نقدم بروتوكول لكيفية جمع ومعالجة الإلكترون البرد tomograms الميتوكوندريا كله. توفر تقنية رؤى تفصيلية في هيكل، وظيفة، وتنظيم مجمعات البروتين غشاء كبيرة في الأغشية البيولوجية الأصلية.
الإلكترون البرد المقطعي هو أداة قوية في علم الأحياء الهيكلي، قادرة على تصور هيكل ثلاثي الأبعاد للعينات البيولوجية، مثل الخلايا، العضيات، غشاء الحويصلات، أو الفيروسات في التفاصيل الجزيئية. لتحقيق ذلك، والمزججة العينة المائية بسرعة في الإيثان السائل، الذي يحافظ عليه في دولة المجمدة-رطب مقرب لمواطن. في المجهر الإلكتروني، يتم تسجيل سلسلة الميل في درجة حرارة النيتروجين السائل، والتي يتم بناؤها tomograms 3D. نسبة الإشارة إلى الضوضاء من حجم المقطعي منخفضة بطبيعتها. يتم تحسين معترف بها، وميزات المتكررة التي subtomogram المتوسط، الذي يتم قطع subvolumes الفردية خارج، وبلغ متوسط محاذاة للحد من الضوضاء. بهذه الطريقة، خرائط 3D مع قرار من 2 نانومتر أو أفضل يمكن الحصول عليها. A نوبة من الهياكل ذات الدقة العالية المتاحة للحجم 3D ثم تنتج النماذج الذرية المجمعات البروتين في بيئتها الأصلية. نحن هنا تظهر كيف نستخدم الإلكترون البرد tomograpHY دراسة في الموقع تنظيم مجمعات البروتين غشاء كبيرة في الميتوكوندريا. نجد أن يتم تنظيم synthases ATP في صفوف من dimers على طول قمم عالية مقوسة من أعراف الغشاء الداخلي، في حين مجمع I يتم توزيع عشوائيا في المناطق غشاء على جانبي الصفوف. بواسطة subtomogram المتوسط حصلنا على هيكل الميتوكوندريا ATP سينسيز ديمر داخل غشاء أعراف.
الميتوكوندريا هي السلطة منازل للخلية. عن طريق تحويل بروتون والتدرج الكهروكيميائي عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا إلى طاقة الرابطة الكيميائية، وسينسيز ATP الميتوكوندريا تنتج معظم ATP التي تحرك العمليات الخلوية. من أجل فهم الآليات وراء تحويل الطاقة الميتوكوندريا، نحن بحاجة إلى تحديد هيكل سينسيز ATP في الموقع، ومعرفة كيف يتم ترتيب ذلك وزعت في غشاء الميتوكوندريا الداخلية. على الرغم من أن الهياكل عالية الدقة لمعظم مكونات الميتوكوندريا سينسيز اعبي التنس المحترفين 1-3 والخرائط منخفضة الدقة من كله معقد 4 متاحة، فمن المهم وضع هيكل والتشكل من عمل انزيم في الغشاء. وقد افترض توزيع سينسيز ATP في غشاء الميتوكوندريا الداخلي على نطاق واسع أن يكون عشوائيا، ولكن في وقت مبكر إيجاد 5 والنتائج الأولية الخاصة بنا 6 إلي أن ذلك لا تانه حالة. وقد أكدت الدراسات اللاحقة من مجموعتنا وآخرون 7 أن يتم ترتيب سينسيز ATP في صفوف طويلة من dimers على طول التلال المنحنية بإحكام من الغشاء الداخلي الميتوكوندريا أعراف 8، في حين تظهر مضخات البروتون من سلسلة نقل الإلكترون إلى أن يكون موجودا في أي من الجانبين من الصفوف 9. هذا الترتيب له انعكاسات هامة على آليات تحويل الطاقة الميتوكوندريا.
هذه التقنية التي استخدمناها لتحديد هذا الترتيب هي الإلكترون البرد التصوير المقطعي (البرد ET). البرد ET حاليا الطريقة الوحيدة التي توفر دقة ثلاثي الأبعاد (3D) حجم الخلايا، ومقصورات الخلوية أو العضيات في قرار الجزيئي. البرد ET مناسبة خاصة لدراسة المجمعات الكبيرة في الأغشية البيولوجية، لأن الأغشية تظهر مع النقيض جيدة وسهلة لتتبع في حجم المقطعي 3D.
أساليب أخرى لدراسة هيكل 3D من الخلايا أو organellوفاق لا توفر التفاصيل الجزيئية. سوبر ضوء قرار المجهري 10، 11 هو رائع في الكشف عن موقف أو المسافات بين الباعثة للضوء تسميات تعلق على البروتينات في المصالح مع دقة عشرات نانومتر، لكنه لا يكشف هيكل البروتين نفسه، حتى في دقة منخفضة . المجهر انتقال الإلكترون من أقسام التسلسلية 12 أو التصوير كتلة وجه عن طريق مسح الإلكترون المجهري 13 من العينات البيولوجية البلاستيكية جزءا لا يتجزأ من تقدم وجهات النظر منخفضة الدقة من وحدات التخزين الخلوية ولكن أيضا لا تكشف التفاصيل الجزيئية. يمكن أن قوة المجهر الذري 14 في مبدأ تقديم قرار الجزيئي أو حتى الذري، ولكن فقط على سطح الأشياء على، دعم قوي مسطح بالذرة. أخيرا، الأشعة السينية التصوير المقطعي 15 أو تناثر مكثفة نبضات الأشعة السينية وأشعة الليزر من الإلكترون الحر 16 من غير المرجح أن تكشف عن بنية معقدة كبيرة، والأشياء، لادوري مثل الخلايا بأكملها أو العضيات في مقرار olecular في المستقبل المنظور. وهكذا في الوقت الحاضر، لا يوجد بديل لالبرد ET للدراسات لهيكل 3D من الخلايا أو العضيات في قرار نانومتر.
البرد ET هو الأسلوب المفضل لدراسة هيكل والتشكل المجالس البروتين المرتبط الغشاء بما في ذلك مجمع المسام النووية 17، وارتفاع أنفلونزا مجمعات 18، وسياط البروتينات السيارات 22، 23 ولكن أيضا تنظيم الخلايا البكتيرية كلها 19 ودخول الفيروسات المسببة للأمراض مثل فيروس نقص المناعة البشرية في الخلايا 20-23. البرد ET لا يقدر بثمن لتصور البروتينات الخيطية وتفاعلاتها في الخلية، بما في ذلك خيوط الأكتين 24 أو 25 axonemes. ويمكن تعزيز القرار إلى 2 نانومتر أو أفضل من المتوسط subtomogram 26، حيث يتم قطع subvolumes المتكرر، وميزات العادية من حجم المقطعي وبلغ متوسط بواسطة واحد الجسيمات الصورة المواليةتقنيات cessing.
البرد ET ينطوي على اكتساب سلسلة من الصور الإسقاط من عينة رقيقة (<التدوير 250Nm) التي اتخذت في زوايا الميل المختلفة في المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). يجب أن تكون العينة رقيقة بحيث الإلكترونات، التي تتفاعل بقوة مع المسألة، وتتناثر لا أكثر من مرة. نثر متعددة يجعل الصور الناتجة من الصعب تفسير ويقلل التباين. يتم محاذاة الصور للمنطقة العينة المختارة بالنسبة لبعضها البعض، ويتوقع في الفضاء 3D باستخدام برنامج كمبيوتر مناسب، وتوليد حجم 3D للعينة. وساعد محاذاة الصور عن طريق علامات إيمانية الذهب، والتي تختلط مع العينة قبل التجميد. يجب أن تكون علامات إيمانية مثالي 10 أو أكثر موزعة بالتساوي موجودة في كل صورة لتحقيق المواءمة جيدة.
لمراقبة التفاصيل الجزيئية، العينات المجمدة-يغرق في الإيثان السائل، الذي يحفظ الدولة رطب الأصلية الخاصة بهم. في تجميد السائلالإيثان هو سريع جدا (5 ~ 10 درجة مئوية / ثانية) 27 لا تتبلور الماء ولكن لا يزال في، تشبه الزجاج الدولة المزجج. الكريستال الجليد الأضرار تشكيل الهياكل البيولوجية الحساسة. كما تعاني العينات البيولوجية من أضرار الإشعاع، هناك حد لعدد الكلي للنثر الأحداث يمكن أن يتسامح مع العينة. وهكذا اكتسب الصور في وضع جرعة منخفضة: تم تحديد مساحة الفائدة عند التكبير المنخفض (1،500X) مع جرعة أقل من 1 إلكترون ه – / 2 نانومتر (طريقة البحث). ثم يتم تركيز الصورة في التكبير العالي، قبالة منطقة (وضع التركيز) الفائدة. فقط عندما يتم الحصول على صورة، والمشع مجال الاهتمام مع جرعة الإلكترون أعلى (وضع التعرض).
هنا، نقدم لمحة عامة عن كيفية جمع ومعالجة الإلكترون البرد tomograms، وذلك باستخدام ATP dimers سينسيز في الغشاء الداخلي الميتوكوندريا كمثال. يصف بروتوكول التالي كيفية تحضير الميتوكوندريا لالبرد ET، كيفية إعدادوجمع سلسلة الميل بلغ إجمالي جرعة الإلكترون محددة، وكيفية معالجة سلسلة الميل للحصول على حجم 3D من مساحة الفائدة. ويتضح لمحة عامة عن الإجراء في الشكل 1.
بروتوكول المعروضة هنا يوفر مقدمة لالبرد ET وsubtomogram المتوسط من الميتوكوندريا، ولكن يمكن تطبيق نفس الإجراء أساسا لأي حجرة أو غشاء الخلية الأخرى. للحصول على أفضل البيانات الممكنة، الخطوات الحاسمة أثناء إجراء وإعداد العينات و الاستراتيجية يغرق عملية التجميد واكتساب البيانات. جودة العينة، وهو أمر حاسم لتحقيق النجاح، ويعتمد على بروتوكول تجميد الأمثل لضمان سماكة الجليد مناسب، وهو أمر ذو أهمية قصوى لصورة جيدة التباين. الاستراتيجية المثلى للحصول على البيانات تعتمد على الصك وعينة. تشمل المعلمات ليكون الأمثل جرعة الإلكترون لكل صورة، مخطط الميل ويزيل التباؤر. الحصول على صورة مقطعية جيد لعينة جيدة يجعل تجهيز جميع المزيد من الخطوات أسهل ويضمن النتيجة النهائية مرضية.
البرد ET جنبا إلى جنب مع المتوسط subtomogram والنموذج المناسب الذري تقدم تفاصيل عن كيفية ترتيب المجمعات البروتين في الالبيئة الخلوية المحلية سعر الفائدة الفعلي. هذه التقنية هي مناسبة بالتساوي للتحقيق في هيكل مجمعات البروتين غشاء الكبيرة، مثل سلسلة supercomplexes التنفسي (1.7 MDA)، dimers سينسيز ATP (2×500 كيلو دالتون)، أو مجمع المسام النووية (~ 120 MDA) 8، 9، 17. تنظيم بطولة dimers سينسيز في الصفوف لا يمكن ملاحظتها بواسطة تقنيات عالية الدقة مثل البلورات بالأشعة السينية، NMR أو واحد الجسيمات البرد EM، لأن تتعطل الصفوف ديمر عن طريق استخراج المنظفات، وهي خطوة ضرورية في العزلة وتنقية مجمعات البروتين الغشاء.
ترتيب سينسيز ATP في صفوف من dimers على طول التلال أعراف هو مبدأ التنظيم العالمي الميتوكوندريا في جميع الأنواع. المجمعات البروتون ضخ سلسلة نقل الإلكترون، في مجمع معين الأول (NADH نازعة)، وتقع في المناطق غشاء جانبي الصفوف 8،9. هذا تنظيم السلسلة التنفسية لها تأثير عميق على الطاقة الحيوية الميتوكوندريا. إذا كانت الصفوف ديمر لا يمكن أن تشكل بسبب غياب مفارز البروتين ديمر محددة، الخلايا تظهر مرة جيل أطول وانخفاض اللياقة البدنية الخلوية، كما لوحظ في متحولة الخميرة هو مبين في الشكل (3) 41. مع الاهتمام المتزايد في أمراض الميتوكوندريا، وهي مفصلة فهم الأساس الجزيئي التركيب الدقيق الذي يحكم وظيفة الميتوكوندريا هو من أهمية قصوى. يوفر الإلكترون البرد المقطعي وجود صلة بين بنية البروتين الذي تحدده أساليب عالية الدقة، وتوزيع وترتيب هذه البروتينات في الغشاء على نطاق نانومتر. هذا يجعل البرد ET أداة أساسية لفهم بنية وظيفة الميتوكوندريا في الصحة والمرض.
وتشمل التطورات التقنية ومزيد من التحسينات في البرد ET استراتيجيات بروتين وضع العلامات لتحديد موقف من البروتيناتن مفارز في المجمعات الجزيئات أو موقع البروتينات متميزة أصغر أو أقل (<0.5 MDA) في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، أساليب المعالجة الهجين EM، التي تجمع بين subtomogram المتوسط مع تحليل جسيم واحد أو إعادة الإعمار حلزونية قد قررت مؤخرا هياكل البروتين ل~ 8 42، 43. وتقتصر هذه الأساليب المعالجة حاليا لتنقية البروتينات، التي يتم فصلها جيدا في الجليد أو تشكيل الجمعيات حلزونية وحاليا لا تنطبق على البيئات الخلوية المزدحمة مثل الميتوكوندريا وأعراف الأغشية. لجمع البيانات، ويجري تطوير الحوسبة والأجهزة أدوات جديدة لتمكين اكتساب مقطعية الآلي، وزيادة تباين الصورة وتقليل الجرعة الإجمالية المطلوبة الإلكترون. الحد الأساسي الوحيد في البرد ET هو الضرر الإشعاعي للعينة بواسطة شعاع الالكترون. هذا يعني أن الإلكترون فقط جرعات منخفضة جدا يمكن استخدامها لتسجيل كل صورة من سلسلة الميل المقطعي، مما أدى إلى ضعف إشارة رنسبة يحد في نهاية المطاف القرار تحقيقه س الضوضاء. وكشف الإلكترون المباشر الجديدة، صدر قبل أقل من عام، ويتم حاليا ثورة مجال واحد الجسيمات البرد EM 44، 45. توفر هذه كاشفات جديدة النقيض أعلى وأفضل قرار في أقل جرعة الإلكترون. للإلكترون البرد التصوير المقطعي، وهذا يعني أن سلسلة الميل مع أحجام خطوة صغيرة أو حتى tomograms محور مزدوج يمكن جمعها دون المخاوف بشأن أضرار الإشعاع المفرط (اتفاقية مكافحة التصحر صورة واحدة تعادل في جرعة الإلكترون إلى 5 الصور مباشرة كاشف الإلكترون). على كميات هائلة من البيانات التي تنتجها هذه كاشفات تخلق التحديات الخاصة في التعامل مع البيانات ومعالجتها وتخزينها، والتي سيتعين التغلب عليها.
وبالإضافة إلى ذلك، لوحات المرحلة، والتي تعمل على مبادئ مماثلة لتلك التي تستخدم بشكل روتيني في المجهر الضوئي لتعزيز المرحلة النقيض من ذلك، يجري حاليا تطويرها للانتقال المجهر الإلكتروني 46، 47. هذا يجب أن تسمح tomograms التي يتعين جمعها أقرب إلى التركيز وبالتالي على دقة أعلى، بينما في نفس الوقت الحفاظ على منخفضة الدقة الميزات الضرورية للمواءمة وتفسير أحجام تصوير الشعاعي الطبقي. أخذت معا، فإن هذه التطورات التكنولوجية بشكل كبير توسيع نطاق الأسئلة البيولوجية التي يمكن معالجتها من خلال البرد ET.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك (KMD، BD، AWM، السل، TBB، DJM، وWK)، الكتلة التميز فرانكفورت "المجمعات ضخم الجزيئات" بتمويل من جمعية الألمانية للبحوث (WK) وما بعد الدكتوراه EMBO طويل الأجل الزمالة (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |