Summary
Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l'approccio ChroP permette di sezionare il composito dell'architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.
Abstract
Cromatina è un complesso nucleoproteina altamente dinamico fatto di DNA e proteine che controlla vari processi DNA-dipendente. Struttura della cromatina e la funzione in regioni specifiche è regolato dalla arricchimento locale della istone post-traslazionale modifiche (hPTMs) e varianti, proteine della cromatina vincolanti, compresi fattori di trascrizione, e la metilazione del DNA. La caratterizzazione proteomica di composizione cromatina in corrispondenza di zone funzionali distinti è stata finora ostacolata dalla mancanza di protocolli efficienti per arricchire tali domini alla purezza e quantità appropriata per la successiva analisi approfondita da spettrometria di massa (MS). Descriviamo qui una strategia proteomica cromatina di nuova concezione, denominato ChroP (cromatografia matin P roteomics), per cui un immunoprecipitazione della cromatina preparativa è utilizzato per isolare le regioni della cromatina distinte le cui caratteristiche, in termini di hPTMs, varianti e co-associati proteine non istoniche, sono analizzati da MS. Illustriamo luire la creazione di ChroP per l'arricchimento e l'analisi delle regioni heterochromatic trascrizionalmente silenti, caratterizzato dalla presenza di tri-metilazione della lisina 9 su istone H3. I risultati ottenuti dimostrano il potenziale di ChroP in fondo caratterizzare il proteoma eterocromatina e dimostrare come una strategia analitica potente per comprendere come i determinanti proteici distinti di cromatina interagiscono e sinergizzare stabilire configurazioni strutturali e funzionali specifici locus.
Introduction
Cromatina è un complesso nucleoproteina altamente dinamico che è coinvolto come modello primario per tutti i processi di DNA-mediata. Il nucleosoma è l'unità ripetuta di base della cromatina e costituito da un nucleo octameric proteica contenente due molecole di ciascun istone H2A canonica, H2B, H3 e H4, attorno al quale 147 bp di DNA sono avvolte 1,2. Tutti gli istoni fondamentali sono strutturati come un dominio globulare e flessibile N-terminale "coda" che sporge al di fuori del nucleosoma. Uno dei principali meccanismi di regolazione della struttura della cromatina e la dinamica si basa su covalenti modificazioni post-traduzionali (PTM), che si verificano principalmente sulla N-terminali degli istoni 3,4. Modificazioni degli istoni possono funzionare alterando la struttura superiore ordine cromatina, cambiando contatti tra istoni-DNA o tra nucleosomi, e controllando così l'accessibilità di DNA-binding proteine (meccanismi cis), o agendo come DockInSiti g di proteine regolatrici, sia come unità singole o incorporati in complessi multimerici. Tali proteine regolatrici possono esercitare la loro funzione in modi diversi: modulando direttamente l'espressione genica (pe proteine TAF), o alterando il posizionamento nucleosoma (cioè cromatina rimodellamento complessi) o modificando altri residui istoni (ad esempio proteine con metil-transferasi o acetil- attività transferasi) (meccanismi trans) 5. L'osservazione che distinto PTM modelli cluster alla specifica loci cromatina portato all'elaborazione della ipotesi che diverse modifiche al sito di distinte possono sinergizzare per generare un codice molecolare mediare lo stato funzionale del DNA sottostante. Il "codice dell'istone ipotesi" ha ottenuto grandi consensi negli anni, ma la sua verifica sperimentale è stata frenata da limiti tecnici 6,7.
Proteomica basati su spettrometria di massa (MS) è emerso come unpotente strumento per mappare i modelli modificazione degli istoni e caratterizzare-cromatina proteine che legano 8. MS rileva un cambiamento come Δmass specifico tra la massa sperimentale e teorica di un peptide. A livello di singoli istoni, MS fornisce un metodo imparziale e completa per mappare PTM, consentendo l'individuazione di nuove modifiche e il loro concatenamento rivelando tra loro 9-14.
Negli ultimi anni, una serie di strategie sono state sviluppate per sezionare la composizione proteomica di cromatina, compresa la caratterizzazione della intatte cromosomi mitotici 15, l'identificazione di solubili Hptm-binding proteins 16-18 e l'isolamento e l'analisi di specifiche regioni della cromatina (ossia telomeri) 19,20. Tuttavia, l'indagine delle sinergie specifico locus tra PTM degli istoni, le varianti, e proteine della cromatina associate è ancora incompleto. Qui, descriviamo un nuovo approccio, denominato ChroP (CHRO matin P roteomics) 21, che abbiamo sviluppato per caratterizzare in modo efficiente i domini di cromatina funzionalmente distinte. Questo approccio si adatta immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), un protocollo ben consolidata utilizzati nella ricerca epigenetica, per l'efficace analisi proteomica basata su MS del campione arricchito. Abbiamo sviluppato due protocolli diversi, a seconda del tipo di cromatina utilizzato come ingresso e la domanda indirizzata da MS; in particolare: 1) circuito integrato di unfixed cromatina nativa digerito con MNase è impiegato per purificare mono-nucleosomi ed a sezionare le hPTMs co-associano (N-ChroP); 2) circuito integrato di cromatina reticolato frammentata mediante sonicazione è usato in combinazione con una strategia basata intergenomica SILAC-caratterizzare tutti co-arricchimento proteine (X-ChroP) vincolante cromatina. Illustriamo qui la combinazione di N-e X-ChroP per l'arricchimento e lo studio eterocromatina, utilizzando H3K9me3 come esca per i passi immunoprecipitazione. L'uso di ChroP può essere estesostudiare sia le regioni distinte su cromatina, o cambiamenti nella composizione della cromatina all'interno della stessa regione durante la transizione a uno stato funzionale diversa, aprendo così la strada a varie applicazioni in epigenetica.
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Protocol
1. Colture Cellulari
- Mezzo standard per ChIP nativo
- Crescere cellule HeLa in modificata medio Dulbecco di Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 1% glutammina, 1% Pen / Strep e 10 mM HEPES pH 7.5.
- Etichettatura SILAC di reticolazione ChIP
- Crescere cellule HeLa in SILAC DMEM, impoverito di lisina e arginina, integrati con il 10% dializzato FBS, 1% glutammina, 1% Pen / Strep, 10 mM HEPES pH 7.5 e sia la luce L-lisina (Lys 0) e L- arginina (Arg 0) o loro omologhi pesanti, L-lisina (Lys 8) e L-arginina (Arg 10) (Tabella Materials), alle concentrazioni finali di 73 mg / L e 42 mg / L, rispettivamente.
- Crescere le cellule per un massimo di otto generazioni di SILAC medio per garantire la completa aminoacidi isotopi codificato incorporazione. Passare cellule ogni due giorni, quando raggiungono una densità di 1,0-1,5 x 10 6 cellule / ml, li semina in aconcentration di 3 x 10 5 cellule / ml.
- Valutare la crescita delle cellule e la vitalità in SILAC medio di individuare ogni possibile alterazione dalla fisiologia che possono derivare dalla composizione più poveri del mezzo SILAC; per fare questo:
- Ispezionare visivamente le cellule morfologia al microscopio ogni giorno durante l'etichettatura.
- Contare le celle e le curve di crescita trama di cellule che crescono in SILAC contro medie standard.
2. Native immunoprecipitazione della cromatina (N-Chip)
- Preparazione Nuclei di cellule in coltura
- Utilizzare 1-2 x 10 8 cellule senza etichetta HeLaS3 per esperimento. Celle di raccolta, rendono aliquota di 50 x 10 6 cellule in 50 ml provette e centrifugare a 340 xg per 10 min a 4 ° C, lavarli con PBS ghiacciato.
- Risospendere ogni pellet cellulare in 8 ml di tampone di lisi (Tabella 1) e incubare per 10 min a 4 ° C su una ruota girevole. Versare carefully ciascun lisato cellulare su un cuscino di saccarosio (Tabella 1) e centrifugare in un rotore oscillante, a 3.270 xg per 20 min a 4 ° C, per separare nuclei di citoplasma.
- Eliminare surnatanti, tenere pellets nucleari e lavarli due volte in PBS freddo per centrifugazione, scartare il surnatante ad ogni lavaggio.
- Micrococcica Nuclease (MNase) digestione (piccola scala) e controllo della qualità della cromatina dopo la digestione
- Risospendere il pellet nucleare lavato in 1 ml Digestion Buffer (Tabella 1); dividere in due aliquote di 500 microlitri e tenere in ghiaccio.
- Misurare la densità ottica (OD) a 260 nm di una aliquota, diluito 1:200 in 0,2% sodio dodecil solfato (SDS). Nota: OD = 1 corrisponde a circa 50 pg / ml di DNA cromatina. Tipicamente, partendo da 2 x 10 8 cellule, l'OD è nell'intervallo 40-60.
- Prendere 1% di nuclei, aggiungere MNase enzima ad una concentrazione finale di 0.005 U di enzima / ml di nuclei e incubare a 37 ° C per diversi ritardi di tempo (0, 10, 20, 40, 60 min).
- Ad ogni punto di tempo, raccogliere 4 ml di nuclei digeriti e aggiungere 1 mM EDTA per bloccare la reazione MNase. Tenere su ghiaccio.
- Estrarre campioni di DNA da kit di purificazione PCR e eluire in 50 microlitri TE Buffer (Tabella 1).
- Prelevare 20 ml di ogni campione di DNA, aggiungere 10 microlitri Loading Buffer (Tabella 1) e caricare i campioni 1% (w / v) gel di agarosio contenente bromuro di etidio, con pennarello PCR come controllo dimensioni.
- Controllare la digestione valutare la scala nucleosomi cromatina prodotto da MNase incubazione.
- Scegliere il tempo ottimale per la digestione, basato sulla diffusione della mono-nucleosomi nella preparazione. . Tipicamente per 0.005 U di enzima / ml di nuclei il momento ottimale di MNase digestione è 60 min (Figura 1B, pannello di sinistra) Nota: La MNase ottimale concentrazione / tempo di Digestion può essere regolato a seconda del tipo cellulare desiderato e dalla dimensione dei nucleosomi tratto.
- Large-scale/preparative MNase digestione e il recupero delle frazioni solubili cromatina
- Aggiungere a ciascuna aliquota (vedi 2.2.1) 5 microlitri MNase, corrispondente ad una concentrazione finale di 0,005 U di enzima / ml di nuclei; mescolare delicatamente e incubare a 37 ° C per 60 min (o in generale per l'intervallo di tempo ottimale, in base al test piccola scala).
- Aggiungere 1 mM EDTA per bloccare la reazione e tenere in ghiaccio. Pellet nuclei digeriti mediante centrifugazione a 7800 xga 4 ° C per 10 min. Trasferire il surnatante (frazione S1) in una nuova provetta e conservare a 4 ° C. Nota: S1 contiene la prima frazione solubile di cromatina, comprendente mono-nucleosomi. Aggiungere gli inibitori della proteasi (Tabella 1).
- Pellets sospendere nuovamente con cautela in 1 ml di Dialisi Buffer (Tabella 1) e Dializzare notte a 4 ° C (cut fuori del tubo di dialisi è 3,5 kDa), in 3 L Dialisi Buffer, mescolando costantemente mite. Raccogliere il materiale dializzato e centrifugare a 7800 xg per 10 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante (frazione S2) in una nuova provetta Eppendorf e conservare a 4 ° C. Nota: S2 comprende di-EPTA-nucleosomi, a seconda della digestione misura MNase.
- Controllo di qualità della cromatina prima immunoprecipitation
- Prelevare un 'aliquota corrispondente a 5 mg di S1 e S2 frazioni cromatina (quantificato misurando la densità ottica a 260 nm in un sistema NanoDrop). Estrarre il DNA da kit di purificazione PCR ed eluire in 50 microlitri TE Buffer (Tabella 1).
- Prelevare 20 ml di S1 e S2 DNA, mescolare con 10 microlitri Loading Buffer (Tabella 1) e caricarli su 1% (w / v) di gel di agarosio. Controllare la qualità e l'efficienza dei MNase digestione mediante ispezione visiva della scala nucleosomi. Nota: Frazione S1 è altamentearricchito in mono-nucleosomi, mentre frazione S2 contiene principalmente poli-nucleosomi (Figura 1B, pannello di destra).
- L'incubazione della cromatina con anticorpi
- Conservare a -20 ° C 50 ml di frazione S1 per la successiva analisi spettrometria di massa.
- Aggiungere 1 volume di ChIP tampone di diluizione (Tabella 1) per frazione S1.
- Aggiungere l'anticorpo contro il Hptm (o proteine) di interesse; Incubare per una notte su una ruota girevole a 4 ° C. Nota: In genere, utilizzare 10 mg a 20 mg di anticorpo per 2 x 10 8 cellule. Il rapporto ottimale tra quantità di anticorpo e il numero di partenza cellule deve essere attentamente impostata caso per caso, a seconda della abbondanza del Hptm / proteina usata come esca all'interno del campione e sull'efficienza anticorpo. Ottimizzazione è sperimentale, sulla base delle seguenti prove:
- Confrontare la quantità di Hptm / proteina di interesse tra ingresso e deflusso (FT,vedi 2.7.2) mediante Western Blot o MS per verificare che il immunoprecipitazione arricchisce una parte significativa della specifica regione cromatina. Nota: Questo è generalmente ottiene quando almeno il 50% delle esche Hptm / proteina è esaurita nel FT (Figura 1C) .
- Verificare che la proteina di interesse immunoprecipitato è rilevabile su SDS-PAGE gel, che assicura che una quantità sufficiente di materiale è disponibile per l'analisi MS Nota:. La presenza sul gel delle bande corrispondenti alle quattro istoni base alla stechiometria corretto indica che il nucleosoma intatto è stato immunoprecipitato da N-ChroP (Figura 1D). La mancanza di una corretta stechiometria è infatti indicativa di interruzione parziale / svolgimento del nucleosoma.
- In parallelo, preparare le sfere magnetiche proteina G accoppiati (vedi 2.6).
- Equilibration e blocco di proteine sfere magnetiche G-coupled
- Equilibrare 100 ml di proteina G-biglie magnetiche accoppiate liquami in Blocking Solution (Tabella 1), si lava tre volte e incubare durante la notte a 4 ° C su una ruota girevole. Nota: Seguendo la capacità di legame di perline, utilizzare 100 ml di slurry per 2-20 mg di anticorpo.
- Lavare le perline bloccate una volta con Blocking Solution e poi due volte con il circuito integrato tampone di diluizione (Tabella 1).
- Aggiungere 100 ml di perline bloccati al campione cromatina S1 e incubare su una ruota girevole a 4 ° C per 3 ore. Centrifugare a 340 xg per 1 minuto a girare giù il campione dal coperchio delle punte. Mettere in un rack magnetico per far sedimentare le perline.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta Eppendorf. Questo è il flusso attraverso (FT), cioè la frazione di cromatina che non legano all'anticorpo.
- Lavare le perline quattrovolte in lavaggio Buffer (Tabella 1) l'aumento della concentrazione di sale ad ogni lavaggio (75, 125 e NaCl 175 mm).
- Per eluire la cromatina immunoprecipitato, incubare le perline in 30 ml di LDS Sample Buffer, integrati con ditiotreitolo 50 mm (DTT) per 5 minuti a 70 ° C. Separare le proteine eluite su Bis-Tris acrilammide SDS-PAGE prefabbricati gel gradiente 4-12% e macchiare il gel con kit di colorazione Coomassie colloidale (Figura 1D).
3. Reticolazione immunoprecipitazione della cromatina (X-ChIP)
- La reticolazione di cellule con formaldeide
- Aggiungere 0,75% formaldeide alle cellule SILAC marcato, mescolare brevemente e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Estinguere la formaldeide con l'aggiunta di glicina 125 mM e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Dividere celle in 5 x 10 7 aliquote; sciacquare tre volte con PBS freddo per centrifugazione a 430xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante dopo ogni lavaggio. All'ultimo lavaggio, scartare il surnatante e mantenere il pellet. Nota: Una volta che le cellule sono reticolati, possono essere conservati a -80 ° C, se non utilizzato immediatamente.
- Preparazione Nuclei
- Risospendere ogni pellet cellulare in 10 ml di tampone di lisi (Tabella 1). Incubare per 10 minuti a 4 ° C con rotazione. Centrifugare a 430 xg per 5 minuti a 4 ° C. Scartare il surnatante; mantenere pellet nucleari.
- Risospendere ogni pellet nucleare in 10 ml di lavaggio Buffer (Tabella 1). Incubare a temperatura ambiente per 10 min su una ruota girevole.
- Centrifugare a 430 xg per 5 minuti a 4 ° C. Scartare il surnatante e raccogliere le palline.
- Risospendere ogni pellet nucleari in 3 ml ChIP tampone di incubazione (Tabella 1). Tenere su ghiaccio.
- Sonicazione della cromatina e controllo di qualità
- Ultrasuoni ch. romatin a 200 W (cicli di 30 sec "a" e 1 min "off"), in una Bioruptor raffreddato, a frammentare cromatina Nota: il numero di cicli e intervalli sonicazione dipende dal tipo di cellula e sulla durata media di nucleosomal allungare lo desideri. Tipicamente, 30 min di sonicazione necessari per generare frammenti di DNA di 300-500 bp in lunghezza, corrispondenti a tri-nucleosomi di-e. La scelta delle dimensioni frammenti dipende dal tipo di dominio cromatina in esame.
- Take 2% dell'input totale, invertire la reticolazione mediante incubazione a 65 ° C per almeno 1 ora in ChIP tampone di incubazione. Estrarre il DNA dai kit di purificazione PCR, eluire in 50 microlitri TE Buffer e caricare il DNA su gel di agarosio per verificare la cromatina frammentazione.
- L'incubazione della cromatina con anticorpi
- Aggiungere 1/10 del volume del 10% Triton X-100 di cromatina sonicato. Centrifugare a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare debris.
- Salvare 50 ml di ingresso cromatina dalle cellule pesanti per testare il livello di incorporazione di aminoacidi SILAC in cellule marcate e per le proteine profilatura.
- Aggiungere l'anticorpo di scelta per il restante cromatina sonicato pesante e leggera etichettati e incubare una notte a 4 ° C sulla ruota rotante. Nel canale luce, aggiungere anche una piega eccesso del peptide solubile. Incubare per una notte a 4 ° C su una ruota girevole. Note: La condizione ottimale tra il pg di anticorpo e il materiale di partenza di cellule viene scelto caso per caso, come discusso in 2.5.3. L'ottimale piega molarità eccesso del peptide solubile rispetto alla anticorpo deve essere titolata attentamente caso per caso.
- Isolamento di cromatina utilizzando biglie magnetiche
- Equilibrare e bloccare proteine sfere magnetiche G-accoppiati seguendo i passaggi descritti in 2.6 e utilizzando ChIP tampone di incubazione.
- Aggiungere 100 ml di blocco beads ai campioni cromatina e incubare su una ruota girevole per 3 ore a 4 ° C. Centrifugare a 340 xg per 1 minuto a girare giù il campione dal coperchio delle punte. Mettere in un rack magnetico per far sedimentare le perline. Il supernatante è il flusso attraverso (FT), contenente nucleosomi non legati. Lavare Perle quattro volte nel lavaggio Buffer (Tabella 1) con concentrazione salina crescente (due lavaggi a 150 mm e due in NaCl 300 mM).
- Incubare perline in 30 microlitri SDS-PAGE Loading Sample Buffer (Tabella 1) e per 25 min a 95 ° C sia a defluire e de-reticolazione delle proteine immunoprecipitate. Proteine separate sul 4-12% Bis-Tris acrilammide SDS-PAGE gel prefabbricati (Figura 3D).
4. Preparazione del campione Prima di MS
- In-Gel digestione degli istoni arricchite da N-chip
Nota: Durante la digestione delle proteine e di estrazione peptide passi prendono curaper minimizzare contaminazioni di cheratina che interferiscono con LC-MS/MS, come descritto in precedenza 22, 23.- Tagliare le fette di gel corrispondente alle istoni principali bande (Figura 1D). De-macchiare i pezzi di gel con il 50% acetonitrile (ACN) in DDH 2 O, in alternanza con il 100% ACN per ridurre il gel. Ripetere fino gel pezzi sono completamente de-colorate e asciugarli in una centrifuga a vuoto.
- Aggiungere D 6-anidride acetica 01:09 (v / v) in 1 M di bicarbonato di ammonio (NH 4 HCO 3) (tipicamente il volume finale è 60-100 microlitri) e 3 microlitri di acetato di sodio (CH 3 COONa), come catalizzatore. Incubare per 3 ore a 37 ° C con forte agitazione Nota:. Il campione può generare bolle nei primi minuti dopo l'assemblaggio della reazione: importante maneggiare con cautela e rilasciare il gas generato, apertura di volta in volta i tubi durante l'incubazione.
- Sciacquare i pezzi di gel più volte with NH 4 HCO 3, alternate con ACN ad aumentare percentuale (dal 50% al 100%), al fine di eliminare completamente i residui di D anidride 6-acetico.
- Shrink i pezzi di gel di 100% ACN; asciugarli in una centrifuga a vuoto per garantire la completa de-idratazione. Reidratare pezzi di gel con ghiaccio-freddo 100 ng / ml soluzione di tripsina in 50mM NH 4 HCO 3 e incubare una notte a 37 ° C. Nota: La combinazione di modificazione chimica di lisine utilizzando deuterato anidride acetica e tripsina digestione genera un "Arg- C come: "in gel digestione modello di istoni 21,24.
- Eliminare la soluzione in eccesso e aggiungere un volume di 50 mM NH 4 HCO 3 per coprire completamente i pezzi di gel; incubare una notte a 37 ° C.
- Raccogliere solubili peptidi digeriti in una nuova provetta Eppendorf. Liofilizzare peptidi. Li Risospendere nello 0,5% acetico acid/0.1% di acido trifluoroacetico (TFA). Desalt e concentrarsipeptidi su fase inversa "sandwich" C 18 / carbonio e cromatografia a scambio ionico (SCX) su microcolonne fatti a mano (StageTip) 25.
- Preparare le microcolonne StageTip mettendo in teflon dischi reticolo contenenti immobilizzato C 18 / Carbon ("sandwich") e SCX perline in consigli di 200 microlitri. Ottenere il "sandwich" caricando il C 18 microcolonna sulla sommità di una seconda punta caricato con filtro Carbon Nota:. I peptidi molto brevi, che non trattenute sul filtro C 18, passare il flusso continuo che viene caricato direttamente sulla Carbon Tip, che li cattura in genere. StageTips SCX possono arricchire peptidi specifici, come H3 (3-8) peptide, non efficacemente trattenuto mediante cromatografia in fase inversa.
- Carico 50% di peptidi sulla "StageTip sandwich" C 18 / carbonio e 50% sul SCX StageTips. Li eluire dalle punte C 18 / carbonio con 80% ACN/0.5% ac aceticoid e dalle punte SCX con idrossido di ammonio 5% (NH 4 OH) / 30% di metanolo. Dopo peptidi liofilizzazione, risospendere in 0,1% FA e analizzare da LC-MS/MS.
- In-gel digestione delle proteine immunopurified
In-gel digestione delle proteine viene effettuata come descritto in precedenza 22, con piccole modifiche.- Tagliare ogni corsia in dieci sezioni (Figura 3D) e ogni fetta a cubetti di 1 mm 3. De-macchiare i pezzi di gel con il 50 NH mm 4 HCO 3/50% di etanolo e aggiungere etanolo assoluto per ridurre i gel. Ripetere l'operazione fino a quando i gel sono completamente de-colorate.
- Aggiungere tampone riduzione (Tabella 1) per i pezzi di gel per 1 ora a 56 ° C, seguito dall'aggiunta di tampone alchilazione (Tabella 1) per 45 min a temperatura ambiente, al buio. Lavate e asciugate i pezzi di gel in centrifuga a vuoto.
- Reidratare i pezzi gel con ghiaccio freddo 12.5 ng / mL tripsina solution in 50 mM NH 4 HCO 3 e incubare in ghiaccio fino a completa reidratazione dei pezzi di gel. Rimuovere tripsina in eccesso.
- Aggiungere 50 NH mm 4 HCO 3 a coprire completamente i pezzi di gel. Incubare una notte a 37 ° C.
- Raccogliere la parte liquida. Aggiungere il tampone di estrazione (Tabella 1) per i pezzi di gel; incubare con forte agitazione per 10 min a temperatura ambiente. Ripetere due volte.
- Incubare i pezzi di gel in ACN per 10 min con una forte agitazione. Ripetere due volte e piscina tutti surnatanti.
- Liofilizzare i peptidi. Risospendere peptidi secchi nello 0,5% acetico acid/0.1% TFA.
- Desalt e concentrarsi peptidi su fase inversa C 18 StageTip, come descritto 26, 27.
- Eluire peptidi dalla C 18 StageTip all'80% ACN/0.5% di acido acetico. Rimuovere il solvente organico per evaporazione in una centrifuga a vuoto e risospendere le peptidi nello 0,1% FA (tipicamente 5-10 &# 181; l), quando è pronto per l'analisi MS.
5. LC-MS Analysis
- Cromatografia liquida
- Riempire la colonna analitica in 15 centimetri fusa emettitore silice (75 micron di diametro interno, diametro esterno 350 micron), con fase inversa (RP) C 18, 3 micron resina in metanolo, ad una pressione costante di elio (50 bar) utilizzando un Dispositivo bomba-loader, come descritto in precedenza 28.
- Coppia emettitore imballato (C 18 RP colonna) direttamente all'uscita della valvola a 6 porte della HPLC attraverso una (25 micron di diametro interno) 20-cm lungo silice fusa senza utilizzare precolonna o un dispositivo di divisione.
- Caricare i peptidi digeriti in C 18 RP colonna al flusso di 500 nl / min fase mobile A (0,1% FA / 5% ACN, in DDH 2 O).
- Dopo il caricamento del campione, separare i peptidi utilizzando i seguenti gradienti:
- Applicare 0-40% fase mobile B (0,1% FA/99% ACNin DDH 2 O) a 250 Nl / min oltre 90 min seguito da un gradiente di 40-60% in 10 min e 60-80% in 5 min, per eluizione dei peptidi derivanti da istoni (vedi 2).
- Applicare 0-36% fase mobile B a 250 Nl / min, con oltre 120 min seguita da una pendenza del 36-60% in 10 minuti e il 60-80% più di 5 min, per l'eluizione dei peptidi derivanti da proteine immunopurified (cfr. 3).
- Analisi di spettrometria di massa utilizzando LTQ-FT-ICR-Ultra spettrometro di massa
- Operare in una acquisizione dati dipendente mode (DDA) di passare automaticamente tra gli Stati membri e l'acquisizione MSMS. MS spettri a scansione totale sono acquisiti, tipicamente nel range m / z da 200-1,650, si acquisisce con risoluzione R = 100.000 a 400 m / z. I cinque (Top5) ioni più intensi sono isolati per frammentazione nella trappola ionica lineare utilizzando una dissociazione indotta da collisione (CID) a un valore target di 5.000.
- Utilizzare i parametri elencati nella Tabella 2 for il file di acquisizione "Sintonia".
- Configurare le impostazioni di acquisizione standard elencate nella Tabella 2.
6. Analisi dei dati
- Etichettare libero quantificazione delle modificazioni degli istoni co-arricchiti in domini di cromatina
- Convertire i file raw acquisiti in file MGF utilizzando il software Raw2msm (versione 1.10) 29.
- Cerca le modificazioni degli istoni con Mascot Deamon (versione 2.2.2), impostando i parametri descritti nella tabella 3.
- Sulla lista peptide uscita Mascotte, rimuovere i peptidi con punteggio inferiore a 15 o con più di 5 PTMs putativi 29. Nota: Per ogni singolo ID peptide, selezionare il peptide con il punteggio più alto e mascotte filtrare tutti gli altri peptidi ridondanti con lo stesso ID .
- Costruire i cromatogrammi ionici estratti (XIC) per ogni precursore corrispondente ad ogni peptidi modificati, based il valore m / z, usando l'QualBrowser. Calcolare l'area sotto la curva (AUC) per ciascun picco (Figura 2A).
- Convalida ciascuno peptidi individuati contenenti modifiche di ispezione visiva degli spettri MS / MS utilizzando la QualBrowser (Figura 2B).
- Calcolare l'abbondanza relativa di ogni peptide modificato. Calcolare il relativo arricchimento di ogni cambiamento nel materiale ChIP-Ndr:. Abbondanza relativa viene calcolato come rapporto tra l'AUC di ciascun peptide modificato specifico sulla somma di AUC di tutte le forme modificate e non modificate del peptide stesso, mentre relativa arricchimento come rapporto tra l'abbondanza relativa della modifica specifica nel chip sull'ingresso (Figura 2C).
- Quantitativa analisi proteomica delle proteine co-associati all'interno dei domini di cromatina
- Per le proteine identificazione e la quantificazione utilizzano il pacchetto MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) 30. Configurare il motore di ricerca integrato "Andromeda" con il AndromedaConfig.exe 31 e impostare i parametri di ricerca elencati nella Tabella 3.
- Test Incorporation
- Stimare il grado di incorporazione di amminoacidi nelle proteine pesanti in ingresso cromatina pesante marcato, utilizzando software MaxQuant, come segue:
- Impostare i parametri come descritto in 6.2, ma disabilitando l'opzione re-quantificare.
- Calcolare la percentuale di incorporazione applicando la seguente formula per rapporti di peptidi non ridondanti:. Incorporation (%) = rapporto (H / L) / Rapporto (H / L) + 1 × 100 (Figura 3B) Nota: Accetta solo se incorporazione> 95 %.
- Stimare il grado di incorporazione di amminoacidi nelle proteine pesanti in ingresso cromatina pesante marcato, utilizzando software MaxQuant, come segue:
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Representative Results
Cromatina immunoprecipitazione è una potente tecnica utilizzata per profilare la localizzazione di una proteina o una modificazione degli istoni lungo il genoma. In un equivalente di proteomica, ChIP è seguito da proteomica basati su MS per identificare qualitativamente e quantitativamente le hPTMs, varianti istoniche e proteine della cromatina vincolanti che sono immunoprecipitati con la modifica o la proteina di interesse, utilizzati come "esca". Nell'approccio N-ChroP, illustrato in Figura 1A, ChIP nativo, in cui cromatina viene digerito con MNase (Figura 1B), è usato come ingresso per purificare dal bulk cromatina un dominio funzionale distinto. Cromatina digerito arricchito in mono-nucleosomi viene incubata con un anticorpo specifico e le proteine immunopurified sono separati mediante SDS-PAGE. Nell'esempio illustrato, H3K9me3, marcatore della cromatina silente 32,33, viene utilizzato per impostare l'approccio. La scelta si basa sul fatto che sia il suo ruolo funzionalecosì come alcuni dei suoi interattori proteici sono ben descritti. Inoltre, un anticorpo altamente specifico ed efficiente ottimizzata per il chip è disponibile 34, come confermato anche mediante ispezione visiva del gel Coomassie, dove il nucleosoma intatto, con gli istoni base alla stechiometria corretta, si arricchisce in quantità appropriate per MS (Figura 1D ).
Il confronto tra la quantità di H3K9me3 presente nel flusso passante (FT) e l'ingresso (IN) indica che circa il 50% della regione di interesse è immunopurified, escluso il rischio di una distorsione dovuta l'arricchimento di un minore sottopopolazione di cromatina (Figura 1C). MS è impiegato per caratterizzare il PTMs co-associata nei nucleosomi arricchite: ciascun istone nucleo viene digerito utilizzando un protocollo progettato ad hoc per realizzare un "Arg-C come" digestione, in gel di poliacrilamide. Infatti, da un lato Arg-C è la migliore proteasi per l'analisi MS di hPTMs because produce peptidi di lunghezza ottimale; d'altra parte, non fende efficiente in gel. Per superare questa limitazione, il nostro protocollo adattato sfrutta l'alchilazione chimica di lisina ottenuto incubando bande gel istoni con deuterato (D 6) con anidride acetica, seguito da digestione con tripsina. Poiché tripsina non fende D lysines 3 acetilate, risultanti peptidi miscela simula un "Arg-C come" pattern (Figura 1E).
L'aggiunta di un D 3-acetil frazione a una lisina produce una massa delta inequivocabile di 45,0294 Dalton, discriminando tra acetylations nativi e ha aggiunto chimicamente in MS. Inoltre, D 3-acetilazione offre due vantaggi aggiuntivi che facilitano il discernimento di peptidi modificati isobariche: in primo luogo, l'alchilazione si verifica solo su lysines non modificate e mono-metilato, ma non sui residui di-e tri-metilato; come tali peptidi modificati con lo stesso total numero di modifiche, ma in modalità differenti differenziale decorate da serie distinta di D gruppi di 3-acetil che producono inequivocabili m / z turni. In secondo luogo, modelli distinti di D 3-alchilazione causano leggermente diversi tempi di ritenzione in cromatografia liquida su colonna a fase inversa, che generano un ulteriore livello di separazione di peptidi modificati isobariche 21.
Dopo la convalida di tutti hPTMs di controllo manuale del corrispondente spettri MS / MS (Figura 2B), la quantificazione libero etichetta è realizzata in due fasi: in primo luogo, si calcola l'abbondanza relativa di ciascuna modifica usando l'intensità delle specie non modificati e modificati segnale per il peptide corrispondente, misurata attraverso il calcolo dei cromatogrammi ionici estratti (XIC) (Figura 2A e 2C, pannello superiore); secondo, il relativo arricchimento è stimata come rapporto tra l'abbondanza relativa di ogni modification nel ottamero ChIP-ed e il corrispondente abbondanza relativa di ingresso (Figura 2C, pannello inferiore). L'analisi della H3 (9-17) peptide mostra l'arricchimento di di-e tri-K9 metilato, con la corrispondente esaurimento delle forme non modificate e mono-metilata (Figura 2C). Con questo si traduce come controllo positivo per l'anticorpo specificità, la co-associazione o deplezione di tutte le altre modifiche possono essere valutate, sia a livello intra-molecolare sullo stesso H3 e al livello intermolecolare, su altri istoni co-arricchiti all'interno lo stesso nucleosoma. Questo permette la proiezione di hPTMs incrociati colloqui all'interno dei domini H3K9me3, il cosiddetto "eterocromatina modificome" (Figura 2D): il significativo arricchimento di marcatori noti associati con silenziamento genico, con la corrispondente deplezione di marcatori associati con l'attivazione del gene si osserva . Inoltre, nuove associazioni vengono rilevati come l'arricchimento di H3K18me1.
Per lo screening di tutte le proteine co-associano all'interno eterocromatina, la reticolazione ChIP classica si combina con SILAC (Stable Isotope Etichettatura da aminoacidi nelle cellule in coltura) (Figura 3A). Nell'esperimento SILAC, la lisina e arginina (forma leggera) vengono sostituiti con i loro analoghi marcati con isotopi pesanti (forma) nel mezzo di coltura. Su cellule coltivate e replica sia leggera e pesante supporti, i due differenzialmente aminoacidi isotopi codificati sono metabolicamente incorporato nelle proteine, generando leggeri e pesanti forme di proteine, rispettivamente, che sono distinguibili da MS, a causa di una determinata Δmass. Prima di iniziare un esperimento SILAC larga scala, l'efficienza etichettatura viene valutata, calcolare il livello di incorporazione, misurati come frazione percentuale di peptidi pesanti rispetto alla somma di quelli pesanti e leggeri, trovato solo campione pesante etichettato. Incorporazione superiore al 95% sia per il pesante arginina e luiè necessaria Avy lisina per un accurato quantificazione delle proteine (Figura 3B). Dopo la reticolazione delle cellule pesanti e leggeri, cromatina è frammentato mediante ultrasuoni. SILAC è usato in combinazione con un saggio di competizione con una piega eccesso di peptide solubile H3 (QTAR K STGG) che porta il tri-metilazione sul K9, al fine di discriminare specifici interattori H3K9me3 da sfondo. Il peptide solubile viene aggiunto in eccesso di uno dei due esperimenti SILAC Chip, dove si satura la capacità di legame dell'anticorpo, così "competizione out" la maggioranza dei H3K9me3-nucleosomi e, di conseguenza, tutti interattori specifici. Nell'altro canale SILAC, il peptide concorrente non viene aggiunto al chip e la immunoprecipitazione avviene normalmente. Esperimenti di SILAC concorrenza sono tipicamente eseguiti in duplicato nei cosiddetti "Forward" e "Reverse" formati, dove la concorrenza con il peptide solubile in eccesso viene commutato da the pesante (H) alla luce (L) campioni della cromatina. Ciò si traduce in invertiti complementari letture rapporto SILAC, utilizzati per esigenze elevate autentico da leganti non specifici: proteine specificamente arricchiti sono presenti con una maggiore intensità nella forma pesante in confronto con la forma chiara (rapporto proteina H / L> 1) nell'esperimento cui eccesso peptide viene aggiunto al canale luce (Forward) (Figura 4A, pannello superiore); una tendenza opposta (rapporto proteina H / L <1) si osserva nella replica inversa (Figura 4A, pannello inferiore). Proteine la cui intensità nella forma pesanti e leggeri sono simili in entrambi i Forward e Reverse esperimenti producono un rapporto costante vicino a 1 e sono classificate come sfondo (Figura 4B).
La scelta della piega eccesso ottimale per il peptide solubile è importante e deve essere regolato con precisione. In genere, si imposta la proporzione corretta anticorpo-to-peptide eseguire un concorso test USIng diluizioni seriali di un eccesso di peptide e confrontando il livello di "esca" (Hptm / proteina) tra il chip di controllo positivo, in cui non viene aggiunto il peptide, e chip diversi concorrenza seriale, mediante Western Blot o MS. Generalmente, l'ottimale piega peptide eccedenza riduce di circa il 90% della quantità di Hptm / proteine nel materiale immunoprecipitato. Infatti, da un lato, maggiore è il rapporto proteina ottenuta, maggiore è il potere discriminante di SILAC; D'altra parte, una saturazione eccessiva dal peptide può rimuovere completamente i leganti specifici dal anticorpo, portando così a mancare rapporti H / L per la quantificazione e analisi statistica. Per anticorpo H3K9me3 abbiamo definito la proporzione corretta misurando il rapporto H / L per il QTARK (me3) STGG peptide, in una prova di concorso effettuata in un Forward istituito e abbiamo preso questo valore come una misura dell'efficienza concorso (Figura 3C ).
L'intersezione della Forward und Reverse esperimenti X-chip porta alla identificazione di 635 proteine, presenti in entrambi gli esperimenti e quantificati con almeno 2 rapporto conteggi. Il registro 2 trama dei loro rapporti H / L rappresentano il cosiddetto "heterochromatome" (Figura 4C), dove interattori genuini H3K9me3 siano chiaramente identificati come le proteine presenti nel top 40% delle distribuzioni rapporto proteine (quadrante superiore destro il grafico a dispersione e Figura 4D).
Figura 1: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro N-ChroP A) Schema di ChIP nativo combinato con l'analisi MS.. La cromatina dalle cellule viene digerito con MNase e la frazione arricchita in mono-nucleosomi (S1) è immunoprecipitata utilizzando un anti-H3K9me3 anticorpo. Immunopurified proteine sono separate mediante SDS-PAGE e istoni core sono in gel-digerito con un protocollo ad hoc per simulare una digestione Arg-C. I peptidi sono analizzati da nano-LC-MS/MS. PTM istoni sono identificati, convalidato mediante ispezione manuale di MS / MS spettri e quantificati B) prova MNase piccola scala:. DNA deliberato su un gel di agarosio 1% dopo la digestione della cromatina con MNase a differenti lasso di tempo (pannello di sinistra); larga scala MNase digestione:. DNA ha deliberato un gel di agarosio 1% dopo 60 minuti di MNase cromatina digestione e dopo la separazione della frazione S1, che contiene mono-nucleosomi da S2 fazione, contenenti poli-nucleosomi (pannello di destra) C) Stima di arricchimento / deplezione di non modificato, mono-, di-, e tri-K9 metilato in flow-through (FT) rispetto al ingresso (IN). Istogramma rappresenta la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti per ogni modifica. D) SDS-PAGE di ingresso cromatina e co-immuno proteine purificate: Anima istoni H3, H4, H2A e H2B sono visibili intorno e sotto la banda di 17kDa, con H3 e H2B co-migrazione (quadrati neri) E) Ogni istoni core di entrambi i nucleosomi immunoprecipitate e ingresso sono chimicamente alchilata con deuterio (. D 6)-acetico-anidride prima trattamento con tripsina, al fine di ottenere una "Arg-C come" in gel digestione. Il D-6 anidride acetica reagisce con il gruppo amminico Epsilon di lisine non modificate e mono-metilato ma non con di-metilato, lysines tri-metilato e acetilati. Come risultato, l'attività enzimatica di tripsina viene bloccato su tutti nativo e chimica lisina acetilata, producendo così una "Arg-C come" modello digestione. Questa cifra è stata modificata da 21, utilizzando la figura 1, la figura S1 e Figura S5 come riferimento. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2:. Analisi Mass Spectrometry del "modificome" H3K9me3 A) spettri di massa ingrandita e cromatogrammi ionici estratti (XIC) costruito al corrispondente valore m / z del 2 + addebitare non modificato, mono-, di-e tri-metilato K9 in H3 (9-17) peptide, sia per i campioni di ingresso e Chip. B) Rappresentante MS / MS spettri utilizzando CID frammentazione. La serie b-ioni e y-ion permettono di definire la sequenza di H3 (9-17), peptidi e di localizzare in particolare il tri-metilazione sul K9 residui. C) l'abbondanza relativa dei diversi gradi di metilazione sul K9 in H3 ( 9-17) peptide, determinato dividendo l'area sotto la curva (AUC) di ciascun peptide modificato dalla somma delle aree corrispondenti a tutte osservata unmodifiEd e forme modificate di tale peptide, nell'input e ChIP-ed ottamero. Istogramma rappresenta la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti per ogni modifica (pannello superiore). Arricchimento relativo di metilazioni K9 in H3 (9-17) peptide. L'arricchimento è espresso come rapporto log 2 tra l'abbondanza relativa di ciascun metilazione nel ottamero ChIP-to come confrontare input. Istogramma rappresenta le medie ± SEM di tre esperimenti indipendenti (pannello inferiore). D) Heatmap riassume l'arricchimento di tutti hPTMs co-associano identificati istone H3, H4 e H2A. Ogni riga corrisponde ad una modifica differente (nd non vengono rilevati modifiche). Questa cifra è stata modificata da 21, utilizzando la figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura S10 come riferimento. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3: Rappresentazione schematica di X-ChroP workflow A) Schema di reticolazione ChIP combinata con l'analisi MS.. Le cellule coltivate in leggeri e pesanti mezzi sono fissati con ingressi formaldeide e cromatina sono frammentati mediante ultrasuoni per generare frammenti di DNA. In un Forward istituito, la cromatina pesante marcato sonicato è immunoprecipitata utilizzando un anticorpo anti-H3K9me3 mentre la cromatina luce marcato è incubato con lo stesso anticorpo saturo con una piega eccesso di peptide solubile H3 cuscinetto K9me3. Proteine immunoprecipitate da cromatine pesanti e leggere sono raggruppati, estratti e separati mediante SDS-PAGE. Le proteine vengono digeriti con tripsina e peptidi sono analizzati da nano-LC-MS/MS. B) Efficienza di etichettatura SILAC viene monitorata calcolando l'incorporazione di lys pesantiine (Lys8) e arginina (Arg10) in proteine. Nella trama, la mediana della distribuzione di lisina e arginina peptidi densità è pari a 0,974 (linea verde) e 0,964 (linea rossa), rispettivamente. C) spettri di massa ingrandita al corrispondente valore m / z del 2 + addebitare tri-metilata K9 in H3 (9-17) peptide, sia per la luce e le forme pesanti, in ingresso e ChIP-ed ottamero. Mentre in ingresso le intensità di peptide pesante e leggera sono vicino a 1, nel Forward SILAC Chip, l'intensità della luce peptide è molto più basso di quello della controparte pesante, indicando così una competizione efficiente. D) SDS-PAGE di luce (L) e pesanti (H) etichettati ingresso cromatina e del materiale co-immunoprecipitato: la corsia corrispondente alla materia ChIP-ed è tagliato in dieci fette (linea nera), mentre solo due fette di ingresso vengono analizzate per l'incorporazione test di analisi ( linea blu). Questa cifra è stata modificata da 21, utilizzando la figura 4 e figura S6 come rirenza. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 4: analisi di Spettrometria di Massa della "interattoma" H3K9me3. A) Rappresentante spettro completo che mostra la SILAC coppia corrispondente a peptidi e proteine HP1 macro-2A: i rapporti H / L> 1 nell'esperimento (pannelli superiori in avanti), rispecchiati da un rapporti H / L <1 in replica inversa (pannelli inferiori), dimostrare l'arricchimento specifico di queste proteine in heterochromatin B) Rappresentante spettri completa con SILAC coppia corrispondente al peptide da proteine uno sfondo:. rapporti H / L in avanti e retromarcia repliche sono uguali a 1 C) proteine quantificati. sono distributed in un grafico a dispersione in base alle loro SILAC-rapporti in avanti ed esperimenti Reverse (assi X e Y, rispettivamente); linee tratteggiate rosse rappresentano il top 40% e il 30% dei rapporti di proteine, come indicato. rapporti D) Proteine distribuzioni di ingresso (H / L miscelato 1:1) (nero), Forward (blu) e retromarcia (arancione) X-ChroP esperimenti; linee tratteggiate rosse rappresentano il top 40% dei rapporti di proteine, impostate come tagli per selezionare le interattori genuini. Questa cifra è stata modificata da 21, utilizzando la figura 5 come riferimento. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
| Buffer per la sezione 2 | Composizione |
| Lysis Buffer | 10% di saccarosio, 0,5 mM EGTA pH 8.0, 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 15 HEPES mM, 0,5% Triton, PMSF 0,5 mM, 1mM DTT, 5 NAF mM, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mm NaButyrate, 5 mg / ml aprotinina, 5 mg / ml Pepstatin A, 5 mg / ml leupeptina |
| Cuscino di saccarosio | 2 g di saccarosio in 20 ml di Lysis Buffer |
| Digestion Buffer | 0,32 M saccarosio, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.1 mM PMSF |
| TE Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA |
| Dialisi Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, PMSF 0,5 mm, 5 NAF mM, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mm NaButyrate, inibitori della proteasi cocktail |
| ChIP tampone di diluizione | 100 mM Tris HCl pH 7,6, NaCl 100 mM e EDTA 10 mM |
| Blocking Solution | BSA 0,5% in PBS |
| Lavaggio Buffer | PH 7.6,10 mM EDTA 50 mM Tris-HCl |
| Inibitori della proteasi | Libero-EDTA inibitori della proteasi cocktail, PMSF 0,5 mm, 5 NAF mm, 5 Na3VO4 mM, 5 mm NaButyrate |
| Loading Buffer | arancione loading dye, 50% (v / v) di glicerolo in H20 |
| Buffer per la sezione 3 | Composizione |
| Lysis Buffer | 50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolo, 0,5% NP-40, 0,25% Triton-100, 0,5 mM PMSF, 5 NAF mM, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinina, 5 mg / ml Pepstatin A, 5 mg / ml leupeptina |
| Lavaggio Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, PMSF 0,5 mM, 5 NAF mM, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinina, 5 mg / ml Pepstatin A , 5 mg / ml leupeptina |
| ChIP tampone di incubazione | 10 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, 0,1% desossicolato di sodio, 0,5% lauroylsarcoside sodio, PMSF 0,5 mM, 5 NAF mM, 5 mM Na 3 VO 4, 5 NaButyrate mM, 5mg / ml aprotinina, 5 mg / ml Pepstatin A, 5 mg / ml leupeptina |
| Lavaggio Buffer 2 | 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Triton-100 |
| Buffer di caricamento del campione | 250 mm Tri-HCl pH 8.8, 0.5 M b-mercaptoetanolo, 2% SDS |
| Buffer per la sezione 4 | Composizione |
| Alchilazione Buffer | 55 mm iodoacetamide in 50 NH mm 4 HCO 3 |
| Riduzione Buffer | 10 mM ditiotreitolo in 50 NH mm 4 HCO 3 |
| Extraction Buffer | 30% di ACN e il 3% TFA in DDH 2 0 |
Tabella 1. Buffer Composizione.
| Ottimizzazione file di acquisizione | Parametri |
| FT pieno scan | accumulo di valore nominale 1 x 10 6; tempo massimo di riempimento 1.000 msec |
| IT MSn | accumulo valore obiettivo 10 x 10 4; tempo massimo di riempimento 150 msec |
| Impostazione acquisizione | Parametri |
| Tensione Electrospray | 2.4 kV |
| Guaina e il flusso di gas ausiliario | No |
| Temperatura capillare trasferimento Ion | 200 ° C |
| Esclusione dinamico | fino a 500 ioni precursori per 60 sec su MSMS |
| Larghezza di massa Esclusione | 10 ppm |
| Energia di collisione normalizzata utilizzando la modalità di attivazione a larga banda | 35% |
| Soglie di selezione Ion | 100 conteggi |
| Attivazione q | 0.25 |
| ActivTempo zione | 30 msec |
Tabella 2. Impostazioni ms.
| Mascor Deamon ricerca | Parametri | Note |
| Database | dipende l'organismo (ad esempio per le cellule HeLa: database di umano, versione 3.68, 87.061 voci) | |
| Enzima | Arg-C | Arg-C fende al C-terminale di tutti i residui di arginina |
| Modifiche variabili | acetile (K), ossidazione (M), D 3-acetilazione (K), metil-D 3 - acetil (K), dimetil (k), trimetil (K) | acetil [42,010 Da], ossidazione [15,995 Da], D3-acetilazione [45,0294 Da], metil-D3-acetil [somma di 14,016 e 45,0294 Da Da], dimetil [28,031], trimetil [42,046 Da] |
| Perse spaccature | fino a 2 | |
| Accuratezza di massa degli ioni madri nella ricerca | 10 ppm | |
| Mass-accuratezza CID MSMS | 0.5 Da | |
| Ricerca MaxQuant | Parametri | Note |
| Database | dipende sull'organismo | |
| Enzima | tripsina / P | Scinde tripsina al C-terminale di tutti i residui di lisina e arginina. La ricerca viene eseguita tenendo in considerazione il fatto che l'efficienza di tripsina per scindere lisina e arginina viene ridotta quando il successivo amminoacido è la prolina (/ P). |
| Modifica fisso | carbamidometilazione | |
| Modifiche variabili | N-acetil (Protein), ossidazione (M) | |
| Perse spaccature | fino a 3 | |
| Parametri Label | lys8 e arg10 | |
| Amminoacidi massima dell'etichetta | 3 per Tripsina | |
| Mass precisione degli ioni principali nella ricerca iniziale "Andromeda" | 20 ppm | |
| Accuratezza di massa degli ioni padre nella ricerca generale "Andromeda" | 6 ppm | |
| Mass-accuratezza CID MSMS | Da 0,5 (sei migliori picchi per100 Da) | |
| Peptide tassi di scoperta falsi (FDR) | 0.01 | |
| Proteine tassi di scoperta falsi (FDR) | 0.01 | Impostazione del FDR per peptidi e proteine a 0,01 significa che entrambi i peptidi e proteine identificate dovrebbero contenere 1% di falsi positivi. Questo valore è stimato utilizzando un database di destinazione-richiamo |
| Er massimo posterioriprobabilità ror (PEP) | 1 | PEP è la probabilità che un individuo peptide è un falso riscontro positivo. PEP pari a 1 nel vostro ambiente significa che saranno prese a prescindere dal PEP tutti i peptidi così il filtraggio si basa esclusivamente sulla FDR. |
| Lunghezza minima peptide | 6 | |
| Numero minimo di peptidi | 2 | |
| Numero minimo di peptidi unici | 1 | |
| Utilizzando solo peptidi modificati e ossidazione (M) / acetil (proteina N-Term) | attivare l'opzione | Peptidi con modifiche non dovrebbero generalmente essere conteggiati per la quantificazione delle proteine da loro abbondanza non può riflettere il rapporto tra la proteina corrispondente. |
| Conteggio minimo rapporto | 1 | |
| "Partita tra le esecuzioni" | attivare l'opzione |
Tabella 3. Analisi dei dati.
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Discussion
Abbiamo recentemente descritto ChroP, una strategia quantitativa per la caratterizzazione su larga scala dei componenti proteici della cromatina. ChroP combina due approcci complementari utilizzati in campo epigenetico, Chip e MS, approfittando loro punti di forza e superando i rispettivi limiti. ChIP accoppiato al sequenziamento profondo (ChIP-Seq) consente la mappatura genoma di modificazioni degli istoni alla risoluzione di alcune nucleosomi 35. Pur vantaggiosa per la loro sensibilità, saggi basati su anticorpi sono limitati nella loro capacità di distinguere modifiche simili e nella sezionare l'aspetto combinatorio del codice dell'istone 36. D'altra parte, mentre MS fornisce un'analisi completa e obiettiva hPTMs, singolarmente o in combinazione 9, è stato finora applicato all'analisi della cromatina rinfusa, con conseguente mancanza di informazioni su specifici locus PTMs schemi. Ci avvaliamo di una versione modificata del circuito integrato per isolare funzionalmentedomini di cromatina distinti e spettrometria di massa per caratterizzare i modelli istone PTM e le proteine non istoniche specificamente co-arricchiti.
Utilizzando N-ChroP, l'analisi di hPTMs co-associati H3K9me3 rivelato un arricchimento significativo di marcatori associati con cromatina silenziosa, e un impoverimento di modifiche associati cromatina attiva. L'accordo di questi risultati con gli studi precedenti 37 ha dimostrato la robustezza della strategia. In X-ChroP di domini H3K9me3, l'inchiesta basata SILAC-delle proteine della cromatina interagiscono confermato alcuni interattori precedentemente descritti, convalidando così il metodo.
ChroP presenta due principali aspetti originali rispetto alle strategie già disponibili per indagare la componente proteomica di cromatina: per esempio, la possibilità di rivelare sinergie inter-molecolari tra modifiche decorare istoni principali distinte all'interno della stessa intatta mono-Nucleosome purificato da N-chip; seconda la possibilità di valutare la compartimentazione specifica di varianti istoniche e linker sottotipi istoni. Poiché la ricerca di varianti dell'istone è frenato dalla mancanza di reagenti di buona qualità (cioè anticorpi), ChroP emerge come unico strumento a disposizione per valutare la loro posizione e ruolo funzionale.
Una limitazione del ChroP nella sua attuale istituito bugie in peptide-centric ("Bottom-up") approccio utilizzato nella SM, con istoni digerito in piccoli peptidi e la conseguente perdita di valore nel rilevare la connettività a lunga distanza tra modifiche. Come tale, la coniugazione di ChroP con "bottom-up" analisi MS consente una valutazione parziale dell'aspetto combinatoria del codice istoni. Prevediamo che l'attuazione di strategie alternative MS, come "-Middle e Top-Down" per la mappatura hPTMs su peptidi più lunghi (> 20 aa) fino a proteine intatte 38-40, supereràquesto moderazione.
Nel complesso, N e X-ChroP sono altamente complementari, con la possibilità di sezionare la complessità della struttura della cromatina in domini funzionalmente distinte, con una risoluzione di mono-di oligo-nucleosomi. Prevediamo che ChroP sarà utile anche per caratterizzare la composizione delle regioni cromatina segnati dalla presenza di proteine nucleari non istoniche specifici, per esempio fattori di trascrizione (TFS). Inoltre, ChroP può essere impiegato in studi funzionali per mappare la composizione dinamica della cromatina in loci specifici su varie perturbazioni, ad esempio durante l'attivazione trascrizionale globale. Per queste ragioni, ChroP emerge come un utile strumento aggiuntivo nel arsenale di strategie analitiche disponibili per sezionare il paesaggio proteomica della cromatina.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Mol Proteomica cellulari. Soldi M. Bonaldi T. La Proteomica Indagine della cromatina domini funzionali rivela Nuove sinergie tra distinte Eterocromatina Componenti MCP. 2013; 12: 64-80. © Società Americana per la Biochimica e Biologia Molecolare. Ringraziamo Roberta Noberini (Istituto Italiano di Tecnologia e IEO, Italia) per la lettura critica del manoscritto. Lavoro TB è sostenuto da finanziamenti della Fondazione Armenise-Harvard Career Development Program Giovanni, l'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro e il Ministero della Salute italiano. Lavoro MS è stato sostenuto da una borsa di studio FIRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15% C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
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