על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.
הכרומטין הוא מורכב nucleoprotein מאוד דינמי עשויים דנ"א וחלבונים השולט בתהליכי ה-DNA תלוי שונים. מבנה הכרומטין ותפקוד באזורים מסוימים מוסדר על ידי ההעשרה המקומית של שינויי היסטון לאחר translational (hPTMs) וגרסאות, מחייב חלבוני הכרומטין, ובכלל זה גורמי שעתוק, ומתילציה בדנ"א. אפיון proteomic של הרכב הכרומטין באזורים פונקציונליים שונים כבר הקשו עד כה על ידי חוסר פרוטוקולים יעילים להעשיר תחומים כגון בטוהר והכמות המתאימים לניתוח מעמיק לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). אנו מתארים כאן אסטרטגיה חדשה תוכננה פרוטאומיקה הכרומטין, בשם ChroP (roteomics P matin chro), לפיה immunoprecipitation הכרומטין preparative משמש כדי לבודד אזורי הכרומטין ברורים שתווים, במונחים של hPTMs, וריאנטים הקשורים שותף חלבונים שאינו histonic, הם נותח על ידי טרשת נפוצה. אנו ממחישים הואמחדש הקמת ChroP להעשרה והניתוח של אזורי heterochromatic תעתיק שקטים, שסומנה על ידי נוכחותו של Tri-מתילציה של ליזין 9 בהיסטון H3. התוצאות שהושגו להדגים את הפוטנציאל של ChroP באפיון יסודיות proteome heterochromatin ולהוכיח את זה כאסטרטגיה אנליטיים רבת עוצמה להבנת אופן שבו גורמי החלבון הייחודיים של הכרומטין אינטראקציה וsynergize להקים תצורות מבניות ותפקודיות מוקד ספציפי.
הכרומטין הוא מורכב nucleoprotein דינמי מאוד כי הוא מעורב כתבנית ראשונית לכל התהליכים בתיווך ה-DNA. הנוקלאוזום הוא היחידה הבסיסית החוזרת ונשנית של הכרומטין והוא מורכב מליבת octameric חלבוניים המכילה שתי מולקולות של כל H2A הקנונית היסטון, H2B, H3 ו-H4, שסביבו 147 נ"ב של ה-DNA עטופים 1,2. כל ההיסטונים הליבה בנויים כתחום כדורי ו" זנב "N-מסוף גמיש שבולט מחוץ להנוקלאוזום. אחד המנגנונים העיקריים להסדרת מבנה הכרומטין ודינמיקה מבוסס על שינויים קוולנטיים לאחר translational (PTMs), שבעיקר להתרחש על N-Termini של ההיסטונים 3,4. שינויי היסטון יכולים לתפקד גם על ידי שינוי מבנה הכרומטין סדר גבוה יותר, על ידי שינוי קשרים בין ההיסטונים-DNA או בין nucleosomes, ובכך שליטה על הנגישות של חלבוני ה-DNA מחייבת (מנגנוני cis), או על ידי מתנהג כמו dockinאתרים גרם לחלבונים רגולטוריים, או כיחידות בודדות, או משובץ במתחמי Multimeric. חלבוני ויסות כזה יכול להפעיל את תפקידם בדרכים שונות: על ידי ויסות ישירות ביטוי גנים (כלומר חלבוני TAF), או על ידי שינוי מיקום הנוקלאוזום (כלומר הכרומטין שיפוץ מכלולים) או על ידי שינוי שאריות אחרות היסטון (כלומר חלבונים עם מתיל-transferase או אצטיל פעילות transferase) (מנגנוני טרנס) 5. התצפית כי אשכול דפוסים ברור PTM בלוקוסי הכרומטין ספציפיים הוביל לפירוט של את ההשערה כי שינויים שונים באתרים שונים עשויים synergize ליצור קוד מולקולרי המתווך את המצב התפקודי של ה-DNA הבסיסי. "ההשערה של קוד היסטון" צברה קונסנסוס גדול בשנים, אבל אימות ניסיוני שלה כבר התאפקה על ידי מגבלות טכניות 6,7.
פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה (MS) התפתחהכלי רב עוצמה למפה דפוסי שינוי היסטון ולאפיין מחייב חלבוני הכרומטין 8. MS מזהה שינוי כΔmass ספציפי בין המסה הניסיונית ותיאורטית של פפטיד. ברמה של ההיסטונים בודדים, MS מספק שיטה משוחדת ומקיפה למפה PTMs, המאפשר זיהוי של שינויים חדשים וinterplays החושפני ביניהם 9-14.
בשנים האחרונות, מספר האסטרטגיות פותחו כדי לנתח את הרכב proteomic של הכרומטין, כולל האפיון של כרומוזומים שלמים המיטוטי 15, זיהוי של חלבוני קושרי hPTM המסיסים 16-18 והבידוד והניתוח של אזורי הכרומטין הספציפיים (כלומר הטלומרים) 19,20. עם זאת, החקירה של סינרגיות המוקד ספציפי בין PTMs היסטון, גרסאות, והחלבונים הקשורים הכרומטין היא עדיין לא הושלמה. כאן, אנו מתארים גישה חדשה, בשם ChroP (roteomics chro P matin) 21, שפיתחנו כדי לאפיין ביעילות תחומים הכרומטין תפקודי מובהקים. גישה זו מתאים את עצמו immunoprecipitation הכרומטין (שבב), פרוטוקול מבוסס היטב בשימוש במחקר אפיגנטיים, לניתוח proteomic מבוסס MS יעיל של המדגם המועשר. פיתחנו שני פרוטוקולים שונים, בהתאם לסוג של הכרומטין משמש כקלט והשאלה מופנה על ידי MS; בפרט: 1) שבב של הכרומטין ילידים מבולבל מתעכל עם MNase מועסק לטהר מונו nucleosomes ולנתח את hPTMs שיתוף שיוך (N-ChroP); 2) שבב של הכרומטין crosslinked מקוטע על ידי sonication משמש בשילוב עם אסטרטגית interactomics מבוסס SILAC לאפיין כל הכרומטין שיתוף ההעשרה מחייב חלבונים (X-ChroP). אנו מדגימים כאן שילוב של N-ו-X-ChroP להעשרת ולימוד heterochromatin, באמצעות H3K9me3 כפיתיון לצעדי immunoprecipitation. השימוש בChroP יכול להתארךללמוד או אזורים שונים על הכרומטין, או שינויים בהרכב הכרומטין בתוך האזור אותו במהלך המעבר למצב תפקודי שונה, ובכך סלל את הדרך ליישומים שונים באפיגנטיקה.
יש לנו לאחרונה תיארתי ChroP, אסטרטגיה כמותית לאפיון בקנה מידה גדולה של רכיבי החלבון של הכרומטין. ChroP משלב שתי גישות משלימות בשימוש בתחום אפיגנטיים, שבב וטרשת נפוצה, מרוויח מנקודתי החוזק שלהם ולהתגבר על המגבלות שלהם. שבב מצמידים את רצף עמוק (שבב Seq) מאפשר מיפוי הגנום של שי?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה פורסם במקור בפרוטאומיקה הנייד מול. סולדי מ 'וBonaldi ט proteomic חקירת תחומים פונקציונליים הכרומטין חושף Synergisms הרומן בין ברור heterochromatin הרכיבים MCP. 2013; 12: 64-80. © האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. אנו מודים לרוברטה Noberini (האיטלקי מכון טכנולוגי ולIEO, איטליה) לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודת TB נתמכת על ידי מענקים מArmenise-הרווארד תכנית ג'ובאני קרן לפיתוח קריירה, האיטלקית האגודה לחקר הסרטן ומשרד בריאות האיטלקית. עבודת MS נתמכה על ידי מענק FIRC.
DMEM | Lonza | BE12-614F | |
FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |