우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.
전자 크라이 단층 촬영 분자 세부에서 세포 소기관, 막 소포, 또는 바이러스와 같은 생물학적 샘플의 입체 구조를 시각화 할 수있는 구조 생물학에 강력한 도구이다. 이를 위해 수성 샘플은 빠르게 확대에 네이티브, 냉동 수화 상태를 유지 액체 에탄에서 유리화된다. 전자 현미경에서, 틸트 시리즈는 3D 단층 촬영이 재구성되는 액체 질소 온도에서 기록된다. 단층 볼륨의 신호 대 잡음비는 본질적으로 낮다. 인식 할 수있는, 반복 기능은 개별 서브 볼륨은 잘라 정렬 및 소음을 줄이기 위해 평균을하는 subtomogram 평균화에 의해 강화된다. 이러한 방식으로, 3D를 얻을 수 나노 미터 또는 그 이상의 해상도로 매핑한다. 3D 볼륨 이용할 고해상도 구조 착용감은 그 나라의 환경에서 단백질 복합체의 원자 모델을 생성한다. 여기에서 우리는 우리가 전자 크라이 tomograp를 사용하는 방법을 보여줍니다숨바꼭질은 미토콘드리아에서 큰 막 단백질 복합체의 현장에서 조직을 연구한다. 우리는 단지 I 임의로 행 양쪽 멤브레인 영역에 분포되어있는 반면 ATP 합성 효소는, 막 내부의 높은 cristae 곡선을 따라 정점 다이머의 행이 구성되는 것을 알. subtomogram 평균으로 우리는 cristae 막 내 미토콘드리아 ATP 합성 효소 이량 체의 구조를 획득했습니다.
미토콘드리아는 세포의 전원 주택. 화학 결합 에너지로 미토콘드리아 내막에 걸쳐 전기 양성자 구배를 변환함으로써, 미토콘드리아 ATP 합성 효소는 세포 프로세스를 구동하는 ATP의 대부분을 생산하고 있습니다. 미토콘드리아 에너지 변환 뒤에 메커니즘을 이해하기 위해, 우리는 시츄 ATP 합성 효소의 구조를 결정하고, 그 배치 및 미토콘드리아 내막에 분포되는 방법을 알 필요가있다. 전체 복합체 (4)의 미토콘드리아 ATP 합성 효소 성분 1-3 및 저해상도 맵 대부분의 고해상도 구조를 사용할 수 있지만, 막에 작용 효소의 구조와 형태를 설정하는 것이 중요하다. 미토콘드리아 내막에서 ATP 합성 효소의 분포는 광범위하게 랜덤 인 것으로 가정하지만, 6이 톤되지 않은 것으로 나타났다 (5) 및 자체의 초기 결과를 발견 한 초기그는 케이스. 전자 수송 체인의 프로톤 펌프 양쪽에 위치하도록 표시하는 동안 후속 우리 그룹에서의 연구와 다른 7 ATP 합성 효소는 미토콘드리아 내막의 cristae 8 밀접 만곡 능선을 따라 이량 체의 긴 행으로 배열되어 있음을 확인했다 행 9. 이 배열은 미토콘드리아의 에너지 전환의 메커니즘에 대한 중요한 의미를 가지고있다.
우리는이 배열을 결정하는 데 사용한 기술은 전자 크라이 단층 촬영 (크라이 동부 표준시)입니다. 곳을 알아내는-ET는 현재 분자 해상도에서 세포, 세포 구획 또는 세포 내 소기관의 정확한 3 차원 (3D) 볼륨을 제공하는 유일한 방법입니다. 막이 좋은 대조와 함께 표시 및 3D 단층 촬영 볼륨에 손쉽게 추적 할 수 있기 때문에 곳을 알아내는-ET는 생체막 큰 단지를 공부에 특히 적합하다.
다른 방법은 세포 또는 organell의 3 차원 구조를 연구하기 위해ES는 분자 세부 사항을 제공하지 않습니다. 수퍼 – 해상도 광 현미경 (10), (11)는 위치 나 내지 수십 정밀도 관심 단백질에 부착 된 발광 라벨 사이의 거리를 드러내는에서 최상의이지만, 심지어 낮은 해상도, 단백질 자체의 구조를 공개하지 않는다 . 플라스틱 내장 된 생물학적 시료의 전자 현미경 (13)를 스캔하여 시리얼 섹션 12 블록 얼굴 영상의 투과 전자 현미경은 세포 볼륨의 저해상도 뷰를 제공하지만 이와 같이 분자 세부 사항을 공개하지 않습니다. 원자력 현미경 (14)는 원칙적으로, 분자 또는 원자 분해능을 제공하지만, 유일한 원자 적으로 평평한, 고체 지지체 상에 물체의 표면에있다. 마지막으로, X-선 단층 촬영 (15) 또는 자유 전자 레이저로부터의 강한 X 선 펄스의 산란은 16 m 등의 전체 세포 또는 세포 내 소기관으로 크고 복잡한 오브젝트의 비 주기적 구조를 공개하지 않을 것이다가까운 미래에 olecular 해상도입니다. 따라서 현재 나노 미터 해상도로 세포 나 세포 소기관의 3D 구조의 연구에-ET를 알아내는 할 대안이 없다.
극저온 ET는 핵공 복합체 17 인플루엔자 스파이크 18 복합체를 포함한 막 – 관련 단백질 어셈블리의 구조 및 형태를 조사하기위한 선택의 방법 및 편모 모터 단백질 (22), (23)뿐만 아니라 전체의 균체 19의 조직이다 세포 20-23에 이러한 HIV와 같은 병원성 바이러스 및 항목. 곳을 알아내는-ET는 액틴 필라멘트 (24) 또는 axonemes (25)를 포함하여 사상 단백질과 세포의 상호 작용을 시각화 헤아릴 수 없다. 해상도는 반복, 일반 기능의 서브 볼륨이 단일 입자 이미지 프로에 의해 단층 볼륨에서 잘라 평균을함으로써 subtomogram는, 26의 평균을 2 나노 미터 또는 그 이상으로 향상 될 수있다프로세싱 기술.
극저온 ET는 투과형 전자 현미경 (TEM)에 다른 경사 각도에서 찍은 얇은 시험편 (<250 ㎚)의 투영 이미지의 시리즈의 획득을 포함한다. 물질과 강하게 상호 작용하는 전자, 한 번만 더 흩어져되지 않도록 표본은 얇은해야합니다. 다중 산란 해석 결과 이미지가 어렵와 대비를 줄일 수 있습니다. 시험편 선택된 영역의 이미지는 각각 서로에 대해 정렬 및 시험편의 3D 볼륨을 생성하는 적절한 컴퓨터 프로그램에 의해 3 차원 공간에 투영한다. 이미지의 배향은 동결에 앞서 샘플과 혼합 금 기준 마커에 의해 도움을 받는다. 이상적으로는 10 개 이상의 균일하게 분포 된 기준 마커는 좋은 정렬하기 위해 각 이미지에 존재해야한다.
분자 세부 사항을 준수하기 위해, 샘플 플 런지 냉동 그 나라의 수화 상태를 유지 액체 에탄,에 있습니다. 액체 동결에탄이 너무 빨리 (5 ~ 10 ° C / 초) 물이 결정화하지만, 유리화, 유리 같은 상태로 유지되지 않습니다 27. 얼음 결정 형성 손해에게 중요한 생물학적 구조. 생물학적 시료는 방사선 손상으로 고통 같이, 시험편 견딜 수 산란 이벤트의 총 수에 한계가있다. 이미지 따라서 저용량 모드에서 획득됩니다 관심의 영역은 한 전자 아래의 전자 량 낮은 배율 (1,500X)에서 확인됩니다 – / 나노 미터 (검색 모드). 화상이어서 관심 (포커스 모드)의 면적 떨어져 높은 배율로 집중된다. 화상이 획득되는 경우에만, 관심 영역은 높은 전자 선량 (노광 모드)로 조사된다.
여기서는 예로서 미토콘드리아 내막에서 ATP 합성 효소를 사용하여 이량 체, 수집 및 처리 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 개요를 제시한다. 다음 프로토콜은 크라이 ET에 대한 미토콘드리아를 준비하는 방법에 대해 설명합니다, 어떻게 설정하는및 특정 전체 전자 선량 방법 및 관심 영역의 3D 용적을 구하는 일련의 경사를 함께 처리하는 일련의 경사를 수집. 절차의 개요가도 1에 도시되어있다.
여기에 제시된 프로토콜은 미토콘드리아의 subtomogram 평균화 ET-크라이을 위해 소개하고 있지만, 본질적으로 동일한 절차가 다른 세포 구획 또는 막에 적용될 수있다. 최적의 데이터를 얻으려면, 절차를 수행하는 동안 중요한 단계는 샘플 준비, 플 런지 냉동 처리 및 데이터 수집 전략이다. 성공을 위해 매우 중요합니다 샘플 품질, 좋은 이미지 대비를위한 가장 중요하다 적당한 얼음 두께를 보장하기 위해 최적화 된 동결 프로토콜에 따라 달라집니다. 최적의 데이터 수집 전략은 악기와 샘플에 따라 달라집니다. 최적화 할 파라미터는 이미지 당 전자 용량, 틸트 방식과 디 포커스를 포함한다. 좋은 샘플 좋은 단층 화상을 취득하는 모든 추가 처리 단계를 용이하고 양호한 최종 결과를 보장한다.
곳을 알아내는-ET subtomogram 평균 원자 모델 피팅과 결합 단백질 복합체 번째로 배열하는 방법의 세부 사항을 제공합니다EIR 원시 세포 환경을 제공합니다. 기술은 호흡 쇄 supercomplexes (1.7 MDA), ATP 신타 다이머 (2 × 500 kDa의), 또는 핵 세공 착체 (~ 120 MDA) 8, 9, 17와 같은 큰 세포막 단백질 복합체의 구조를 조사하고 동등하게 적합하다. 이량 행이 분리에 필요한 단계 인 세제 추출에 의해 방해되기 때문 열로 ATP 신타 다이머의 조직은, 예컨대 X-선 결정학, NMR 또는 단일 입자 극저온-EM 등의 고해상도 방법에 의해 관측 될 수 없다 및 세포막 단백질 복합체의 정제.
cristae 능선을 따라 이량 체의 행 ATP 합성 효소의 배열은 모든 종에서 미토콘드리아의 보편적 인 구성 원리이다. 전자 수송 체인의 양성자 펌핑 착체, 특히 복잡 I (NADH 탈수소 효소)는, 어느 한쪽의 행 (8)의 막 부분에 위치9. 호흡 사슬의이 조직은 미토콘드리아 생물 에너지 학에 지대한 영향을 미친다. 이량 행 의한 이량 특정 단백질 서브 유닛의 부재로 형성 할 수없는 경우도 3 (41)에 도시 된 효모 돌연변이 관찰로서, 세포는 더 이상 발생 시간 및 감소 된 세포의 적합성을 나타낸다. 미토콘드리아 질환에 대한 관심과 함께, 상세한 미토콘드리아 미세 구조와 기능에 적용되는 분자 기준의 이해는 매우 중요하다. 전자 크라이 단층은 나노 미터 규모의 막 단백질의 고해상도 방법에 의해 결정 구조 및 분포와 이들 단백질의 배열 사이의 링크를 제공한다. 이것은 크라이 ET에게 건강과 질환에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 이해하는 데 필수적인 도구를 만든다.
극저온 ET에 또한 기술 개발 및 개선 PROTEI의 위치를 식별하기 위해 단백질 표지 전략을 포함거대 분자 복합체의 N 서브 유닛 또는 셀에 작은 이하 별개의 단백질의 위치 (<0.5 MDA)가 있습니다. 또한, 단일 입자 분석 또는 나선형으로 재구성 subtomogram 평균화 결합 하이브리드 EM 처리 방법은, 최근 단백질 구조를 결정한 42, 8 ~ 43이다. 이러한 처리 방법은 현재 잘 얼음에서 분리 또는 나선형 어셈블리를 형성하고 현재 미토콘드리아와 같은 붐비는 셀룰러 환경에서 적용되지 않고 세포막을 cristae 아르 정제 된 단백질 제한됩니다. 데이터 수집을 위해, 새로운 컴퓨팅 및 하드웨어 도구, 자동화 된 단층 취득을 가능하게 이미지의 명암 대비가 증가하고 총 필요한 전자 투여 량을 줄이기 위해 개발되고있다. 극저온에서 ET 만 근본적인 한계는 전자선에 의해 시료에 방사선 손상이다. 이것은 매우 낮은 전자 선량 불량 신호 t 결과 단층 틸트 각 시리즈의 이미지를 촬영하는데 사용될 수 있음을 의미오 – 노이즈 궁극적으로 달성 해상도를 제한하는 비율. 년 전보다 발표 된 새로운 직접 전자 감지기는 현재 단일 입자 냉동-EM 44, 45의 분야에 혁명을 일으키고있다. 이 새로운 검출기는 낮은 전자 투여 량 높은 콘트라스트와 더 나은 해상도를 제공합니다. 전자 크라이 단층 촬영의 경우, 이것은 과도한 방사선 손상 (하나의 CCD 이미지 5 직접적인 전자 검출기 이미지를 전자 량에 상당)에 대한 우려없이 수집 할 수있는 더 작은 스텝 크기 또는 이중 축 단층 촬영과 그 기울기 시리즈를 의미한다. 이들 검출기에 의해 생성 된 데이터의 방대한 양이 극복되어야 할 것이다 데이터 처리, 저장 및 가공에 자신의 과제를 생성한다.
또한, 상 콘트라스트를 향상시키기 위해 광학 현미경에서 일상적으로 사용되는 것과 유사한 원리에서 작동 위상 판은, 현재 투과형 전자 현미경 (46), (4)를 위해 개발되고있다7. 이것은 단층 촬영 포커스에 가까운 수거하고 따라서 더 높은 해상도로, 동시에 낮은 해상도를 유지하면서 것은 배향 단층과 볼륨의 해석에 필요한 기능을 할 수 있도록한다. 함께 찍은, 이러한 기술 발전이 크게 크라이 ET에 의해 해결 될 수있다 생물 질문의 범위를 확장됩니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 막스 플랑크 협회 (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM, 그리고 WK), 도이치 Forschungsgemeinschaft (WK)와 박사 EMBO 장기 자금 지원 우수 프랑크푸르트 "Macromolecular의 단지"의 클러스터에 의해 지원되었다 원정대 (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |