Summary
En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l'approche ChroP permet de disséquer l'architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.
Abstract
La chromatine est un complexe de nucléoprotéine hautement dynamique faite de l'ADN et des protéines qui contrôle divers procédés d'ADN-dépendante. la structure de la chromatine et de la fonction à des régions spécifiques est régie par l'enrichissement local du histones modifications post-traductionnelles (hPTMs) et variantes, les protéines de la chromatine de liaison, y compris les facteurs de transcription, et méthylation de l'ADN. La caractérisation protéomique de la composition de la chromatine au niveau des régions fonctionnelles distinctes a été jusqu'ici entravé par le manque de protocoles efficaces pour enrichir ces domaines à la pureté et la quantité appropriée pour l'analyse en profondeur ultérieure par spectrométrie de masse (MS). Nous décrivons ici une stratégie de protéomique de la chromatine nouvellement conçu, nommé ChroP (Chro matin P roteomics), dans lequel une immunoprécipitation de la chromatine préparative est utilisée pour isoler les régions de la chromatine distincts dont les caractéristiques, en termes de hPTMs, variantes et co-associés protéines non histoniques, sont analysés par MS. Nous illustrons ilre la mise en place de ChroP pour l'enrichissement et l'analyse des régions d'hétérochromatine transcriptionnellement silencieux, marqué par la présence de tri-méthylation de la lysine 9 sur l'histone H3. Les résultats obtenus démontrent le potentiel de ChroP pour caractériser complètement le protéome de l'hétérochromatine et prouver comme une stratégie analytique puissant pour comprendre comment les déterminants de protéines distinctes de la chromatine et interagissent en synergie pour établir les configurations structurelles et fonctionnelles spécifiques de locus.
Introduction
La chromatine est un complexe nucléoprotéine très dynamique qui est impliqué en tant que modèle primaire pour tous les processus médiés par ADN. Le nucléosome est l'unité répétée de base de la chromatine et est constitué d'un noyau protéique octamère contenant deux molécules de chaque histone H2A canonique, H2B, H3 et H4, autour de laquelle 147 pb d'ADN sont enroulées 1,2. Tous les histones sont structurées comme un domaine globulaire et une "queue" N-terminal flexible qui fait saillie à l'extérieur du nucléosome. L'un des principaux mécanismes de régulation de la structure de la chromatine et la dynamique est basé sur covalentes modifications post-traductionnelles (PTM), qui se produisent principalement sur l'extrémité N-terminales des histones 3,4. modifications des histones peuvent fonctionner soit en modifiant la structure de la chromatine afin supérieur, en changeant les contacts entre les histones-ADN ou entre nucléosomes, et de contrôler ainsi l'accessibilité des protéines de liaison à l'ADN (mécanismes cis), ou en agissant comme DockInsites g de protéines de régulation, soit comme des unités simples ou intégrés dans des complexes multimériques. De telles protéines de régulation peuvent exercer leur fonction de différentes façons: en modulant directement l'expression du gène (à savoir les protéines TAF), ou en modifiant le positionnement des nucléosomes (c'est à dire le remodelage de la chromatine des complexes) ou en modifiant d'autres résidus d'histones (par exemple des protéines avec des méthyl-transférase ou l'acétyl- transférase) (mécanismes trans) 5. L'observation que distincte grappe des modèles PTM à la chromatine locus spécifique conduit à l'élaboration de l'hypothèse que les différentes modifications dans des sites distincts en synergie pour générer un code moléculaire médiation de l'état fonctionnel de l'ADN sous-jacente. Le "code histone hypothèse" a acquis un large consensus dans les années, mais sa vérification expérimentale a été freinée par des contraintes techniques 6,7.
Protéomique à base de spectrométrie de masse (MS) a émergé comme unoutil puissant pour cartographier la distribution de modification des histones et de caractériser les protéines de la chromatine liaison 8. MS détecte une modification comme une Δmass spécifique entre la masse expérimentale et théorique d'un peptide. Au niveau des histones individuelles, MS fournit une méthode objective et globale de la carte MEA, permettant la détection de nouvelles modifications s'enchaînant révélateurs parmi eux 9-14.
Au cours des dernières années, un certain nombre de stratégies ont été développées pour disséquer la composition de la chromatine protéomique, y compris la caractérisation de chromosomes intacts mitotiques, 15 l'identification de protéines solubles de liaison à Hptm 16-18 et l'isolement et l'analyse des régions spécifiques de la chromatine (par exemple télomères) 19,20. Toutefois, l'enquête des synergies spécifiques de locus entre MEA histones, les variants et les protéines de la chromatine associée est encore incomplète. Ici, nous décrivons une nouvelle approche, appelée ChroP (Chro roteomics matin P) 21, que nous avons développés pour caractériser efficacement les domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes. Cette approche s'adapte immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), un protocole bien établi, utilisé dans la recherche en épigénétique, pour l'analyse protéomique MS efficace de l'échantillon enrichi. Nous avons mis au point deux protocoles différents, en fonction du type de la chromatine utilisée comme entrée et l'interrogation adressée par MS; en particulier: 1) morceau de la chromatine native non fixée digéré avec MNase est utilisé pour purifier mono-nucléosomes et à disséquer les hPTMs co-associant (N-ChroP); 2) à puce de la chromatine réticulée fragmenté par ultrasons est utilisé en combinaison avec un interactomique stratégie basée sur SILAC à caractériser toutes les protéines (X-ChroP) contraignant la chromatine co-enrichissement. Nous illustrons ici la combinaison de N-et X-ChroP pour enrichir et d'étudier l'hétérochromatine, en utilisant H3K9me3 comme appât pour les étapes d'immunoprécipitation. L'utilisation de ChroP peut être étendud'étudier soit des régions distinctes sur la chromatine, ou des changements dans la composition de la chromatine dans la même région au cours de la transition à un état fonctionnel différent, ouvrant ainsi la voie à de nombreuses applications dans l'épigénétique.
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Protocol
1. Culture cellulaire
- Milieu standard pour la puce native
- Cultiver des cellules HeLa en Eagle modifié du milieu de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de glutamine, 1% de Pen / Strep et de 10 mM d'HEPES pH 7,5.
- étiquetage SILAC de réticulation ChIP
- Cultiver des cellules HeLa dans du milieu DMEM, SILAC appauvri de la lysine et de l'arginine, complété avec 10% de FBS dialyse, 1% de glutamine, 1% de Pen / Strep, 10 mM HEPES pH 7,5 et, soit la lumière L-lysine (Lys 0) et L- arginine (Arg 0) ou leurs homologues lourds, L-lysine (Lys 8) et de la L-arginine (Arg 10) (tableau Materials), aux concentrations finales de 73 mg / L et 42 mg / L, respectivement.
- Cultiver des cellules pour jusqu'à huit générations en milieu SILAC pour assurer complets acides aminés d'isotopes codé incorporation. Passez cellules tous les deux jours, quand ils atteignent une densité de 1,0-1,5 x 10 6 cellules / ml, en les ensemençant à aconcentration de 3 x 10 5 cellules / ml.
- Évaluer la croissance des cellules et la viabilité à moyen SILAC à individualiser une éventuelle altération de la physiologie qui pourraient résulter de la composition plus pauvres du milieu SILAC; Pour ce faire:
- Inspecter visuellement les cellules au microscope morphologie des tous les jours pendant l'étiquetage.
- Compter les cellules et les courbes de croissance de l'intrigue de la croissance des cellules dans un milieu standard SILAC contre.
2. Natif immunoprécipitation de la chromatine (N-Chip)
- Préparation des noyaux de cellules en culture
- Utilisez 1-2 x 10 8 cellules non marquées HeLaS3 par expérience. cellules de récolte, font partie aliquote de 50 x 10 6 cellules en tubes de 50 ml et centrifuger à 340 g pendant 10 min à 4 ° C, les laver avec du PBS glacé.
- Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 8 ml de tampon de lyse (tableau 1) et incuber pendant 10 min à 4 ° C sur une roue rotative. Verser cachaque lysat cellulaire refully sur un coussin de saccharose (Tableau 1) et centrifugation dans un rotor pivotant, à 3270 xg pendant 20 min à 4 ° C, pour séparer les noyaux de cytoplasme.
- Jeter surnageants, garder pastilles nucléaires et les laver deux fois dans du PBS glacé par centrifugation, éliminer le surnageant à chaque lavage.
- Micrococcique nucléase (MNase) digestion (à petite échelle) et contrôle de la qualité de la chromatine après digestion
- Reprendre le culot nucléaire lavé dans 1 ml de tampon de digestion (tableau 1); diviser en deux aliquotes de 500 pi et garder sur la glace.
- Mesurer la densité optique (DO) à 260 nm d'une portion aliquote, dilué à 1:200 dans 0,2% de dodécylsulfate de sodium (SDS). Remarque: OD = 1 correspond à environ 50 pg / ml d'ADN de la chromatine. Typiquement, à partir de 2 x 10 8 cellules, la densité optique est de l'ordre de 40 à 60.
- Prendre 1% de noyaux, ajouter MNase enzyme à une concentration finale de 0.005 U d'enzyme / pi de noyaux et incuber à 37 ° C pour différents laps de temps (0, 10, 20, 40, 60 min).
- A chaque point de temps, de recueillir 4 pi de noyaux digérés et ajouter 1 mM EDTA pour arrêter la réaction MNase. Garder sur la glace.
- Extraire des échantillons d'ADN par PCR purification kit et éluer les dans 50 ul de tampon TE (tableau 1).
- Prendre 20 pl de chaque échantillon d'ADN, ajouter 10 ul de tampon de charge (tableau 1) et les charger sur des échantillons de 1% (p / v) de gel d'agarose contenant du bromure d'éthidium, avec marqueur PCR comme un contrôle de la taille.
- Vérifiez la digestion évaluer l'échelle nucléosome chromatine produite par MNase incubation.
- Choisir le moment optimal pour la digestion, en fonction de la prévalence de la mono-nucléosomes dans la préparation. . Typiquement, pour 0,005 U d'enzyme / pi de noyaux le moment optimal de MNase digestion est de 60 min (figure 1B, panneau de gauche) Remarque: Le MNase optimale concentration / temps de digestibilitéle peut être ajustée en fonction du type cellulaire souhaité et de la taille du tronçon nucléosomes.
- Large-scale/preparative MNase digestion et la récupération des fractions solubles de la chromatine
- Ajouter à chaque partie aliquote (voir 2.2.1) 5 pl MNase, correspondant à une concentration finale de 0,005 U d'enzyme / pl de noyaux; mélanger doucement et incuber à 37 ° C pendant 60 min (ou en général pour l'intervalle de temps optimisé, sur la base de l'essai à petite échelle).
- Ajouter 1 mM EDTA pour arrêter la réaction et garder sur la glace. Sédimenter les noyaux digérés par centrifugation à 7800 x g à 4 ° C pendant 10 min. Transférer les surnageants (fraction S1) dans un nouveau tube et stocker à 4 ° C. Note: S1 contient la première fraction soluble de la chromatine, comprenant des mono-nucléosomes. Ajouter les inhibiteurs de la protéase (tableau 1).
- Pastilles resuspendre délicatement dans 1 ml de tampon de dialyse (tableau 1) et dialyse pendant une nuit à 4 ° C (cut hors du tube de dialyse est de 3,5 kDa), dans 3 L de tampon de dialyse, avec une agitation modérée constante. Récupérer la matière dialysée et centrifuger à 7800 g pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le surnageant (fraction S2) dans un nouveau tube Eppendorf et stocker à 4 ° C. Remarque: S2 comprend EPTA-nucléosomes, en fonction de la digestion mesure MNase di-à.
- Contrôle de la qualité de la chromatine avant immunoprécipitation
- Prélever une partie aliquote correspondant à 5 pg de S1 et S2 fractions de chromatine (quantifiée par mesure de la DO à 260 nm dans un système de NanoDrop). Extraire de l'ADN par le kit de purification de PCR et on élue dans 50 ul de tampon TE (tableau 1).
- Prenez 20 pi de S1 et S2 ADN, mélanger avec 10 pi Chargement tampon (tableau 1) et les charger sur 1% (p / v) de gel d'agarose. Vérifier la qualité et l'efficacité de la digestion MNase par inspection visuelle de l'échelle des nucléosomes. Remarque: Fraction S1 est trèsenrichi en mono-nucléosomes, tandis que la fraction S2 contient principalement des poly-nucléosomes (figure 1B, panneau de droite).
- L'incubation avec l'anticorps de la chromatine
- Conserver à -20 ° C 50 pi de fraction S1 pour analyse ultérieure de spectrométrie de masse.
- Ajouter 1 volume de tampon de dilution ChIP (Tableau 1) pour la fraction S1.
- Ajouter l'anticorps contre le Hptm (ou protéines) d'intérêt; incuber pendant la nuit sur une roue tournant à 4 ° C. Remarque: En règle générale, utiliser 10 ug à 20 pg d'anticorps pour 2 x 10 8 cellules. Le rapport optimal entre la quantité d'anticorps et le nombre initial de cellules doit être réglée avec soin au cas par cas, en fonction de l'abondance du Hptm / protéine utilisée comme appât à l'intérieur de l'échantillon et sur l'efficacité de l'anticorps. L'optimisation est expérimental, sur la base des critères suivants:
- Comparer la quantité de Hptm / protéine d'intérêt entre l'entrée et passage (FT,voir 2.7.2) par Western Blot ou MS pour vérifier que l'immunoprécipitation enrichit une proportion significative de région spécifique de la chromatine. Remarque: Ceci est généralement obtenu lorsque au moins 50% de l'appât Hptm / protéine est épuisé dans le FT (figure 1C) .
- Vérifier que la protéine immunoprécipitée d'intérêt est détectable sur gel SDS-PAGE, ce qui assure qu'une quantité suffisante de matière est disponible pour l'analyse de MS. Remarque: La présence sur le gel des bandes correspondant aux quatre histones de noyau à la stoechiométrie correcte indique que le nucléosome intact a été immunoprécipitée par le N-ChroP (Figure 1D). Le manque de la stoechiométrie correcte est en fait représentatif d'une interruption partielle / déroulement du nucléosome.
- En parallèle, préparer les billes magnétiques G-couplé protéines (voir 2.6).
- Équilibrage et le blocage des billes de protéine G magnétiques couplés
- Equilibrer 100 pi de protéine G-billes magnétiques couplées suspension dans la solution de blocage (tableau 1), en lavant trois fois et en les incubant pendant la nuit à 4 ° C sur une roue rotative. Remarque: la suite de la capacité de liaison de perles, en utilisant 100 ul de suspension de 2-20 pg d'anticorps.
- Laver les billes bloqués une fois avec la solution de blocage, puis deux fois avec le tampon de dilution puce (tableau 1).
- Ajouter 100 ul de billes bloquées à l'échantillon de chromatine S1 et incuber sur une roue en rotation à 4 ° C pendant 3 heures. Centrifuger à 340 g pendant 1 min à centrifuger l'échantillon du couvercle des conseils. Mettez dans un rack magnétique pour sédimenter les billes.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf. Ceci est le débit à travers (FT), à savoir la fraction de la chromatine qui ne s'est pas liée à l'anticorps.
- Laver les billes quatrefois dans du tampon de lavage (tableau 1) en augmentant la concentration en sel à chaque lavage (75, 125 et 175 mM NaCl).
- Pour éluer la chromatine immunoprécipitée, incuber les billes dans 30 pl de tampon d'échantillon LDS, complété avec 50 mM de dithiothréitol (DTT) pendant 5 min à 70 ° C. Séparer les protéines éluées sur un gel de gradient 4-12% de Bis-Tris acrylamide SDS-PAGE, préfabriqué et tacher le gel avec le kit de coloration au bleu de Coomassie colloïdal (figure 1D).
3. Réticulation immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-X)
- Réticulation des cellules avec du formaldéhyde
- Ajouter 0,75% de formaldéhyde à des cellules SILAC marqué, mélanger brièvement et incuber pendant 10 min à température ambiante. Étancher le formaldéhyde par addition de glycine 125 mM et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
- Diviser les cellules dans 5 x 10 7 aliquotes; rincer trois fois avec du PBS glacé par centrifugation à 430x g pendant 5 min à 4 ° C et à rejeter les surnageants après chaque lavage. Au dernier lavage, éliminer le surnageant et garder le culot. Remarque: Une fois que les cellules sont réticulés, ils peuvent être stockés à -80 ° C s'il n'est pas utilisé immédiatement.
- Préparation des noyaux
- Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 10 ml de tampon de lyse (tableau 1). Incuber pendant 10 min à 4 ° C avec rotation. Centrifuger à 430 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant; garder pastilles nucléaires.
- Reprendre chaque culot nucléaire dans 10 ml de tampon de lavage (tableau 1). Incuber à température ambiante pendant 10 min sur une roue rotative.
- Centrifuger à 430 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et recueillir les granulés.
- Remettre en suspension chacun des pastilles nucléaires dans 3 ml ChIP tampon d 'incubation (tableau 1). Garder sur la glace.
- Chromatine ultrasons et contrôle de la qualité
- Soniquer ch. romatin à 200 W (cycles de 30 sec "sur" et 1 min "off"), dans un Bioruptor refroidi, à fragmenter la chromatine Remarque: le nombre de cycles et des intervalles de sonication dépend du type de cellule et sur la durée moyenne de nucléosomique étirer souhaitée. Typiquement, 30 min de sonication sont nécessaires pour générer des fragments d'ADN de 300-500 paires de bases en longueur, correspondant à di-et tri-nucléosomes. Le choix de la taille des fragments dépend du type de domaine de chromatine à l'étude.
- Prendre 2% de l'apport total, inverser la réticulation par incubation à 65 ° C pendant un minimum de 1 heure dans la puce tampon d'incubation. Extraire l'ADN par PCR purification kit, éluer dans 50 ul de TE Buffer et charger l'ADN sur gel d'agarose pour vérifier la fragmentation de la chromatine.
- L'incubation avec l'anticorps de la chromatine
- Ajouter 1/10 de volume de 10% de Triton X-100 à la chromatine traitée aux ultrasons. Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C pour former un culot debris.
- Enregistrer 50 pi de l'entrée de la chromatine de cellules lourds pour tester le niveau de SILAC acides aminés d'incorporation dans les cellules marquées et pour la protéine profilage.
- Ajouter l'anticorps de choix pour la chromatine lourde et légère marqué restant soumis aux ultrasons et incuber une nuit à 4 ° C sur la roue tournante. Dans le canal de lumière, ajouter aussi une fois en excès du peptide soluble. Incuber pendant une nuit à 4 ° C sur une roue rotative Notes:. L'état optimal entre le pg d'anticorps et de la matière de départ de cellules est choisi au cas par cas, comme on le verra en 2.5.3. Le optimale excès d'un facteur molarité du peptide soluble dans le respect de l'anticorps doit être augmentée avec précaution au cas par cas.
- Isolement de la chromatine en utilisant des billes magnétiques
- Equilibrer et bloquer la protéine G billes magnétiques couplés en suivant les étapes décrites dans 2.6 et utilisant le morceau de tampon d'incubation.
- Ajouter 100 pi de b bloquéEADS échantillons de chromatine et incuber sur une roue en rotation pendant 3 heures à 4 ° C. Centrifuger à 340 g pendant 1 min à centrifuger l'échantillon du couvercle des conseils. Mettez dans un rack magnétique pour sédimenter les billes. Le surnageant est l'écoulement à travers (FT), contenant nucléosomes non liés. Laver quatre fois dans de perles de Tampon de lavage (tableau 1) avec l'augmentation de la concentration de sel (deux lavages à 150 mM et les deux à 300 mM de NaCl).
- Incuber perles dans 30 ul SDS-PAGE Chargement Sample Buffer (tableau 1) et pendant 25 minutes à 95 ° C à la fois élution et dé-réticulation des protéines immunoprécipitées. Protéines séparées sur 4-12% Bis-Tris acrylamide SDS-PAGE gels préfabriqués (figure 3D).
4. Préparation de l'échantillon Avant de MS
- En-Gel digestion des histones enrichies de N-ChIP
Remarque: lors de la digestion des protéines et d'extraction de peptide étapes prennent soinpour minimiser les contaminations kératiniques qui interfèrent avec LC-MS/MS, comme décrit précédemment 22, 23.- tranches de gel de coupe correspondant aux histones bandes (figure 1D). De-tacher les morceaux de gel avec 50% d'acétonitrile (ACN) dans le trou DDH 2 O, en alternance avec 100% d'ACN pour réduire le gel. Répétez jusqu'à ce que les gels morceaux sont complètement dé-tachés et les sécher dans une centrifugeuse sous vide.
- Ajouter D-6 anhydride acétique 01:09 (v / v) dans 1 M de bicarbonate d'ammonium (NH 4 HCO 3) (typiquement le volume final est de 60 à 100 ul) et 3 pl d'acétate de sodium (CH 3 COONa), en tant que catalyseur. Incuber pendant 3 heures à 37 ° C avec de fortes secousses. Remarque: L'échantillon peut générer des bulles dans les premières minutes après l'assemblage de la réaction: il est important de gérer avec prudence et libérer le gaz généré, ouverture de temps en temps les tubes au cours de l'incubation.
- Rincer les morceaux de gel à plusieurs reprises with NH 4 HCO 3, alternent avec ACN à accroître le pourcentage (de 50% à 100%), afin d'éliminer totalement les résidus de D-6 anhydride acétique.
- Rétrécir les morceaux de gel de 100% d'ACN; les sécher dans une centrifugeuse sous vide pour assurer l'hydratation complète de-. Réhydrater morceaux de gel avec de la glace-froid 100 ng / ul de solution de trypsine dans 50 mM de NH 4 HCO 3 et incuber pendant une nuit à 37 ° C. Remarque: La combinaison de la modification chimique des lysines en utilisant l'anhydride acétique deutéré et digestion par la trypsine génère un "Arg- C certainement "dans le modèle de la digestion de gel des histones 21,24.
- Jetez l'excès de solution et ajouter un volume de 50 mM NH 4 HCO 3 pour couvrir complètement les morceaux de gel; incuber une nuit à 37 ° C.
- Recueillir des peptides digérés solubles dans un nouveau tube Eppendorf. Lyophiliser peptides. Remettre en suspension dans 0,5% d'acide acétique de l'acide trifluoroacétique acid/0.1 de% (TFA). Dessaler et se concentrerpeptides sur une phase inverse C 18 / carbone "sandwich" et chromatographie échangeuse d'ions (SCX) sur microcolonnes faits à la main (StageTip) 25.
- Préparer les microcolonnes de StageTip en mettant disques de grillages en téflon contenant C immobilisé 18 / carbone («sandwich») et perles SCX dans un 200 conseils ul. Procurez-vous le "sandwich" en chargeant le C 18 Microcolonne sur une deuxième pointe chargé avec filtre à charbon. Remarque: Les peptides très courts, qui ne sont pas retenus sur le filtre C 18, passer dans le flux continu qui est chargé directement sur le Conseil de carbone, qui les capture généralement. StageTips SCX peuvent enrichir peptides spécifiques, tels que H3 (3-8) peptidiques, pas efficacement retenu par chromatographie en phase inverse.
- Charge de 50% de peptides sur la C 18 / carbone «sandwich StageTip" et 50% sur SCX StageTips. Les éluer des Conseils C 18 / carbone à l'aide de 80% ACN/0.5% ac acétiqueid et de la Conseils SCX avec 5% d'hydroxyde d'ammonium (NH 4 OH) / 30% de methanol. Après peptides lyophilisation, remettre en suspension dans 0,1% FA et analyser par LC-MS/MS.
- Digestion des protéines dans le gel immunopurifiés
Digestion des protéines dans le gel est réalisée de la manière décrite précédemment 22, avec des modifications mineures.- Couper chaque voie en dix tranches (figure 3D) et chaque tranche en petits cubes de 1 mm 3. De-tacher les morceaux de gel avec 50 mM de NH 4 HCO 3/50% d'éthanol et ajouter de l'éthanol absolu pour rétrécir les gels. Répétez jusqu'à ce que les gels sont complètement de-colorées.
- Ajouter un tampon de réduction (tableau 1) pour les morceaux de gel pendant 1 heure à 56 ° C, suivi par l'addition d'un tampon d'alkylation (tableau 1) pendant 45 min à température ambiante, dans l'obscurité. Laver et sécher les morceaux de gel dans la centrifugeuse sous vide.
- Réhydrater les morceaux de gel avec de la glace-froid 12,5 ng / ul trypsine solution dans 50 mM de NH 4 HCO 3 et incuber sur de la glace jusqu'à ce que la réhydratation complète des morceaux de gel. Retirer la trypsine en excès.
- Ajouter 50 mM NH 4 HCO 3 pour couvrir complètement les morceaux de gel. Incuber pendant une nuit à 37 ° C.
- Recueillir la partie liquide. Ajouter du tampon d'extraction (tableau 1) pour les morceaux de gel; incuber avec une forte agitation pendant 10 min à température ambiante. Répéter deux fois.
- Incuber les morceaux de gel dans de l'ACN pendant 10 min sous forte agitation. Répéter deux fois et en commun tous les surnageants.
- Lyophiliser les peptides. Reprendre peptides secs dans 0,5% d'acide acétique acid/0.1% de TFA.
- Dessaler et se concentrer peptides sur une phase inverse C 18 StageTip, comme décrit 26, 27.
- Éluer les peptides à partir de la StageTip C 18 en utilisant 80% d'acide acétique ACN/0.5%. Éliminer le solvant organique par évaporation dans une centrifugeuse sous vide et remise en suspension des peptides à 0,1% FA (typiquement de 5 à 10 et# 181; l), lorsqu'il est prêt à l'analyse de la MS.
5. LC-MS Analyse
- Une analyse par Chromatographie liquide
- Emballer la colonne analytique à un 15 cm condensé émetteur de silice (75 um de diamètre intérieur, de 350 pm de diamètre extérieur), en utilisant en phase inverse (RP) en C 18, 3 résine um dans le méthanol, à une pression d'hélium constante (50 bar) en utilisant un dispositif bombe-chargeur, comme décrit précédemment 28.
- Couple l'émetteur emballé (C 18 sur une colonne de RP) directement à la sortie de la vanne 6-port de la HPLC à travers un long (diamètre intérieur de 25 um) de 20 cm de la silice fondue, sans utiliser de pré-colonne ou un dispositif partagé.
- Chargez les peptides digérés à C 18 colonne de RP au débit de 500 nl / min phase mobile A (0,1% FA / 5% d'ACN dans le trou DDH 2 O).
- Après chargement de l'échantillon, séparer les peptides en utilisant les gradients suivants:
- Appliquer 0-40% de phase mobile B (0,1% FA/99% ACNdans le trou DDH 2 O) à 250 nl / min sur 90 min, suivi par un gradient de 40 à 60% en 10 min et de 60 à 80% sur 5 min, pour l'élution des peptides dérivant de histones (voir 2).
- Appliquer 0-36% de phase mobile B à 250 nl / min pendant 120 minutes, suivi par un gradient de 36 à 60% en 10 min et de 60 à 80% sur 5 min, pour l'élution des peptides dérivant de protéines immuno purifiés (voir 3).
- Analyse de spectrométrie de masse utilisant LTQ-FT-ICR-Ultra spectromètre de masse
- Fonctionner dans une acquisition de données dépendant Mode (DDA) pour commuter automatiquement entre les États membres et l'acquisition MSMS. MS spectres complets sont acquis, typiquement dans la gamme m / z de 200-1,650, est acquis à la résolution R = 100 000 à 400 m / z. Les cinq (Top 5) des ions les plus intenses sont isolés pour la fragmentation dans le piège à ions linéaire à l'aide d'une dissociation induite par collision (CID) à une valeur cible de 5000.
- Utilisez les paramètres énumérés dans le tableau 2 for le fichier d'acquisition "Tuning".
- Définissez les paramètres d'acquisition standards comme indiqué dans le tableau 2.
6. Analyse des données
- Étiqueter libre quantification des modifications des histones co-enrichis dans les domaines de la chromatine
- Convertir les fichiers brutes acquises aux fichiers mgf l'aide du logiciel Raw2msm (version 1.10) 29.
- Rechercher les modifications des histones en utilisant mascotte Deamon (version 2.2.2), le réglage des paramètres décrits dans le tableau 3.
- Sur la sortie liste de peptide mascotte, retirez peptides avec un score inférieur à 15 ou de plus de 5 MEA putatifs 29. Remarque: Pour chaque ID de peptide unique, sélectionnez le peptide avec le meilleur score Mascot et filtrer toutes les autres peptides redondants avec le même ID .
- Construire les chromatogrammes d'ions extraits (XIC) pour chaque précurseur correspondant à tous les peptides modifiés, based sur la valeur m / z, en utilisant la QualBrowser. Calculer l'aire sous la courbe (AUC) pour chaque pic (figure 2A).
- Validez chaque peptides identifiés contenant des modifications par inspection visuelle des spectres MS / MS en utilisant le QualBrowser (figure 2B).
- Calculer l'abondance relative de chaque peptide modifié. Calcul de l'enrichissement relatif de chaque modification dans le matériau ChIP-ed Remarque:. Abondance relative est calculée comme le rapport entre l'AUC de chaque peptide modifié spécifique sur la somme des AUC de toutes les formes modifiées et non modifiées de la même peptide, tandis que par rapport enrichissement en tant que rapport de l'abondance relative de la modification spécifique dans la puce au-dessus de l'entrée (figure 2C).
- Analyse protéomique quantitative des protéines co-associé dans les domaines de la chromatine
- Pour les protéines identification et la quantification utilisent le package MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) 30. Configurer le moteur de recherche intégré "Andromeda" en utilisant le AndromedaConfig.exe 31 et définir les paramètres de recherche répertoriés dans le tableau 3.
- essai de constitution
- Estimer le degré d'incorporation d'acides aminés dans les protéines lourds en entrée de la chromatine lourde marqué, en utilisant un logiciel MaxQuant, comme suit:
- Définissez les paramètres comme indiqué au point 6.2, mais de désactiver l'option re-quantifier.
- Calculer le pourcentage d'incorporation appliquant la formule suivante à des taux de peptide non redondants. Incorporation (en%) = rapport (H / L) / rapport (H / L) + 1 x 100 (figure 3B) Note: Accepter que si incorporation> 95 %.
- Estimer le degré d'incorporation d'acides aminés dans les protéines lourds en entrée de la chromatine lourde marqué, en utilisant un logiciel MaxQuant, comme suit:
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Representative Results
Immunoprécipitation de la chromatine est une technique puissante utilisée pour le profil de la localisation d'une protéine ou d'une modification d'histone long du génome. Dans un protéomique équivalent, Chip est suivie par la protéomique MS pour identifier qualitativement et quantitativement les hPTMs, variants d'histones et des protéines de la chromatine de liaison qui sont immunoprécipités avec la modification ou de la protéine d'intérêt, utilisées comme «appât». Dans l'approche N-ChroP, présenté sur la figure 1A, la puce d'origine, dans lequel la chromatine est digéré par MNase (figure 1B), est utilisé comme entrée pour purifier en vrac chromatine un domaine fonctionnel distinct. Chromatine digéré enrichie en mono-nucléosomes est incubé avec un anticorps spécifique et les protéines immuno purifiés sont séparés par SDS-PAGE. Dans l'exemple illustré, H3K9me3, marqueur de la chromatine silencieuse 32,33, est utilisé pour mettre en place l'approche. Le choix est basé sur le fait que son rôle fonctionnel à la fois en tant queainsi que certains de ses interacteurs protéiques sont bien décrits. En outre, un anticorps hautement spécifique et efficace optimisé pour ChIP est disponible 34, comme aussi confirmé par un examen visuel du gel au bleu de Coomassie, où le nucléosome intacte, avec les histones de noyau à la stoechiométrie correcte, est enrichi en des quantités appropriées pour la SEP (Figure 1D ).
La comparaison entre la quantité de H3K9me3 présent dans le passage (FT) et d'entrée (IN) indique qu'environ 50% de la région d'intérêt est immunopurifié et n'incluent pas le risque d'un biais dû à l'enrichissement d'une sous-population mineure de chromatine (figure 1C). MS est utilisée pour caractériser la MEA co-associé dans les nucléosomes enrichis: chacune des histones de coeur est digéré en utilisant un protocole conçu ad hoc, afin de parvenir à un «Arg-C comme" digestion, en gel de polyacrylamide. En effet, d'une part, Arg-C est la meilleure pour l'analyse de protease hPTMs b MSarce qu'il produit des peptides de longueur optimale; d'autre part, elle ne clive pas efficacement en gel. Pour surmonter cette limitation, notre protocole adapté exploite l'alkylation chimique de lysine obtenu en incubant des bandes de gel d'histones avec deutéré (D 6) d'anhydride acétique, suivie d'une digestion par la trypsine. Depuis la trypsine ne clive pas D lysines 3-acétylés, les peptides résultant mélange imite un "Arg-C comme" modèle (figure 1E).
L'addition d'un 3-acétyl D fragment d'une lysine produit une masse delta sans ambiguïté de 45,0294 daltons, la discrimination entre les acétylations natifs et ajoutés chimiquement dans la SEP. En outre, D 3-acétylation offre deux avantages supplémentaires qui facilitent le discernement des peptides modifiés isobares: d'abord, l'alkylation se produit uniquement sur les lysines méthylées et non modifiés mono-, mais pas sur les résidus de di-et tri-méthylés; que ces peptides modifiés portant le même totnombre de modifications al mais dans des dispositions différentes sont décorées différemment par ensemble distinct de D 3 groupes-acétyle qui produisent sans ambiguïté m / z changements. Deuxièmement, les modes distincts de D 3-alkylation font légèrement différents temps de rétention en chromatographie liquide sur colonne en phase inverse, ce qui génère un niveau supplémentaire de séparation de peptides modifiés isobares 21.
Après validation de tous les hPTMs par inspection manuelle des spectres MS / MS correspondant (figure 2B), l'étiquette sans quantification est réalisée en deux étapes: d'abord, nous calculons l'abondance relative de chaque modification à l'aide de l'intensité du signal des espèces non modifiés et modifiés pour le peptide correspondant, mesuré par l'intermédiaire du calcul des chromatogrammes d'ions extraits (XIC) (figure 2A et 2C, panneau supérieur); en second lieu, l'enrichissement relatif est estimé comme le rapport entre l'abondance relative de chaque modification dans l'octamère ChIP-ed et l'abondance relative de l'entrée correspondant (figure 2C, panneau inférieur). L'analyse de la H3 (9-17) peptide montre l'enrichissement de di-et de tri-K9 méthylée, avec l'épuisement correspondant des formes non modifiées et des mono-méthylé (Figure 2C). Avec cela entraîne comme témoin positif pour la spécificité des anticorps, la co-association ou de l'épuisement de toutes les autres modifications peuvent être évalués, tant au niveau intra-moléculaire sur le même H3 et au niveau inter-moléculaire, sur d'autres histones co-enrichis dans le même nucléosome. Ceci permet le criblage de hPTMs croisées entretiens dans les domaines H3K9me3, le soi-disant "modificome d'hétérochromatine" (figure 2D): l'enrichissement significatif de marqueurs connus liés à l'inactivation de gène, à l'épuisement correspondant de marqueurs liés à l'activation de gènes est observée . En outre, de nouvelles associations sont détectés comme l'enrichissement de H3K18me1.
Pour le dépistage de toutes les protéines co-associant dans l'hétérochromatine, la réticulation ChIP classique est combiné avec SILAC (isotopes stables étiquetage par acides aminés dans la culture cellulaire) (figure 3A). Dans l'expérience de SILAC, la lysine et l'arginine (forme légère) sont remplacés par leurs analogues marqués par des isotopes (forme lourde) dans le milieu de culture. Sur des cellules cultivées et de réplication à la fois la lumière et les médias lourds, les deux acides aminés d'isotopes codé de manière différentielle sont métaboliquement incorporés dans des protéines, générant légers et lourds formes de protéines, respectivement, qui se distinguent par MS, en raison d'une Δmass spécifique. Avant de commencer une expérience de SILAC à grande échelle, l'efficacité de l'étiquetage est évaluée, le calcul du niveau d'incorporation, mesurée par la fraction de pourcentage de peptides lourds par rapport à la somme de celles lourdes et légères, a trouvé dans l'échantillon seulement lourde marqué. Incorporation supérieure à 95% pour les deux arginine lourd et ilAvy lysine est nécessaire pour la quantification précise des protéines (Figure 3B). Après réticulation de cellules lourdes et légères, la chromatine est fragmenté par sonication. SILAC est utilisé en conjonction avec un test de compétition en utilisant un excès d'un facteur de peptide soluble H3 (K QTAR StGG) qui porte tri-méthylation sur K9 afin de discriminer interacteurs H3K9me3 spécifiques de fond. Le peptide soluble est ajouté en excès à l'une des deux expériences SILAC de puce, où il sature la capacité de liaison de l'anticorps, donc «concurrentes» la majorité des H3K9me3-nucléosomes et, en conséquence, tous les interacteurs spécifiques. Dans l'autre canal de SILAC, le peptide concurrence n'est pas ajouté à la puce et l'immunoprécipitation a lieu normalement. Expériences SILAC-concurrence sont généralement effectuées en double exemplaire dans ce qu'on appelle "avant" et "Reverse" formats, où la concurrence avec l'excès de peptide soluble passe de ee lourde (H) à la lumière (L) des échantillons de la chromatine. Il en résulte inversées complémentaires lectures de rapport de SILAC, utilisés pour discerner véritable de liants non spécifiques: protéines spécifiquement enrichis sont présents avec une intensité plus élevée dans la forme lourde par rapport à la forme de lumière (taux de protéine H / L> 1) dans l'expérience où l'excès de peptide est ajouté à la chaîne de lumière (Forward) (figure 4A, panneau supérieur); une tendance inverse (rapport de la protéine H / L <1) est observée dans la réplique inverse (Figure 4A, panneau inférieur). Protéines dont l'intensité sous la forme lourde et légère sont semblables dans les deux sens d'expériences produisent un rapport proche constante à 1 et sont classés comme arrière-plan (figure 4B).
Le choix de l'excès d'un facteur optimal pour le peptide soluble est importante et doit être réglée avec précision. En règle générale, nous avons mis la proportion correcte anticorps-à-peptide réalisation d'un essai USI de la concurrenceng dilutions en série de l'excès de peptide et en comparant le niveau de la «appât» (Hptm / protéine) entre la puce de contrôle positif, où le peptide n'est pas ajouté, et les différentes puces de la concurrence de série, par Western Blot ou MS. Généralement, le peptide excès d'un facteur optimal de réduire d'environ 90% la quantité de Hptm / protéine dans la matière immunoprécipitée. En effet, d'une part, plus le rapport de la protéine obtenue est élevée, plus le pouvoir de discrimination de SILAC; d'autre part, une saturation excessive par le peptide peut expulser complètement les liants spécifiques de l'anticorps, ce qui conduit à des ratios manquant H / L pour la quantification et de l'analyse statistique. Pour anticorps H3K9me3 nous avons défini la proportion correcte en mesurant le rapport H / L pour le QTARK (ME3) StGG peptide, dans un test de compétition réalisée dans un avant mis en place et nous avons pris cette valeur comme une mesure de l'efficacité de la concurrence (figure 3C ).
L'intersection de la une de l'avantd inverse expériences X-Chip conduit à l'identification de 635 protéines, présentes dans les deux expériences et quantifiés avec au moins deux chiffres rapport. Le journal 2 parcelle de leurs rapports H / L représente la soi-disant "heterochromatome" (figure 4C), où les véritables interacteurs H3K9me3 sont identifiés sans ambiguïté que les protéines présentes dans le top 40% des distributions de ratio de protéines (en haut à quadrant droit de le nuage de points et la figure 4D).
Figure 1: Schéma du flux de travail A) Schéma de la puce native associée à l'analyse MS N-ChroP.. Chromatine de cellules est digéré avec MNase et la fraction enrichie en mono-nucléosomes (S1) est immunoprécipitée en utilisant un anticorps anti-H3Anticorps K9me3. Protéines immunopurifiés sont séparées par SDS-PAGE et histones sont en gel-digéré par un protocole ad hoc pour imiter une digestion Arg-C. Les peptides sont analysés par nano-LC-MS/MS. MEA histones sont identifiés, validés par l'inspection manuelle des spectres MS / MS et quantifiés B) test de MNase à petite échelle:. l'ADN résolus sur un gel d'agarose à 1% après digestion de la chromatine avec MNase à différents laps de temps (panneau de gauche); grande échelle MNase digestion. ADN résolu sur un gel d'agarose à 1% après 60 minutes d'MNase chromatine digestion et après la séparation de la fraction S1, contenant des mono-nucléosomes de S2 faction, contenant des poly-nucléosomes (panneau de droite) C) Estimation de l'enrichissement / épuisement de non modifiée, mono-, di-, et tri-K9 méthylée en écoulement (FT) par rapport à l'entrée (IN). Histogramme représente la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes pour chaque modification. D) SDS-PAGE de l'entrée de la chromatine et de co-immuno protéines purifiées: noyau histones H3, H4, H2A et H2B sont visibles autour et en dessous de la bande 17kDa, avec H3 et H2B co-migration (carrés noirs) E) Chaque histone de base de deux nucléosomes immunoprécipitées et entrée sont chimiquement alkylée deutéré (. D 6)-acétique-anhydride avant traitement à la trypsine, de manière à obtenir un "Arg-C comme" en gel digestion. Le D-6 anhydride acétique réagit avec le groupe amino epsilon des lysines non modifiés et de mono-méthylé et non méthylé avec des di-, tri-lysines méthylées et acétylés. Comme résultat, l'activité enzymatique de la trypsine est bloquée sur toute la lysine acétylée native et chimique, produisant ainsi un "Arg-C comme" schéma de digestion. Ce chiffre a été modifié depuis 21, en utilisant la figure 1, la figure S1 et S5 figure comme référence. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2:. Analyse de spectrométrie de masse de la "modificome" H3K9me3 A) spectres de masse zoomée et les chromatogrammes d'ions extraits (XIC) construit à la valeur m / z correspondant de la 2 + charger non modifiée, mono-, di-, et tri-méthylé K9 dans le H3 (9-17) peptide, à la fois pour les échantillons d'entrée et de la puce. B) spectres MS / MS Représentant utilisant la fragmentation CID. Les séries d'ions b et y-ioniques permettent de définir la séquence de H3 (9-17) peptide et de localiser précisément la tri-méthylation sur K9 résidu. C) L'abondance relative des différents degrés de méthylation sur le H3 K9 en ( 9-17) peptide, estimée en divisant l'aire sous la courbe (AUC) de chaque peptide modifié par la somme de l'aire correspondant à la totalité unmodifi observéeed et des formes modifiées de ce peptide, dans l'octamère d'entrée et ChIP-ed. Histogramme représente la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes pour chaque modification (panneau supérieur). Enrichissement relatif des méthylations K9 dans H3 (9-17) peptide. L'enrichissement est exprimé par le rapport log 2 entre l'abondance relative de chaque méthylation dans l'octamère ChIP-ed comme comparer à l'entrée. Histogramme représente la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes (panneau inférieur). D) Heatmap résumant l'enrichissement de tous les co-hPTMs associant identifiés sur l'histone H3, H4 et H2A. Chaque ligne correspond à une modification différente (e ne sont pas détectés modifications). Ce chiffre a été modifié depuis 21, en utilisant la figure 1, figure 2, les figures 3 et S10 comme référence. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3: Vue schématique de X-ChroP flux de travail A) Schéma de réticulation puce combinée à l'analyse MS.. Les cellules cultivées à la lumière et les médias lourds sont fixés avec des entrées de formaldéhyde et de la chromatine sont fragmentés par ultrasons pour produire des fragments d'ADN. Dans un avant mis en place, la chromatine lourde marqué soniqués est immunoprécipitée en utilisant un anticorps anti-H3K9me3 tandis que la chromatine lumière marqué est incubée avec le même anticorps saturé avec un excès d'un facteur soluble peptide H3 portant K9me3. Les protéines immunoprécipitées à partir de chromatine lourdes et légères sont réunies, extraites et séparées par SDS-PAGE. Les protéines sont digérées par la trypsine et les peptides sont analysés par nano-LC-MS/MS. B) l'efficacité de l'étiquetage SILAC est surveillée calculer l'incorporation de lys lourdsine (Lys8) et l'arginine (Arg10) en protéines. Dans la parcelle, la médiane de la distribution de densité lysine et arginine de peptides est égal à 0,974 (ligne verte) et 0,964 (ligne rouge), respectivement. C) spectres de masse zoomée à la valeur m / z correspondant de la 2 + charger tri-méthylé K9 dans le H3 (9-17) peptide, à la fois pour la lumière et les formes lourdes, en entrée et ChIP-ed octamère. Alors que dans l'entrée des intensités de peptide lourde et légère sont proches de 1, dans le Forward SILAC puce, l'intensité de la lumière peptide est beaucoup plus faible que celui de la contrepartie lourde, indiquant ainsi une concurrence efficace. D) SDS-PAGE de la lumière (L) et lourde (H) étiquetés entrée de la chromatine et de matériel co-immunoprécipitation: la voie correspondant à la matière ChIP-ed est découpé en dix tranches (ligne noire), alors que seulement deux tranches de l'entrée sont analysés pour l'analyse des tests d'incorporation ( ligne bleue). Ce chiffre a été modifié depuis 21, en utilisant les figures 4 et S6 comme nouveauConférence. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 4: analyse de spectrométrie de masse de la "interactome" H3K9me3. A) plein spectre représentatif montrant la SILAC paire correspondant à des peptides et des protéines HP1 de macro-2A: les ratios H / L> 1 dans l'expérience (panneaux supérieurs à terme), en miroir par un ratio H / L <1 dans la réplique inverse (panneaux inférieurs), démontrer l'enrichissement spécifique de ces protéines dans l'hétérochromatine B) spectre complet représentant avec SILAC paire correspondant au peptide de protéines d'un fond:. rapports H / L en marche avant et arrière répétitions sont égaux à 1 C) protéines quantifiées. sont distried dans un nuage de points en fonction de leurs SILAC-ratios à l'avant et des expériences inverses (axes X et Y, respectivement); pointillés rouges représentent les 40% et 30% de taux de protéines, comme indiqué. ratios D) de protéines distributions depuis l'entrée (H / L mélangé 1:1) (noir), Attaquant (bleu) et marche arrière (orange) X-ChroP expériences; pointillés rouges représentent les 40% de taux de protéines, définies comme seuils pour sélectionner les interacteurs authentiques. Ce chiffre a été modifié depuis 21, en utilisant comme référence la figure 5. Cliquez ici pour agrandir l'image.
| Tampon pour la section 2 | Composition |
| Lysis Buffer | 10% de saccharose, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 15 mM de NaCl, KCl 60 mM, HEPES 15, 0,5% de Triton, PMSF 0,5 mM, DTT 1 mM, mM NAF 5, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml d'aprotinine, 5 mg / ml de pepstatine A, 5 mg / ml de leupeptine |
| Coussin de saccharose | 2 g de saccharose dans 20 ml de tampon de lyse |
| Digestion Buffer | 0,32 M de saccharose, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 4 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2, 0,1 mM de PMSF |
| Tampon TE | 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM d'EDTA |
| Dialyse tampon | 10 mM Tris-HCl pH 7,6, EDTA 1 mM, PMSF 0,5 mM, 5 mM NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, les inhibiteurs de protéase cocktail |
| ChIP Dilution Buffer | 100 mM Tris HCl pH 7,6, 100 mM de NaCl et 10 mM d'EDTA |
| Solution de blocage | BSA à 0,5% dans du PBS |
| Tampon de lavage | 50 mM Tris-HCl pH 7.6,10 mM EDTA |
| Inhibiteurs de la protéase | Sans EDTA inhibiteurs de la protéase cocktail, PMSF 0,5 mM, mM NAF 5 mM Na3VO4 5, 5 mM NaButyrate |
| Chargement en tampon | colorant de charge d'orange, 50% (v / v) de glycérol dans H20 |
| Tampon pour la section 3 | Composition |
| Lysis Buffer | 50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 10% de glycerol, 0,5% de NP-40, 0,25% de Triton-100, 0,5 mM de PMSF, 5 mM NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml d'aprotinine, 5 mg / ml de pepstatine A, 5 mg / ml de leupeptine |
| Tampon de lavage | 10 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, PMSF 0,5 mM, 5 mM NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml d'aprotinine, 5 mg / ml de pepstatine A , 5 mg / ml de leupeptine |
| ChIP tampon d'incubation | 10 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, désoxycholate de sodium à 0,1%, lauroylsarcoside de sodium à 0,5%, PMSF 0,5 mM, mM NAF 5, 5 mM de Na 3 VO 4, mM NaButyrate 5, 5mg / ml d'aprotinine, 5 mg / ml de pepstatine A, 5 mg / ml de leupeptine |
| Tampon de lavage 2 | 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 2 mM EDTA, 0,1% de SDS, 1% de Triton-100 |
| Tampon Chargement de l'échantillon | 250 mM Tri-HCl pH 8,8, 0,5 M b-mercaptoéthanol, 2% SDS |
| Tampon pour l'article 4 | Composition |
| Alkylation tampon | 55 mM Iodoacetamide dans 50 mM NH 4 HCO 3 |
| Réduction tampon | 10 mM de dithiothréitol à 50 mM de NH 4 HCO 3 |
| Extraction Buffer | 30% d'ACN et de 3% de TFA dans le trou DDH 2 0 |
Tableau 1. Composition des tampons.
| Tuning fichier d'acquisition | Paramètres |
| FT plein scan | valeur cible de l'accumulation de 1 x 10 6; temps de remplissage maximum 1.000 ms |
| Msn | La valeur cible d'accumulation 10 x 10 4; temps de remplissage maximal de 150 ms |
| réglage d'Acquisition | Paramètres |
| Tension Electrospray | 2,4 kV |
| Gaine et le débit de gaz auxiliaire | Aucun |
| Ion transfert capillaire température | 200 ° C |
| Exclusion dynamique | jusqu'à 500 ions précurseurs pour 60 secondes sur MSMS |
| largeur de la masse d'exclusion | 10 ppm |
| Énergie de collision normalisée en utilisant le mode d'activation à large bande | 35% |
| Seuils de sélection d'ions | 100 chefs d'accusation |
| Activation q | 0,25 |
| Activtemps ation | 30 ms |
Tableau 2. Paramètres MS.
| Recherche MASCOR Deamon | Paramètres | Remarques |
| Base de données | dépend de l'organisme (par exemple pour les cellules HeLa: base de données humaine, la version 3.68; 87 061 entrées) | |
| Enzyme | Arg-C | Arg-C clivage à l'extrémité C-terminale de tous les résidus arginine |
| Modifications variables | acétyle (K), l'oxydation (M), D 3-acétylation (K), le méthyl-D 3 - acétyle (K), le diméthyl-(k), le triméthyl (K) | acétyl [42,010 Da], oxydation [15.995 Da], D3-acétylation [45,0294 Da], méthyl-D3-acétyl [somme de 14,016 Da et Da 45,0294], diméthyle [28,031], triméthyl [42,046 Da] |
| Clivages manqués | jusqu'à 2 | |
| Précision de la masse des ions parents dans la recherche | 10 ppm | |
| La précision de masse pour CID MSMS | 0,5 Da | |
| Recherche MaxQuant | Paramètres | Remarques |
| Base de données | dépend de l'organisme, | |
| Enzyme | trypsine / P | La trypsine clive à l'extrémité C-terminale de tous les résidus de lysine et d'arginine. La recherche est effectuée en prenant en compte le fait que l'efficacité de la trypsine pour cliver la lysine et l'arginine est réduite quand le prochain acide aminé est la proline (/ P). |
| Modification fixe | carbamidomethylation | |
| Modifications variables | N-acétyl (Protein), l'oxydation (M) | |
| Clivages manqués | jusqu'à 3 | |
| paramètres d'étiquetage | Lys8 et arg10 | |
| Amminoacid maximale de l'étiquette | 3 de la trypsine | |
| La précision de masse des ions parents dans la recherche initiale "Andromeda" | 20 ppm | |
| Précision de la masse des ions parents dans la principale recherche "Andromeda" | 6 ppm | |
| La précision de masse pour CID MSMS | 0,5 Da (six premiers pics per100 Da) | |
| Peptidiques taux de découverte de faux (FDR) | 0,01 | |
| Protéines taux de découverte de faux (FDR) | 0,01 | Réglage de la FDR pour le peptide et la protéine de 0,01 signifie que les deux peptides et les protéines identifiées sont censés contenir 1% de faux positifs. Cette valeur est estimée en utilisant une base de données cible leurre |
| Er postérieure maximaleror probabilité (PEP) | 1 | PEP est la probabilité qu'un peptide individuel est un match faux positif. PEP égale à 1 dans votre milieu signifie que tous les peptides seront prises indépendamment de la PEP ainsi filtrage est basé exclusivement sur FDR. |
| Longueur de peptide minimum | 6 | |
| Nombre minimum de peptides | 2 | |
| Nombre minimum de peptides uniques | 1 | |
| En utilisant seulement des peptides non modifiés et oxydation (M) / acétyle (protéine N-terme) | activer l'option | Peptides avec des modifications ne devraient généralement pas être comptés pour la quantification des protéines depuis leur abondance peut ne pas refléter le rapport de la protéine correspondante. |
| Nombre de rapport minimal | 1 | |
| "Correspondre entre les courses" | activer l'option |
Tableau 3. Analyse des données.
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Discussion
Nous avons récemment décrit ChroP, une stratégie pour la caractérisation quantitative à grande échelle des composants protéiques de la chromatine. ChroP combine deux approches complémentaires utilisés dans le domaine de l'épigénétique, la puce et MS, profitant de leurs points forts et de surmonter leurs limitations respectives. ChIP couplé à un séquençage profond (ChIP-Seq) permet la cartographie du génome de modifications des histones à la résolution de quelques nucléosomes 35. Bien avantageux pour leur sensibilité, des dosages à base d'anticorps sont limités dans leur capacité à distinguer des modifications similaires dans la dissection et l'aspect combinatoire du code des histones 36. D'autre part, alors que MS fournit une analyse complète et objective de hPTMs, seuls et dans des combinaisons 9, il a jusqu'à présent été appliquée à l'analyse de la chromatine en bloc, à l'absence conséquente d'informations sur les locus-spécifiques MPT crépite. Nous utilisons une version modifiée de la puce à isoler fonctionnellementdomaines de chromatine distinctes et la spectrométrie de masse pour caractériser les modes d'histone PTM et les protéines non spécifiquement histoniques co-enrichis.
En utilisant le N-ChroP, l'analyse de co-hPTMs associés à la H3K9me3 révélé un enrichissement significatif de marqueurs associés à la chromatine silencieuse, et un appauvrissement des modifications associées à la chromatine active. L'accord de ces résultats avec les études antérieures 37 prouvé la robustesse de la stratégie. Dans X-ChroP de domaines H3K9me3, l'enquête sur la base SILAC-des protéines de la chromatine interaction confirmé certains interacteurs décrites précédemment, validant ainsi la méthode.
ChroP présente deux principaux aspects originaux en ce qui concerne les stratégies déjà disponibles pour étudier la composante protéomique de la chromatine: par exemple, la possibilité de révéler des synergies inter-moléculaires entre les modifications de décoration histones distinctes dans le même intact mono-nucleosome purifié par N-chip; deuxième la possibilité d'évaluer le cloisonnement spécifique de variants d'histones et l'éditeur de liens sous-types d'histones. Depuis l'enquête de variants d'histones est freinée par le manque de réactifs de bonne qualité (c.-à-anticorps), ChroP émerge comme outil unique permettant d'évaluer leur situation et rôle fonctionnel.
Une limitation de ChroP dans sa forme actuelle a mis en place des mensonges dans le peptide-centric ("bottom-up") utilisée dans la SEP, avec les histones digérés en peptides courts et la dépréciation conséquente dans la détection de la connectivité à longue distance entre les modifications. En tant que tel, la conjugaison de ChroP avec "bottom-up" analyse MS permet une évaluation partielle de l'aspect combinatoire du code des histones. Nous prévoyons que la mise en œuvre de stratégies alternatives MS, tels que "Moyen et Haut-Down" pour hPTMs cartographie sur des peptides plus longs (> 20 bis) à des protéines intactes 38-40, permettra de surmontercette contrainte.
Dans l'ensemble, la N-et X-ChroP sont très complémentaires, avec la possibilité de disséquer la complexité de la structure de la chromatine à des domaines fonctionnellement distincts, avec une résolution de mono-à oligo-nucléosomes. Nous prédisons que ChroP sera également utile pour caractériser la composition des régions de chromatine marquées par la présence de protéines nucléaires non histoniques spécifiques, par exemple des facteurs de transcription (FT). En outre, ChroP peut être utilisé dans des études fonctionnelles de cartographier la composition dynamique de la chromatine à des loci spécifiques à diverses perturbations, par exemple lors de l'activation transcriptionnelle globale. Pour ces raisons, ChroP apparaît comme un outil supplémentaire utile dans l'arsenal de stratégies analytiques disponibles de disséquer le paysage protéomique de la chromatine.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été publié à l'origine dans Mol Cell Proteomics. Soldi M. et T. Bonaldi La protéomique enquête de la chromatine domaines fonctionnels Révèle nouveaux Synergismes entre Distinct hétérochromatine Composants MCP. 2013; 12: 64-80. © l'American Society for Biochemistry and Molecular Biology. Nous remercions Roberta Noberini (Institut Italien de Technologie et l'IEO, Italie) pour la lecture critique du manuscrit. travail de la tuberculose est soutenu par des subventions du-Armenise Harvard Programme Giovanni Fondation de développement de carrière, l'Association italienne pour la recherche du cancer et le ministère italien de la Santé. Travail MS a été soutenue par une bourse FIRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15% C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
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