב430 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. מחק את supernatants ולאסוף את כדורים.
      4. Resuspend כל כדורים גרעיניים ב3 מיליליטר שבב דגירה חוצץ (טבלת 1). שמור על קרח.
    3. sonication הכרומטין ובקרת איכות
      1. Sonicate ch. Romatin ב200 W (מחזורים של 30 שניות "על" ו 1 דקות "כבוי"), בBioruptor התקרר, לפצל הכרומטין הערה: מספר המחזורים ומרווחי sonication תלוי בסוג התא ועל האורך הממוצע של nucleosomal למתוח רצוי. בדרך כלל, 30 דקות של sonication נחוצות כדי ליצור שברי DNA של 300-500 נ"ב באורכים, המקביל ל-di ותלת nucleosomes. הבחירה של גודל שברים תלוי בסוג של תחום הכרומטין תחת חקירה.
      2. קח 2% מתשומות בסך הכל, להפוך את crosslinking על ידי דגירה על 65 מעלות צלזיוס למשך התקופה מינימאלית של 1 שעות בשבב הדגירה הצפת. חלץ את ה-DNA על ידי ערכת טיהור PCR, elute ב50 μl TE הצפת ולטעון את ה-DNA על ג'ל agarose כדי לבדוק את פיצול הכרומטין.
    4. דגירה של הכרומטין עם נוגדן
      1. הוספה של 10% טריטון X-100 1/10 נפח הכרומטין sonicated. צנטריפוגה ב XG 12,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה דהברית מילה.
      2. לחסוך 50 μl של קלט הכרומטין מהתאים כבדים לבדיקת רמת שילוב של חומצות אמינו SILAC בתאי שכותרתו ולאפיון חלבון.
      3. מוסיף את הנוגדן של בחירת שכותרתו הכרומטין הכבד וקל שנותר sonicated ודגירת הלילה בשעה 4 ° C על הגלגל מסתובב. בערוץ האור, תוסיף גם קיפול עודף של פפטיד המסיסים. דגירה הלילה ב 4 ° C על גלגל מסתובב הערות:. המצב האופטימלי בין מיקרוגרם של נוגדנים ואת החומר המוצא של תאים נבחר מקרה לגופו, כפי שפורט ב2.5.3. Molarity הקיפול העודף האופטימלי של הפפטיד המסיסים בביחס לנוגדנים חייב להיות טיטרציה בזהירות כל מקרה לגוף.
    5. בידוד של הכרומטין באמצעות חרוזים מגנטיים
      1. לאזן ולחסום חרוזים מגנטיים מצמידים חלבון G על ידי ביצוע השלבים המתוארים ב2.6 ובאמצעות שבב דגירה הצפת.
      2. הוספה של b החסומה 100 μlEADS לדגימות הכרומטין ולדגור על גלגל מסתובב במשך 3 שעות ב 4 ° C. צנטריפוגה ב XG 340 דקות 1 לספין למטה המדגם מהמכסה של הטיפים. שים במעמד מגנטי כדי גלולה את החרוזים. Supernatant הוא הזרימה דרך (FT), המכיל nucleosomes מאוגד. לשטוף חרוזי ארבע פעמים בכביסה חוצץ (טבלת 1) עם ריכוז מלח הגדלת (שני שוטף ב150 מ"מ ושני ב300 מ"מ NaCl).
      3. דגירה חרוזים ב30 דוגמא טוען SDS-PAGE μl חוצץ (טבלה 1) ועבור 25 דקות ב 95 מעלות צלזיוס לשני elute וחלבוני immunoprecipitated דה Crosslink. חלבונים נפרדים על 4-12% ג'לי טרומי-SDS Bis-טריס acrylamide (איור 3D).

    4. לדוגמא הכנה לפני MS

    1. ב- ג'ל עיכול של ההיסטונים מועשרים מN-שבב
      הערה: במהלך פעולות עיכול חלבון ומיצוי פפטיד דואגותכדי למזער את זיהומי קרטין שמפריעים LC-MS/MS, כפי שתואר 22, 23 בעבר.
      1. פרוסות ג'ל Cut המתאימות ללהקות ההיסטונים ליבה (1D איור). De-להכתים את חתיכות ג'ל עם אצטוניטריל 50% (ACN) בDDH 2 O, לסירוגין עם 100% ACN לכווץ את הג'ל. חזור על פעולה עד חתיכות ג'לי לחלוטין דה מוכתמים ולייבש אותם בצנטריפוגה בואקום.
      2. הוספת D 6-אצטית אנהידריד 1:09 (V / V) באמוניום ביקרבונט 1 M (NH 4 HCO 3) (בדרך כלל הנפח הסופי הוא 60-100 μl) ו3 נתרן אצטט μl (CH 3 COONa), כזרז. דגירה במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד חזק הערה:. המדגם עלול ליצור בועות בדקות הראשונות לאחר ההרכבה של התגובה: זה חשוב לטפל בזהירות ולשחרר את הגז שנוצר, פתיחה מהעת לעת את הצינורות במהלך דגירה.
      3. יש לשטוף את חתיכות ג'ל מספר פעמים wNH-i 4 HCO 3, חלופי עם ACN באחוז הולך וגדל (מ -50% ל 100%), במטרה לחסל את השאריות של אנהידריד 6 אצטית D לחלוטין.
      4. לכווץ את חתיכות ג'ל בACN 100%; לייבש אותם בצנטריפוגה בואקום כדי להבטיח דה הידרציה מלאה. חתיכות ג'ל מימה מחדש עם קר כקרח 100 ng / μl פתרון טריפסין ב50mm 4 NH HCO 3 ו דגירה הלילה בשעה 37 ° C. הערה: השילוב של שינוי הכימי של lysines באמצעות אנהידריד אצטית deuterated ועיכול טריפסין יוצר "Arg- C כמו "בדפוס עיכול ג'ל של ההיסטונים 21,24.
      5. מחק את הפתרון העודף ולהוסיף נפח 50 מ"מ NH 4 HCO 3 כדי לכסות את חתיכות ג'ל לחלוטין; דגירה הלילה בשעה 37 ° C.
      6. לאסוף פפטידים מתעכלים מסיסים בצינור Eppendorf חדש. Lyophilize פפטידים. Resuspend אותם ב0.5%% acid/0.1 חומצה אצטית trifluoracetic (TFA). Desalt ולהתרכזפפטידים בשלב התהפך "כריך" C 18 / פחמן וכרומטוגרפיה חילופי יונים (SCX) על microcolumns בעבודת יד (StageTip) 25.
      7. הכן את microcolumns StageTip ידי לשים דיסקי meshwork טפלון המכילים C המשותק 18 / פחמן ("סנדוויץ'") וחרוזים SCX ב200 טיפים μl. השג את "הכריך" על ידי טעינת microcolumn 18 C על גבי קצה שני נטען עם מסנן פחמן הערה:. פפטידים קצרים מאוד, שאינם נשמרים במסנן 18 C, עובר בזרימה דרך שנטען ישירות על פחמן עצה, אשר בדרך כלל לוכדת אותם. StageTips SCX יכול להעשיר פפטידים ספציפיים, כגון H3 פפטיד (3-8), לא נשמר ביעילות על ידי כרומטוגרפיה שלב מהופך.
      8. טען 50% מפפטידים על "StageTip הכריך" 18 C / פחמן ו50% על StageTips SCX. Elute מהם טיפים 18 C / פחמן באמצעות 80%% ACN/0.5 ac אצטיתid ומטיפי SCX עם 5% אמוניום הידרוקסיד (NH 4 OH) מתנול / 30%. לאחר פפטידים lyophilization, resuspend ב 0.1% FA ולנתח על ידי LC-MS/MS.
    2. עיכול בג'ל של חלבוני immunopurified
      עיכול בג'ל של חלבונים מתבצע כ22 שתוארו קודם לכן, עם שינויים קלים.
      1. חותכים כל מסלול בעשר פרוסות (איור 3D) וכל פרוסה בקוביות קטנות של 1 מ"מ 3. De-להכתים את חתיכות ג'ל עם 50 אתנול 4 HCO 3/50% מ"מ NH ולהוסיף אתנול מוחלט לכווץ את ג'לי. חזור על פעולה עד ג'לי לחלוטין דה צבעונית.
      2. הוסף חוצץ הפחתה (לוח 1) לחתיכות ג'ל לשעה 1 ב56 מעלות צלזיוס, ואחריו התוספת של חיץ אלקילציה (טבלה 1) ל45 דקות בטמפרטורת חדר, בחושך. לשטוף ולייבש את חלקי ג'ל בצנטריפוגות ואקום.
      3. רעננותם חתיכות ג'ל עם ng 12.5 קר כקרח / סול טריפסין μlution ב50 מ"מ NH 4 HCO 3 ולדגור על קרח עד להחזרת נוזלים של חתיכות ג'ל מלאים. הסר טריפסין עודף.
      4. הוסף 50 מ"מ NH 4 HCO 3 כדי לכסות את חתיכות ג'ל לחלוטין. דגירה הלילה בשעה 37 ° C.
      5. אסוף את החלק הנוזלי. הוסף את חיץ החילוץ (טבלת 1) לחתיכות ג'ל; דגירה עם תסיסה חזקה ל10 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על פעולה פעמיים.
      6. דגירה חתיכות ג'ל בACN עבור 10 דקות עם תסיסה חזקה. חזור על פעולה פעמיים וברכה כל supernatants.
      7. Lyophilize פפטידים. Resuspend פפטידים מיובשים ב0.5%% acid/0.1 אצטית TFA.
      8. Desalt ולהתרכז פפטידים על שלב התהפך C 18 StageTip, כפי שתואר 26, 27.
      9. Elute פפטידים מStageTip 18 C באמצעות 80%% ACN/0.5 חומצה אצטית. הסר את הממס האורגני ידי מתאדה בצנטריפוגה ואקום וresuspend פפטידים ב0.1% FA (בדרך כלל 5-10 &181 #; ליטר), כאשר מוכן לניתוח הטרשת הנפוצה.

    5. LC-MS ניתוח

    1. ניתוח כרומטוגרפיה נוזלי
      1. לארוז עמודת האנליטיות ב15 סנטימטר פולט סיליקה התמזגו (75 מיקרומטר קוטר פנימי, 350 מיקרומטר קוטר חיצוני), תוך שימוש הפוך שלב (RP) C 18, 3 שרף מיקרומטר במתנול, בלחץ מתמיד הליום (50 בר) באמצעות מכשיר פצצה-מטעין, כפי שתואר לעיל 28.
      2. כמה הפולט ארוז (עמודת RP 18 C) ישירות ליציאה של שסתום 6 נמל HPLC באמצעות (25 מיקרומטר קוטר פנימי) ארוך 20 סנטימטר התמזגו סיליקה ללא שימוש לפני עמודה או מכשיר מפוצל.
      3. טען את פפטידים מתעכלים בC 18 עמודת RP בזרימת 500 NL / min שלב נייד (0.1% 5% ACN FA / DDH 2 O).
      4. לאחר טעינת מדגם, להפריד את פפטידים באמצעות מילויים הבאים:
        1. החל 0-40% שלב נייד B (0.1% ACN% FA/99DDH 2 O) בשעה 250 / דקות NL מעל 90 דקות ואחריו שיפוע של 40-60% ב 10 דקות ו60-80% מעל 5 דקות, עבור elution של פפטידים הנובעים מההיסטונים (ראו 2).
        2. החל 0-36% שלב נייד B ב 250 מעל 120 דקות NL / דקות ואחריו שיפוע של 36-60% ב 10 דקות ו60-80% מעל 5 דקות, עבור elution של פפטידים הנובעים מחלבונים immunopurified (ראה 3).
    2. ניתוח ספקטרומטריית המסה באמצעות LTQ-FT-ICR-Ultra ספקטרומטר המסה
      1. לפעול ברכישת נתונים תלויים מצב (DDA) כדי לעבור באופן אוטומטי בין MS ורכישת MSMS. ספקטרום סריקה מלא MS נרכש, בדרך כלל בטווח מ '/ z מ200-1,650, היא נרכשה עם R ברזולוציה = 100,000 ב 400 מ' / z. חמישה היונים אינטנסיביים ביותר (Top5) מבודדים לפיצול במלכודת היונים ליניארי באמצעות ניתוק הנגרם התנגשות (CID) בשווי יעד של 5,000.
      2. השתמש בפרמטרים המפורטים בטבלה 2 עבורr קובץ הרכישה "כוונון".
      3. הגדר את הגדרות רכישה סטנדרטיות כפי שמופיע בטבלה 2.

    6. ניתוח נתונים

    1. תווית כימות ללא שינויי היסטון שיתוף מועשרים בתחומים הכרומטין
      1. להמיר את קבצי גלם שנרכש לקבצי MGF באמצעות תוכנת Raw2msm (גרסה 1.10) 29.
      2. חיפוש שינויי היסטון באמצעות קמע Deamon (גרסה 2.2.2), הגדרת הפרמטרים שתוארו בטבלה 3.
      3. ברשימת פפטיד פלט הקמע, להסיר פפטידים עם ציון נמוך מ 15 או עם יותר מ -5 PTMs המשוער 29 הערה:. עבור כל זהות פפטיד יחידה, בחר את הפפטיד עם הציון הגבוה ביותר הקמע ולסנן את כל פפטידים מיותרים האחרים עם אותו ID .
      4. לבנות chromatograms חילוץ יון (XIC) לכל מבשר המתאים לכל פפטידים שונה, based על הערך מ '/ z, באמצעות QualBrowser. לחשב את השטח מתחת לעקומה (AUC) עבור כל שיא (איור 2 א).
      5. לאמת את כל הפפטידים שזוהו המכילים שינויים על ידי בדיקה ויזואלית של ספקטרום MS / MS באמצעות QualBrowser (איור 2).
      6. לחשב את השפע היחסי עבור כל פפטיד שונה. לחשב את ההעשרה היחסית של כל שינוי בחומר שבב עורך הערה:. שפע יחסי מחושב כיחס שבין AUC של כל פפטיד הותאם ספציפי על הסכום של AUC של כל הצורות שונה וללא שינוי של אותו פפטיד, ואילו ביחס העשרה כיחס של השפע היחסי של שינוי המסוים בשבב על הקלט (איור 2 ג).
    2. ניתוח כמותי של חלבוני proteomic משותפים הקשורים בתחומי הכרומטין
      1. לחלבוני זיהוי וכימות להשתמש בחבילת MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) 30. הגדר את מנוע החיפוש המובנה של "אנדרומדה" באמצעות AndromedaConfig.exe יום 31 ולהגדיר את הפרמטרים החיפוש מפורטים בטבלה 3.
    3. מבחן התאגדות
      1. להעריך את מידת שילוב של חומצות אמינו כבדות לחלבונים שבכותרת כבד קלט הכרומטין, באמצעות תוכנת MaxQuant, כדלקמן:
        1. הגדר את הפרמטרים כפי שמתואר ב6.2 אבל השבתת האפשרות מחדש לכמת.
        2. לחשב את אחוז התאגדות החלת הנוסחה הבאה ליחסי פפטיד לא יתירים:. התאגדות (%) = יחס / יחס (H / L) (H / L) + 1 × 100 (איור 3) הערה: קבל רק אם התאגדות> 95 %.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    immunoprecipitation הכרומטין היא טכניקה רבת עוצמה המשמשת לפרופיל הלוקליזציה של חלבון או שינוי היסטון לאורך הגנום. במקבילת פרוטאומיקה, שבב ואחריו פרוטאומיקה מבוססת MS לזהות איכותי וכמותית hPTMs, גרסאות היסטון ומחייב חלבוני הכרומטין שimmunoprecipitated יחד עם השינוי או חלבון של עניין, המשמש כ" פיתיון ". בגישת N-ChroP, שתואר באיור 1 א ', שבב מקורי, שבו הכרומטין מתעכל עם MNase (איור 1), משמש כקלט לטהר מתפזורת הכרומטין תחום פונקציונלי שונה. הכרומטין מתעכל המועשר במונה nucleosomes הוא הודגרו עם נוגדן ספציפי וחלבוני immunopurified מופרדים על ידי-SDS. בדוגמא מאוירת, H3K9me3, סמן של הכרומטין השקט 32,33, משמש כדי להגדיר את הגישה. הבחירה מתבססת על העובדה ששני תפקידיה הפונקציונליים כמוכן חלק מinteractors חלבונה מתוארים היטב. יתר על כן, נוגדנים ספציפיים מאוד ויעילים מותאמים לשבב נגיש 34, כפי שאושרו גם על ידי בדיקה ויזואלית של ג'ל Coomassie, שם הנוקלאוזום שלם, עם ההיסטונים הליבה בstoichiometry הנכון, מועשר בכמויות מתאימות ל1D MS (איור ).

    ההשוואה בין כמות H3K9me3 הווה בזרימה דרך (FT) והקלט (IN) מצביעה על כך שכ -50% מהאזור של עניין immunopurified, לא כולל את הסיכון של הטיה בשל ההעשרה של תת אוכלוסייה של קטין הכרומטין (תרשים 1C). הטרשת הנפוצה היא מועסק לאפיין PTMs שיתוף קשור בתוך nucleosomes המועשר: כל היסטון ליבה מתעכל באמצעות פרוטוקול נועד אד הוק על מנת להשיג "Arg-C כמו" עיכול, בג'ל polyacrylamide. למעשה, מצד אחד Arg-C הוא פרוטאז הטוב ביותר עבור ניתוח MS של hPTMs בecause היא מייצרת פפטידים באורך אופטימלי; מצד השני, זה לא לדבוק ביעילות בג'ל. כדי להתגבר על מגבלה זו, הפרוטוקול המותאם שלנו מנצל את אלקילציה הכימית של ליזין הושגה על ידי דוגרים להקות ג'ל היסטון עם deuterated (ד '6) אנהידריד-אצטית, ואחרי עיכול טריפסין. מאז טריפסין לא לדבוק lysines 3-D acetylated, מחקה תערובת פפטידים וכתוצאה מכך "Arg-C כמו" דפוס (איור 1E).

    התוספת של D מחצית 3-אצטיל ליזין מייצרת מסת דלתא חד משמעית של 45.0294 Daltons, להפלות בין acetylations ילידים הוסיף כימי ובטרשת נפוצה. יתר על כן, D-3 acetylation מציע שני יתרונות נוספים המקל על ההבחנה של פפטידים שונה isobaric: ראשון, אלקילציה מתרחשת רק בlysines ללא שינוי ו- מפוגלי מונו, אבל לא על שאריות di-ותלת מפוגלות-; כמו פפטידים שונה כגון נושאים את אותו טוטמספר אל של שינויים אבל בהסדרים שונים מעוצבים באופן דיפרנציאלי על ידי קבוצה נפרדת של D קבוצות 3-אצטיל המייצרות משמרות מ '/ z חד משמעיות. שנית, דפוסים ברורים של D 3-אלקילציה לגרום פעמים שמירה מעט שונות בכרומטוגרפיה נוזלית בעמודה שלב הפוכה, אשר יוצרת רמה נוספת של הפרדה לפפטידים שונה isobaric 21.

    לאחר האימות של כל hPTMs ידי בדיקה ידנית של ספקטרום MS / MS המקביל (איור 2), הכימות ללא תווית מושגת בשני שלבים: ראשית, אנו מחשבים את השפע היחסי של כל שינוי באמצעות עוצמת האות של מין ללא שינוי והותאם לפפטיד המקביל, נמדד באמצעות חישוב chromatograms חילוץ יון (XIC) (איור 2 א ו 2 ג, פנל עליון); שני, ההעשרה היחסית מוערכת כיחס שבין השפע היחסי של כל modification בoctamer שבב אד והשפע היחסי המתאים מהקלט (איור 2C, פנל תחתון). הניתוח של H3 (9-17) פפטיד מציג את העשרת di-וK9-מפוגל תלת, עם דלדול מקביל צורות ללא שינוי ומוניו מפוגלים (איור 2 ג). עם זה תוצאות ביקורת חיובית כמו לנוגדן ספציפי, ניתן להעריך את שיתוף העמותה או דלדול של כל שינויים האחרים, גם ברמת התוך המולקולרית באותו H3 והן ברמה הבין המולקולרית, על ההיסטונים מועשרים שותף אחרים בתוך אותו הנוקלאוזום. זה מאפשר ההקרנה של hPTMs צולב שיחות בתוך תחומי H3K9me3, מה שנקרא "modificome heterochromatin" (איור 2 ד): ההעשרה המשמעותית של סמנים ידועים הקשורים להשתקת גנים, עם דלדול המקביל של סמנים מקושרים עם הפעלת גן הוא ציינה . בנוסף, עמותות רומן מזוהות כגון העשרת H3K18me1.

    למסך לכל חלבוני שיתוף שיוך בתוך heterochromatin, שבב crosslinking הקלאסי בשילוב עם SILAC (איזוטופ לייצור תוויות יציבים על ידי חומצות אמינו בתרבית תאים) (איור 3 א). בניסוי SILAC, ליזין וארגינין (צורה קלה) מוחלפים באנלוגים שלהם שכותרתו isotopically (טופס כבד) במדיום התרבית. על התאים גדלו ושכפול בשני אור ומדיה כבדה, שתי חומצות אמינו המקודד את האיזוטופ באופן דיפרנציאלי משולבות מטבולית לחלבונים, יצירת צורות קלות וכבדות של חלבונים, בהתאמה, שניתן להבחין על ידי MS, בשל Δmass ספציפי. לפני שמתחיל ניסוי SILAC בקנה מידה גדולה, יעילות התיוג מוערכת, חישוב רמת ההתאגדות, הנמדדת כאחוז שבריר של פפטידים כבדים לעומת הסכום כבד והקלים אלה, מצא במדגם שכותרתו רק כבדה. התאגדות עדיפה על 95% עבור שני ארגינין הכבד והואליזין Avy נדרש לכימות מדויק של חלבון (איור 3 ב). לאחר crosslinking של תאים כבדים וקלים, הכרומטין הוא מקוטע על ידי sonication. SILAC משמש יחד עם assay תחרות באמצעות קיפול עודף של פפטיד מסיס H3 (QTAR K STGG) הנושאת תלת מתילציה על K9 כדי להפלות interactors H3K9me3 הספציפי מהרקע. פפטיד המסיסים מתווסף עודף לאחד משני ניסויי שבב SILAC, שם הוא מרווה את יכולת הקשירה של הנוגדן, ובכך "מתחרה החוצה" רוב H3K9me3-nucleosomes ובהתאם לכך, כל interactors הספציפי. בערוץ SILAC האחר, פפטיד המתחרה לא הוסיף לשבב וimmunoprecipitation מתקיימת כרגיל. ניסויי SILAC תחרות מבוצעים בדרך כלל בשני עותקים שבנקראו "קדימה" ואת "הפוך" פורמטים, שבו התחרות עם פפטיד מסיס העודף משיטת הדואר כבד (H) לדגימות הכרומטין אור (L). התוצאה היא קריאות הפוכות משלימות יחס SILAC, המשמשות להבחנה אמיתית מקלסרים נוקבים: החלבונים מועשרים במיוחד נמצאים עם עוצמה גבוהה יותר בצורה הכבדה בהשוואה לצורת האור (H יחס חלבון / L> 1) בניסוי שבו עודף פפטיד מתווסף לערוץ האור (קדימה) (איור 4 א, ​​פנל עליון); מגמה הפוכה (H יחס חלבון / L <1) הוא ציינה בהעתק ההפוך (איור 4A, פנל תחתון). חלבונים בעוצמה בכבדה וקלה צורה הפוכה שהם דומים בשני קדימה וניסויים לייצר יחס קרוב קבועה ל1 והן מסווגים כרקע (איור 4).

    הבחירה של הקפל העודף האופטימלי לפפטיד המסיסים היא חשובה וחייבת להיות מכוון באופן מדויק. בדרך כלל, אנו קובעים את שיעור הנוגדן לפפטיד הנכון ביצוע USI assay תחרותng דילולים סדרתי של הפפטיד עודף והשוואה לרמה של (hPTM / החלבון) "פיתיון" בין שבב השליטה החיובי, שבו פפטיד לא הוסיף, ושבבי תחרות סידורי השונים, על ידי כתם מערבי או טרשת נפוצה. באופן כללי, פפטיד הקיפול העודף האופטימלי מפחית של כ -90% כמות hPTM / החלבון בחומר immunoprecipitated. למעשה, מצד אחד, גדול יותר יחס החלבון שהושג, גבוה יותר את כוח האפליה של SILAC; לעומת זאת, הרוויה מוגזמת על ידי פפטיד רשאית לפנות לחלוטין קלסרים הספציפיים מהנוגדנים, ובכך מוביל ליחסים חסרים H / L לכימות וניתוח סטטיסטי. לנוגדן H3K9me3 הגדרנו את הפרופורציה הנכונה על ידי מדידת יחס H / L לQTARK (me3) STGG פפטיד, במבחן תחרות שנערך בקדימה הקמנו ואנחנו לקחנו את הערך הזה כמדד ליעילות התחרות (איור 3 ג ).

    הצומת של קדימהd הפוך ניסויי X-שבב מוביל לזיהוי של 635 חלבונים, בהווה בשני הניסויים ולכמת עם לפחות 2 סעיפי יחס. יומן העלילה 2 של יחסי H / L שלהם מייצגת את מה שנקרא "heterochromatome" (איור 4C), שבו interactors H3K9me3 האמיתי מזוהים באופן חד משמעי כחלבונים המצויים בתוך 40% העליונים של הפצות יחס חלבונים (עליון ברבע ימני של עלילת הפיזור ואיור 4D).

    איור 1
    איור 1: מבט סכמטי של זרימת העבודה N-ChroP) התכנית של שבב מקורי בשילוב עם ניתוח MS.. הכרומטין מהתאים מתעכל עם MNase והשבריר המועשר במונה nucleosomes (S1) הוא immunoprecipitated באמצעות אנטי H3נוגדן K9me3. חלבוני Immunopurified מופרדים על ידי SDS-PAGE וההיסטונים ליבה נמצאים בעם פרוטוקול אד הוק לחקות עיכול Arg-C-מתעכל ג'ל. פפטידים מנותחות nano-LC-MS/MS. PTMs היסטון מזוהה, אומת על ידי בדיקה ידנית של MS / MS ספקטרום ולכמת ב ') מבחן MNase בקנה מידה קטנה:. DNA נפתר על 1% agarose ג'ל לאחר עיכול הכרומטין עם MNase בלשגות זמן שונה (פנל משמאל); עיכול MNase בקנה מידה גדולה:. DNA נפתר על 1% agarose ג'ל לאחר 60 דקות של עיכול הכרומטין MNase ואחרי הפרידה של בר S1, המכיל מונו nucleosomes מסיעת S2, המכיל פולי-nucleosomes (פנל מימין) C) הערכת ההעשרה / דלדול ללא שינוי, מונו, די, וK9-מפוגל תלת בזרימה דרך (FT) בהשוואה לקלט (IN). ההיסטוגרמה מייצגת ± SEM הממוצע משלושה ניסויים עצמאיים עבור כל שינוי. D)-SDS של קלט הכרומטין ושיתוף חיסוני חלבונים מטוהרים: ליבת ההיסטונים H3, H4, H2A וH2B נראה מסביב ומתחת ללהקת 17kDa, עם H3 ו-H2B שיתוף נודדות (ריבועים שחורים) E) כל היסטון ליבה משני nucleosomes וקלט immunoprecipitated הוא כימי alkylated באמצעות deuterated (. ד 6)-אצטית-אנהידריד לפני טריפסין טיפול, על מנת לקבל "Arg-C כמו" בעיכול ג'ל. אנהידריד 6 אצטית D מגיב עם קבוצת אמין אפסילון של lysines ללא שינוי ו- מפוגלי מונו אבל לא עם, lysines תלת מפוגל וacetylated-המפוגל די. כתוצאה מכך, הפעילות האנזימטית של טריפסין חסום על כל יזין acetylated הילידים הכימי ו, ובכך לייצר "Arg-C כמו" דפוס עיכול. נתון זה שונה מ21, תוך שימוש באיור 1, איור S1 ואיור S5 כנקודת התייחסות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

    "עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 2
    איור 2:. ניתוח ספקטרומטריית המסה של "modificome" H3K9me3) ספקטרום המוני הוגדל וchromatograms חילוץ יון (XIC) נבנה בערך מ '/ z המקביל של 2 לגבות + ללא שינוי, מונו, די, ותלת מפוגל K9 בH3 פפטיד (9-17), הן עבור דגימות קלט ושבב. ב ') נציג MS / MS ספקטרום באמצעות פיצול CID. הסדרה ב יון ו-y-ion תאפשר להגדיר הרצף של H3 פפטיד (9-17) ולמקם באופן ספציפי בשלושה תחומי מתילציה על K9 שאריות. C) שפע יחסי של הדרגות השונות של מתילציה על K9 בH3 ( 9-17) פפטיד, שהוערך על ידי חלוקת השטח מתחת לעקומה (AUC) של כל פפטיד שונה בסכום של האזורים המתאימים לכל נצפה unmodifi אד וצורות שונה של פפטיד ש, בoctamer הקלט ושבב ed. ההיסטוגרמה מייצגת את הממוצע ± SEM משלושה ניסויים עצמאיים עבור כל שינוי (פנל עליון). העשרה היחסית של methylations K9 בH3 פפטיד (9-17). ההעשרה מתבטאת כיומן 2 יחס בין השפע היחסי של כל מתילציה בoctamer שבב ed כמו להשוות קלט. Heatmap ההיסטוגרמה מייצגת את הממוצעים ± SEM משלושה ניסויים עצמאיים (פנל תחתון). ד ') המסכמת את ההעשרה של כל hPTMs שיתוף שיוך זוהה על היסטון H3, H4 וH2A. כל שורה מתאימה לשינוי שונה (nd לא מזוהה שינויים). נתון זה שונה מ21, תוך שימוש באיור 1, איור 2, איור 3 ואיור S10 כנקודת התייחסות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

    "תמיד"> איור 3
    איור 3: תצוגה סכמטית של X-ChroP זרימת עבודה) תכנית של crosslinking שבב בשילוב עם ניתוח MS.. תאים שגודלו באור והדפסה כבדה קבועים עם תשומות פורמלדהיד והכרומטין הן מקוטעים על ידי sonication ליצור שברי DNA. בקדימה להגדיר, הכרומטין שכותרתו הכבד sonicated הוא immunoprecipitated באמצעות נוגדן אנטי H3K9me3 תוך הכרומטין כותרת האור מודגרות עם אותו הנוגדן רווי בקיפול עודף של פפטיד H3 מסיס נושאות K9me3. חלבוני immunoprecipitated מכבד וקל chromatins הם אספו, חילוץ ומופרדים על ידי-SDS. יעיל חלבונים מתעכלים עם טריפסין ופפטידים מנותחות nano-LC-MS/MS. B) של תיוג SILAC מנוטר חישוב השילוב של יס הכבדine (Lys8) וארגינין (Arg10) לחלבונים. בעלילה, החציון של התפלגות צפיפות פפטידים ליזין וארגינין הוא שווה ל0.974 (קו ירוק) ו.964 (קו אדום), בהתאמה. C) ספקטרום המוני הוגדל בערך מ '/ z המקביל של 2 לגבות + תלת מפוגל K9 בH3 פפטיד (9-17), הן לאור וצורות כבדות, בקלט וoctamer שבב ed. בעוד שבקלט העוצמות הכבד וקל פפטיד הן קרובים ל -1, בקדימה SILAC השבב, האינטנסיביות של פפטיד האור היא הרבה יותר נמוכה מזו של עמיתו הכבד, ובכך מצביעה על תחרות יעילה. D)-SDS של אור (L) וכבד (H) שכותרתו קלט הכרומטין וחומר immunoprecipitated המשותף: המסלול המתאים לחומר שבב אד נחתך בעשר פרוסות (קו שחור), בעוד שרק שתי פרוסות הקלט מנותחות לניתוח מבחן התאגדות ( קו כחול). נתון זה שונה מ21, באמצעות איור 4 ואיור S6 כמחדשפרנץ. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

    איור 4
    איור 4: ניתוח ספקטרומטריית המסה של "interactome" H3K9me3. א) ספקטרום מלא נציג מראה SILAC זוג המתאים לפפטידים וחלבונים מHP1 מאקרו-2A: יחסי H / L> 1 בניסוי (הפנלים העליונים קדימה), שיקוף של יחס H / L <1 בהעתק ההפוך (לוחות נמוכים), להדגים את ההעשרה מסוימת של החלבונים האלה בheterochromatin B) ספקטרום מלא עם נציג SILAC זוג מתאים לפפטיד מחלבון אחד ברקע:. יחסי H / L בקדימה לאחור משכפל הוא שווה ל 1 ג) חלבונים לכימות. הם distributאד בעלילה פיזור המבוססת על SILAC-היחסים שלהם בקדימה וניסויים הפוך (צירי X ו-Y, בהתאמה); קווים מקווקווים אדומים מייצגים 40% העליונים ו30% מיחס חלבון, כפי שצוין. יחסי חלבון D) הפצות מקלט (H / L מעורב 1:1) (שחור), קדימה (כחול) וההפוך (כתום) X-ChroP ניסויים; קווים מקווקווים אדומים מייצגים 40% העליונים של יחסי חלבון, כפי שנקבעו הפסקות כדי לבחור interactors האמיתי. נתון זה שונה מ21, באמצעות איור 5 כנקודת התייחסות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

    חיץ לסעיף 2 הרכב
    תמוגה הצפת סוכרוז 10%, 0.5 מ"מ EGTA pH 8.0, 15 mM NaCl, 60 מ"מ KCl, 15 HEPES מ"מ, 0.5% טריטון, 0.5 מ"מ PMSF, 1mm DTT, 5 מ"מ NAF, 5 מ"מ Na 3 4 VO, 5 מ"מ NaButyrate, 5 מ"ג / מיליליטר Aprotinin, 5 מ"ג / מיליליטר Pepstatin, 5 מ"ג / מיליליטר leupeptin
    כרית סוכרוז 2 סוכרוז גרם ב20 מיליליטר של הצפת תמוגה
    עיכול הצפת 0.32 M סוכרוז, 50 מ"מ טריס-HCl pH 7.6, 4 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ CaCl2, 0.1 מ"מ PMSF
    TE הצפת 10 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA
    דיאליזה הצפת 10 מ"מ טריס-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.5 מ"מ PMSF, 5 מ"מ NAF, 5 מ"מ Na 3 4 VO, 5 מ"מ NaButyrate, קוקטייל מעכבי פרוטאז
    שבב דילול מאגר 100 מ"מ טריס HCl pH 7.6, 100 מ"מ NaCl ו10 mM EDTA
    חסימת פתרון BSA 0.5% ב-PBS
    כביסה הצפת 50 מ"מ טריס-HCl pH 7.6,10 mM EDTA
    מעכבי פרוטאז קוקטייל מעכבי פרוטאז ללא EDTA, 0.5 מ"מ PMSF, 5 מ"מ NAF, 5 מ"מ Na3VO4, 5 מ"מ NaButyratדואר
    טוען הצפת טעינת צבע כתומה, 50% (v / v) גליצרול בH20
    חיץ לסעיף 3 הרכב
    תמוגה הצפת 50 HEPES מ"מ-KOH pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, גליצרול 10%, 0.5% NP-40, 0.25% Triton-100, 0.5 מ"מ PMSF, 5 מ"מ NAF, 5 מ"מ Na 3 4 VO, 5 מ"מ NaButyrate, 5 מ"ג / מיליליטר Aprotinin, 5 מ"ג / מיליליטר Pepstatin, 5 מ"ג / מיליליטר leupeptin
    כביסה הצפת 10 מ"מ טריס-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 מ"מ EGTA, 0.5 מ"מ PMSF, 5 מ"מ NAF, 5 מ"מ Na 3 4 VO, 5 מ"מ NaButyrate, 5 מ"ג / מיליליטר Aprotinin, 5 מ"ג / מיליליטר Pepstatin , 5 מ"ג / מיליליטר leupeptin
    שבב דגירה הצפת pH 10 מ"מ טריס-HCl 8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 מ"מ EGTA, 0.1% deoxycholate נתרן, 0.5% lauroylsarcoside נתרן, 0.5 מ"מ PMSF, 5 מ"מ NAF, 5 מ"מ Na 3 4 VO, 5 מ"מ NaButyrate, 5מ"ג / מיליליטר Aprotinin, 5 מ"ג / מיליליטר Pepstatin, 5 מ"ג / מיליליטר leupeptin
    כביסה הצפת 2 20 מ"מ טריס-HCl pH 7.6, 2 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton-100
    חיץ מדגם טוען pH 250 מ"מ Tri-HCl 8.8, ב-mercaptoethanol 0.5 M, 2% SDS
    חיץ לסעיף 4 הרכב
    אלקילציה הצפת 55 מ"מ iodoacetamide ב50 מ"מ NH 4 HCO 3
    הפחתת הצפת 10 מ"מ dithiothreitol ב50 מ"מ NH 4 HCO 3
    מיצוי מאגר 30% TFA ACN ו -3% בDDH 2 0

    טבלת 1. הרכב חוצץ.

    כוונון קובץ רכישה פרמטרים
    SCA המלא FTn ערך יעד הצטברות 1 x 10 6; זמן מילוי מרבי 1,000 אלפיות שני
    IT-MSN ערך יעד הצטברות 10 x 10 4; זמן מילוי מרבי 150 msec
    הגדרת רכישה פרמטרים
    מתח electrospray 2.4 ק
    נדן וזרימת גז עזר לא
    טמפרטורת נימי העברת יון 200 ° C
    הדרה דינמית עד 500 יונים מבשר ל60 שניות על MSMS
    רוחב המוני הדרה 10 עמודים לדקה
    אנרגיית התנגשות מנורמלת שימוש במצב הפעלה בפס רחב 35%
    ספי בחירת יון 100 ספירות
    q הפעלה 0.25
    Activזמן ation 30 msec

    טבלה 2. הגדרות טרשת נפוצה.

    חיפוש Mascor Deamon פרמטרים הערות
    מסד הנתונים תלוי על האורגניזם (כלומר לתאי הלה: מסד נתונים אנושיים, גרסת 3.68; 87,061 כניסות)
    אנזים Arg-C תדבק Arg-C בטרמינל C-מכל שאריות ארגינין
    שינויים משתנים אצטיל (K), חמצון (M), D-3 acetylation (K), מתיל-D 3 - אצטיל (K), דימתיל (k), trimethyl (K) אצטיל [42.010 דה], חמצון [15.995 דה], D3-acetylation [45.0294 דה], מתיל-D3-אצטיל [סכום של 14.016 דה ו45.0294 דה], דימתיל [28.031], trimethyl [42.046 דה]
    שסעים שלא נענו עד 2
    דיוק מסה של יוני ההורה בחיפוש 10 עמודים לדקה
    Mass-דיוק לCID MSMS 0.5 Da
    חיפוש MaxQuant פרמטרים הערות
    מסד הנתונים תלוי באורגניזם
    אנזים טריפסין / P דבק טריפסין בטרמינל C-מכל השאריות ליזין וארגינין. החיפוש מתבצע לוקח בחשבון את העובדה שהיעילות של טריפסין להידבק ליזין וארגינין מצטמצם כאשר חומצת אמינו הבאה היא פרולין (/ P).
    שינוי קבוע carbamidomethylation
    שינויים משתנים N-אצטיל (חלבון), חמצון (ז)
    שסעים שלא נענו עד 3
    פרמטרים לייבל lys8 וarg10
    amminoacid תווית מקסימלי 3 לטריפסין
    Mass-דיוק של יוני ההורה בחיפוש "אנדרומדה" הראשוני 20 עמודים לדקה
    דיוק מסה של יוני ההורה בחיפוש "אנדרומדה" העיקרי 6 עמודים לדקה
    Mass-דיוק לCID MSMS 0.5 דא (שש פסגות עליונה per100 Da)
    פפטיד שיעורי שווא גילוי (רוזוולט) 0.01
    חלבון שיעורי שווא גילוי (רוזוולט) 0.01 הגדרת רוזוולט לפפטיד וחלבונים ל0.01 אומרת ששני פפטידים והחלבונים שזוהו צפויים להכיל 1% מתוצאות חיוביות שגויות. ערך זה נאמד באמצעות מסד נתונים יעד דמה
    אה אחורי מקסימאליהסתברות ROR (PEP) 1 PEP הוא ההסתברות שפפטיד בודד הוא התאמה חיובית כוזבת. PEP שווה ל 1 בהגדרה שלך אומר שכל פפטידים יילקחו ללא קשר לPEP וכך הסינון מבוסס באופן בלעדי על רוזוולט.
    אורך הפפטיד מינימום 6
    מספר מינימאלי של פפטידים 2
    מספר מינימאלי של פפטידים ייחודיים 1
    רק באמצעות פפטידים ללא שינוי וחמצון (M) / אצטיל (חלבון N-Term) להפעיל את האופציה פפטידים עם שינויים צריכים בדרך כלל לא ייחשבו לכימות חלבון מאז השפע שלהם עשוי שלא לשקף את היחס של החלבון המתאים.
    ספירת יחס מינימאלית 1
    "משחק בין פועל" להפעיל את האופציה

    לוח 3. ניתוח נתונים.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    יש לנו לאחרונה תיארתי ChroP, אסטרטגיה כמותית לאפיון בקנה מידה גדולה של רכיבי החלבון של הכרומטין. ChroP משלב שתי גישות משלימות בשימוש בתחום אפיגנטיים, שבב וטרשת נפוצה, מרוויח מנקודתי החוזק שלהם ולהתגבר על המגבלות שלהם. שבב מצמידים את רצף עמוק (שבב Seq) מאפשר מיפוי הגנום של שינויי היסטון ברזולוציה של כמה nucleosomes 35. למרות יתרון לרגישות שלהם, מבחני מבוססי נוגדנים מוגבלים ביכולת שלהם להבחין בשינויים דומים ובלנתח את ההיבט קומבינטורית של קוד היסטון 36. מצד השני, בעוד MS מספק ניתוח מקיף ובלתי מוטה של hPTMs, ביחידים ובשילובים 9, זה עד כה פנה לניתוח של הכרומטין בתפזורת, עם חוסר הסוגר של מידע על דפוסי PTMs מוקד ספציפי. אנו מעסיקים גרסה שונה של שבב לבודד מבחינה תפקודיתתחומים שונים הכרומטין וספקטרומטריית מסה לאפיין את דפוסי PTM היסטון וחלבונים שאינם histonic במיוחד שיתוף מועשר.

    באמצעות N-ChroP, הניתוח של hPTMs שיתוף קשורים H3K9me3 חשף העשרה משמעותית של סמנים הקשורים הכרומטין השקט, ודלדול של שינויים הקשורים הכרומטין הפעיל. הסכם של תוצאות אלו עם מחקרים קודמים 37 הוכיח את החוסן של האסטרטגיה. ב X-ChroP של תחומים H3K9me3, החקירה מבוססת SILAC של חלבוני אינטראקציה-הכרומטין אישרה כמה interactors שתואר קודם לכן, ובכך מאמת את השיטה.

    ChroP מציג שני היבטים מקוריים עיקריים בביחס לאסטרטגיות כבר זמינות כדי לחקור את מרכיב proteomic של הכרומטין: למשל, את האפשרות לחשוף synergisms בין מולקולרי בין השינויים לקשט ההיסטונים ליבה שונים בתוך אותו מונו nucl ללא פגעeosome מטוהר על ידי N-שבב; שני את ההזדמנות להעריך את המידור הספציפי של גרסאות היסטון ותת היסטון מקשר. מאז החקירה של וריאנטים היסטון מוחזקת בחזרה על ידי חוסר של חומרים כימיים באיכות טובה (כלומר, נוגדנים), ChroP מתגלה ככלי הייחודי זמין על מנת להעריך את מיקומם ותפקיד פונקציונלי.

    מגבלה אחת של ChroP בה הנוכחי להגדיר שקרים בגישת פפטיד ממוקד ("מלמטה למעלה") המשמשת בטרשת נפוצה, עם ההיסטונים מתעכלים בפפטידים קצרים וכתוצאה מכך לירידת ערך באיתור הקישוריות למרחקים ארוכים בין שינויים. ככזה, נטיה של ChroP עם ניתוח MS "מלמטה למעלה" מאפשרת הערכה חלקית של ההיבט קומבינטורית של קוד היסטון. אנו חוזים כי יישומן של אסטרטגיות חלופיות MS, כגון "-Down למעלה התיכון ו" למיפוי hPTMs על פפטידים ארוכים יותר (> 20 אא) עד בחלבונים שלמים 38-40, יתגברהאיפוק הזה.

    בסך הכל, N-ו-X-ChroP משלים מאוד, עם האפשרות לנתח את המורכבות של מבנה הכרומטין בתחומים פונקציונלי שונים, עם רזולוציה של מונו לאוליגו nucleosomes. אנו צופים כי ChroP יהיה שימושי גם כדי לאפיין את ההרכב של אזורי הכרומטין מסומנים על ידי נוכחותם של חלבונים גרעיניים שאינם histonic הספציפיים, לדוגמא גורמי שעתוק (TFS). בנוסף, יכול להיות מועסק ChroP במחקרים פונקציונליים למפה הקומפוזיציה הדינמית של הכרומטין בלוקוסים ספציפיים על הפרעות שונות, למשל בעת הפעלת תעתיק הגלובלית. מסיבות אלה, ChroP מתגלה ככלי שימושי נוסף בארסנל של אסטרטגיות אנליטיות זמינות לנתח את נוף proteomic של הכרומטין.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

    Acknowledgments

    מחקר זה פורסם במקור בפרוטאומיקה הנייד מול. סולדי מ 'וBonaldi ט proteomic חקירת תחומים פונקציונליים הכרומטין חושף Synergisms הרומן בין ברור heterochromatin הרכיבים MCP. 2013; 12: 64-80. © האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. אנו מודים לרוברטה Noberini (האיטלקי מכון טכנולוגי ולIEO, איטליה) לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודת TB נתמכת על ידי מענקים מArmenise-הרווארד תכנית ג'ובאני קרן לפיתוח קריירה, האיטלקית האגודה לחקר הסרטן ומשרד בריאות האיטלקית. עבודת MS נתמכה על ידי מענק FIRC.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM  Lonza BE12-614F
    FBS Invitrogen 10270-106
    SILAC DMEM M-Medical FA30E15086
    Dialyzed FBS Invitrogen 26400-044
    Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) Sigma Aldrich L8662
    Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) Sigma Aldrich A6969
    Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) Sigma Aldrich 68041
    Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) Sigma Aldrich 608033
    Micrococcal Nuclease Roche 10 107 921 001
    Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 132 001
    Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length Spectrumlabs 132720
    QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28104
    Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade Abcam ab8898
    Histone H3 peptide tri-methyl K9  Abcam ab1773
    Dynabeads Protein G Invitrogen 100.04D
    NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel  Invitrogen NP0335BOX
    Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
    LDS Sample Buffer Invitrogen NP0007
    Formaldheyde Sigma Aldrich F8775
    Aceti anhydride-d6 Sigma Aldrich 175641-1G
    Name Company Catalog Number Comments
    Formic Acid Sigma Aldrich 94318-50ML-F
    Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline Sigma Aldrich I6125
    DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich 43815
    Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) Promega V5113
    Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 Microcolumn Srl FS360-75-8-N-5-C15
    ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C Dr. Maisch GmbH r13.aq.
    Carbon extraction disk, 47 mm Agilent Technologies 12145040
    Cation extraction disk Agilent Technologies 66889-U

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
    2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
    3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
    4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
    5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
    6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
    7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
    8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
    9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
    10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
    11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
    12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
    13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
    14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
    15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
    16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
    17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
    18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
    19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
    20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
    21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
    22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
    23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
    24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
    25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
    26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
    27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
    28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
    29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
    30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
    31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
    32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
    33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
    34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
    35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
    36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
    37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
    38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
    39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
    40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

    Tags

    ביוכימיה גיליון 86 הכרומטין שינויי היסטון לאחר translational (hPTMs) אפיגנטיקה ספקטרומטריית מסה פרוטאומיקה SILAC immunoprecipitation הכרומטין וריאנטים היסטון chromatome שיחות צולבות hPTMs
    גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP… More

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin. J. Vis. Exp. (86), e51220, doi:10.3791/51220 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter