Мы приводим протокол о том, как собирать и обрабатывать электронов крио-томограммы всей митохондрий. Методика обеспечивает детальное представление о структуре, функции и организации больших мембраны белковых комплексов в родных биологических мембран.
Электронно-крио-томографии является мощным инструментом в структурной биологии, способны визуализировать трехмерную структуру биологических образцов, таких как клеток, органелл, мембранных везикул, или вирусов на молекулярном подробно. Для достижения этой цели, водный образец быстро остеклованные в жидком этана, который сохраняет его в, замороженных гидратированных состоянии, близком к родным. В электронном микроскопе, серия тент записываются при температуре жидкого азота, из которого 3D томограммы реконструируются. Отношение сигнал-шум от объема томографического по своей природе низкой. Узнаваемый, повторяющиеся черты усиливаются subtomogram усреднения, при помощи которых отдельные subvolumes вырезаются, выровненной и усредненного для уменьшения шума. Таким образом, 3D-карты с разрешением 2 нм или выше могут быть получены. Подгонка имеющихся структур высокого разрешения в 3D-объем, то производит атомные модели белковых комплексов в их родной среде. Здесь мы показываем, как мы используем электронную крио-tomograpHY для изучения на месте организацию крупных мембраны белковых комплексов в митохондриях. Мы обнаружили, что АТФ-синтазы организованы в строки димеров вдоль изогнутых высокой вершинах внутренней мембраны крист, в то время как комплекс я случайным образом распределены в мембране областей по обе стороны от рядов. По subtomogram усреднения мы получили структуру митохондриального АТФ-синтазы димера в крист мембраны.
Митохондрии являются силовые дома клетке. Путем преобразования электрохимический протонный градиент через внутреннюю митохондриальную мембрану в энергию химических связей, митохондриальная АТФ-синтазы производит большую часть АТФ, что приводит клеточные процессы. Для того чтобы понять механизмы, лежащие преобразования митохондриального энергетического, мы должны определить структуру АТФ-синтазы на месте, и, чтобы узнать, как она устроена и распространяется в внутренней мембране митохондрий. Хотя с высоким разрешением структуры большинство митохондриальных АТФ-синтазы компонентов 1-3 и карт с низким разрешением целого комплекса 4 доступны, важно установить структуру и конформацию рабочего фермента в мембране. Распределение АТФ-синтазы в внутренней мембране митохондрий было принято считать случайными, но рано нахождения 5 и наши собственные первые результаты 6 указано, что это не тон так. Последующие исследования, проведенные в нашей группе и другие 7 подтвердили, что АТФ-синтазы устроена длинными рядами димеров вдоль плотно изогнутых хребтов внутренней митохондриальной мембраны крист 8, в то время как протонные насосы электрон-транспортной цепи, кажется, расположены по обе стороны строк 9. Это устройство имеет важные последствия для механизмов преобразования митохондриального энергии.
Методика, которую мы использовали для определения этой договоренности является электронной крио-томографии (крио-ET). Крио-ET в настоящее время является единственным методом, который обеспечивает точные трехмерные (3D) объемы клеток, клеточных отсеках или органеллы в молекулярным разрешением. Крио-ET особенно подходит для изучения больших комплексов в биологических мембранах, так как мембраны появляются с хорошим контрастом и легко проследить в объемах 3D томографических.
Другие методы для изучения 3D структуры клеток или органеллES не обеспечивают молекулярную деталь. Супер-разрешение световой микроскопии 10, 11 превосходно на выявление позиции или расстояния между светоизлучающих ярлыками к белкам интерес с точностью в десятки нм, но не раскрывает структуру самого белка, даже при низком разрешении . Просвечивающей электронной микроскопии из последовательных секций 12 или блок-лицевой изображений методом сканирующей электронной микроскопии 13 пластиковых встраиваемый биологических образцов открывается вид с низким разрешением клеточных объемов, но аналогичным образом не раскрывают молекулярную деталь. Атомно-силовая микроскопия 14 может в принципе поставить молекулярную или даже атомное разрешение, но только на поверхности объектов на атомно-плоской, твердой подложке. Наконец, рентгеновской томографии 15 или рассеяния интенсивных рентгеновских импульсов от лазеров на свободных электронах 16 вряд ли выявить структуру крупных, сложных, апериодических объектов, таких как целые клетки или органеллы в мolecular разрешение в обозримом будущем. Таким образом, в настоящее время не существует альтернативы крио-ET для изучения 3D-структуры клетки или органеллы в нанометровым разрешением.
Крио-ET является методом выбора для исследования структуры и конформации ассоциированных с мембранами белков сборок в том числе комплекса ядерной поры 17, шип гриппа образует комплекс 18, и жгутики моторных белков 22, 23, но и организация целых бактериальных клеток 19 и вступление патогенных вирусов, таких как ВИЧ и клеток 20-23. Крио-ET имеет неоценимое значение для визуализации нитевидные белки и их взаимодействия в клетке, в том числе нитей актина 24 или аксонем 25. Разрешение может быть повышена до 2 нм или лучше по subtomogram среднем 26, в результате чего subvolumes повторных, правильными чертами вырезаются из объема томографического и усредняются имидже одночастичномметоды переработкой.
Крио-ET включает в себя приобретение ряда проекционных изображений тонкой образца (<250 нм), принятым на различных углах наклона в электронном микроскопе (ПЭМ). Образец должен быть тонким, чтобы электроны, которые сильно взаимодействуют с веществом, не разбросаны не более одного раза. Многократное рассеяние делает качество полученного изображения трудно интерпретировать и уменьшает контраст. Изображения выбранной области образца были выровнены относительно друг друга и прогнозируемых в 3D-пространстве с помощью подходящего компьютерной программы, генерации 3D объем образца. Выравнивание изображений автоматизированного золотыми координатных меток, которые смешиваются с образцом до замораживания. В идеальном случае 10 или более равномерно распределены координатных меток должны присутствовать в каждом изображении, чтобы добиться хорошего согласования.
Для наблюдения молекулярную деталь, образцы окунуться заморозки в жидком этана, который сохраняет свой родной гашеной состояние. Замораживания в жидкомэтана так быстро (~ 10 5 ° С / сек) 27, что вода не кристаллизуется, но остается в стекловидной, стекло, как состояние. Ледяной кристалл повреждает формирования чувствительные биологические структуры. Как биологические образцы страдают от радиационных повреждений, есть предел, к общему числу рассеивающих событий образец может терпеть. Изображения, таким образом, приобрела в режиме низких доз: сфера интересов идентифицируется при малом увеличении (1,500X) с дозой электронов ниже 1 е – / нм 2 (режим поиска). Затем изображение фокусируется на большем увеличении, от прочих интересных (режим фокусировки). Только когда изображение приобрела, область интересов облучают более высокой дозе электронов (режиме экспозиции).
Здесь мы представляем обзор того, как сбор и обработка электронных криопроводники томограммы, используя АТФ-синтазы димеры в внутренней мембране митохондрий в качестве примера. Следующий протокол описывает, как подготовить митохондрии для крио-ЭТ, как настроитьи собрать наклона серии с определенной общей дозы электронов, и как обрабатывать серию наклона для получения 3D объем интересующей области. Обзор процедуры показан на рисунке 1.
Протокол, представленные здесь, представляет собой введение в крио-ET и subtomogram усреднение митохондрий, но по существу та же процедура может быть применена к любой другой отсек клетки или мембраны. Для получения наилучших данных, критические шаги в ходе процедуры являются пробоподготовки, стратегию приобретения окунуться процесс замораживания и данных. Качество сэмплирования, которая имеет решающее значение для успеха, зависит от оптимизированного протокола замерзания обеспечить подходящую толщину льда, который имеет первостепенное значение для хорошей контрастностью изображения. Оптимальная стратегия сбора данных зависит от инструмента и образца. Параметры, которые будут оптимизированы включают электронный дозу на изображение, схему наклона и расфокусировки. Приобретение хорошего томограмму хороший образец делает все дальнейшая обработка шаги легче и обеспечивает удовлетворительный конечный результат.
Крио-ET сочетании с subtomogram усреднения и атомной модели фитинга содержит подробную информацию о том, как белковые комплексы расположены в гоEIR родной сотовой среда. Техника в равной степени подходит для исследования структуры крупных мембраны белковых комплексов, таких как supercomplexes дыхательной цепи (1.7 MDA), АТФ-синтазы димеров (2×500 кДа), или поровый комплекс ядерной (~ 120 MDA) 8, 9, 17. Организация АТФ-синтазы димеров в ряды не могут наблюдаться с помощью методов высокого разрешения, таких как рентгеновская кристаллография, ЯМР или одночастичном крио-ЭМ, потому что димерных рядов нарушается путем экстракции моющего средства, что является необходимым шагом в изоляции и очистка мембраны белковых комплексов.
Расположение АТФ-синтазы в ряды димеров вдоль гребней крист является универсальным организация принцип митохондрий у всех видов. Протон-насосные комплексы электрон-транспортной цепи, в частности комплекса I (NADH дегидрогеназы), расположены в мембранных областях обе стороны от строк 8,9. Эта организация дыхательной цепи имеет глубокое влияние на митохондриальных биоэнергетики. Если димерных рядов не могут образовывать связи с отсутствие димерных конкретных белковых субъединиц, клетки обладают более длительного времени генерации и снижение клеточного пригодность, как это наблюдалось в дрожжевой мутанта, показанной на рисунке 3 41. С ростом интереса к митохондриальных заболеваний, подробное понимание молекулярных основ правящей ультраструктуры митохондрий и функции имеет первостепенное значение. Электрон крио-томография обеспечивает связь между структурой белка определяется методов высокого разрешения, и распределения и расположения этих белков в мембране в масштабе нанометров. Это делает крио-ЭТ является важным инструментом для понимания митохондриальной структуры и функции в норме и патологии.
Дальнейшие технические усовершенствования и улучшения, в крио-ЭТ включают в себя стратегии белок-маркировки для идентификации положения Proteiп субъединицы в макромолекулярных комплексов или расположение небольших или менее различных белков (<0,5 MDA) в клетках. Кроме того, методы обработки гибрид EM, которые сочетают subtomogram усреднение с анализа одного частиц или спиральной реконструкции недавно определяется белковые структуры в ~ 8 Å 42, 43. Эти методы обработки в настоящее время ограничивается очищенных белков, которые хорошо разделенных во льду или образуют спиральные узлы и в настоящее время не применяется в переполненных сотовых сред, как митохондрии и крист мембраны. Для сбора данных, новые вычислительные и аппаратные средства разрабатываются для автоматизированного сбора томограмма, увеличить контрастность изображения и снизить общую требуемую электронную дозу. Единственное фундаментальное ограничение в крио-ЭТ является излучение повреждение образца электронным пучком. Это означает, что только очень низкие дозы электронов может быть использован для записи каждого изображения из серии томографическое наклона, что приводит к плохой сигнал TСоотношение что в конечном итоге ограничивает достижимую разрешение о-шум. Новые прямые электронные детекторы, выпущенные менее года назад, в настоящее время революцию в поле одночастичном крио-ЭМ 44, 45. Эти новые детекторы обеспечивают более высокую контрастность и лучшее разрешение при низких электронных дозах. Для электронного крио-томографии, это означает, что наклон ряд с меньшими размерами шагом или даже двумя томограмм оси могут быть собраны без опасений по поводу чрезмерного радиационного повреждения (один ПЗС эквивалентно в электронном дозы до 5 прямых образов детектора электронов). Обширные объемы данных, полученных этими детекторами создавать свои собственные проблемы в данных обработки, переработки и хранения, которые будут иметь преодолеть.
Кроме того, фазовые пластины, которые работают на аналогичных принципах, которые используются обычно в световой микроскопии, чтобы добавлять фазового контраста, в настоящее время разрабатываются для просвечивающей электронной микроскопии 46, 47. Это должно позволить томограммы быть собраны ближе, чтобы сфокусировать и, следовательно, с более высоким разрешением, в то же время сохраняя при этом низким разрешением признаки, необходимые для выравнивания и интерпретации томографических объемов. Взятые вместе, эти технологические достижения значительно расширить спектр биологических вопросов, которые могут быть решены с помощью крио-ЭТ.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Общества Макса Планка (КМД, BD, AWM, туберкулеза, TBB, DJM, и WK), Кластер Превосходства Франкфурте "макромолекулярных комплексов», финансируемого Немецкого исследовательского (WK) и докторской ЕМВО долгосрочных Братство (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |