Vi presentiamo un protocollo di come raccogliere e elettrone processo di crio-tomografie di tutta mitocondri. La tecnica fornisce approfondimenti dettagliati sulla struttura, funzione, e l'organizzazione di grandi complessi proteici di membrana nelle membrane biologiche autoctone.
Electron crio-tomografia è un potente strumento per la biologia strutturale, in grado di visualizzare la struttura tridimensionale di campioni biologici, come le cellule, organelli, vescicole di membrana, o virus al dettaglio molecolare. Per raggiungere questo obiettivo, il campione acquoso viene rapidamente vetrificato in etano liquido, che conserva in uno stato congelato-idratata close-to-native. Nel microscopio elettronico, serie inclinazione sono rilevati alla temperatura dell'azoto liquido, da cui tomografie 3D sono ricostruiti. Il rapporto segnale-rumore del volume tomografica è intrinsecamente bassa. Riconoscibile, caratteristiche ricorrenti sono arricchite da subtomogram media, con la quale i singoli subvolumes sono tagliati fuori, allineati e media per ridurre il rumore. In questo modo, le mappe 3D con una risoluzione di 2 nm o migliore può essere ottenuto. Una forma di strutture ad alta risoluzione disponibili al volume 3D allora produce modelli atomici di complessi di proteine nel loro ambiente nativo. Qui mostriamo come usiamo elettrone crio-tomograpHY per studiare in situ organizzazione di grandi complessi proteici di membrana in mitocondri. Troviamo che sintasi ATP sono organizzati in file di dimeri lungo apici molto curve della membrana interna creste, mentre io complesso è distribuito in modo casuale nelle regioni di membrana su entrambi i lati delle righe. Con subtomogram media abbiamo ottenuto una struttura mitocondriale ATP sintasi dimero all'interno della membrana creste.
I mitocondri sono i power-case del cellulare. Con la conversione di un gradiente protonico elettrochimico attraverso la membrana mitocondriale interna in energia legame chimico, la ATP sintetasi mitocondriale produce la maggior parte del ATP che guida i processi cellulari. Al fine di comprendere i meccanismi che stanno dietro la conversione di energia mitocondriale, abbiamo bisogno di determinare la struttura della ATP sintasi in situ, e per scoprire come è organizzato e distribuito nella membrana mitocondriale interna. Sebbene strutture ad alta risoluzione della maggior parte dei componenti mitocondriali ATP sintasi 1-3 e cartine bassa risoluzione dell'intero complesso 4 sono disponibili, è importante stabilire la struttura e conformazione dell'enzima di lavoro nella membrana. La distribuzione della ATP sintasi nella membrana mitocondriale interna è stato ampiamente ipotizzato essere casuale, ma uno dei primi 5 e trovare i nostri risultati iniziali 6 indicato che questo non è tche caso. Studi successivi del nostro gruppo e altri 7 hanno confermato che l'ATP sintasi è organizzato in lunghe file di dimeri lungo i crinali strettamente curve della membrana mitocondriale interna creste 8, mentre le pompe protoniche della catena di trasporto degli elettroni sembrano essere situato su entrambi i lati delle file 9. Questa disposizione ha importanti implicazioni per i meccanismi di conversione energetica mitocondriale.
La tecnica che abbiamo utilizzato per determinare tale disposizione è crio-elettroni tomografia (crio-ET). Cryo-ET è attualmente l'unico metodo che fornisce accurate tridimensionale (3D) I volumi delle cellule, compartimenti cellulari o organuli a risoluzione molecolare. Cryo-ET è particolarmente adatto per studiare i grandi complessi di membrane biologiche, perché le membrane appaiono con un buon contrasto e sono facili da tracciare in volumi tomografiche 3D.
Altri metodi per studiare la struttura 3D delle cellule o organelles non forniscono dettagli molecolare. Super-risoluzione microscopia ottica 10, 11 è eccellente a rivelare la posizione o distanze tra etichette luminescenti collegati a proteine di interesse con una precisione di decine di nm, ma non rivela la struttura della proteina stessa, anche a bassa risoluzione . Microscopia elettronica a trasmissione di sezioni seriali di 12 o di imaging block-face da microscopia elettronica a scansione 13 di campioni biologici di plastica-embedded offrono viste a bassa risoluzione di volumi cellulari, ma allo stesso modo non rivelano dettaglio molecolare. Microscopia a forza atomica 14 può in linea di principio di fornire risoluzione molecolare o atomica, ma solo alla superficie degli oggetti su un atomicamente piatta sostegno, solido. Infine, tomografia a raggi X 15 o dispersione di impulsi di raggi X intensi da laser ad elettroni liberi 16 è improbabile per rivelare la struttura di grandi e complessi, oggetti aperiodici come le cellule intere o organelli a mRisoluzione olecular nel prossimo futuro. Quindi allo stato attuale, non vi è alcuna alternativa al crio-ET per studi sulla struttura 3D di cellule o organuli a risoluzione nanometrica.
Cryo-ET è il metodo di scelta per l'esame della struttura e la conformazione dei gruppi di proteine associate alla membrana, tra cui il complesso del poro nucleare 17, il picco dell'influenza complessi 18, e flagelli proteine motrici 22, 23 ma anche l'organizzazione di intere cellule batteriche 19 e l'entrata di virus patogeni come l'HIV nelle cellule 20-23. Cryo-ET ha un valore inestimabile per la visualizzazione di proteine filamentose e le loro interazioni nella cellula, compresi i filamenti di actina 24 o axonemes 25. La risoluzione può essere migliorata a 2 nm o meglio subtomogram media di 26, in base al quale subvolumes di ripetute, lineamenti regolari sono tagliati fuori da un volume tomografica e media per singola particella Image Protecniche di lavorazione.
Cryo-ET comporta l'acquisizione di una serie di immagini di proiezione di un esemplare sottile (<250nm) prese a diversi angoli di inclinazione in un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Il campione deve essere sottile in modo che gli elettroni, che interagiscono fortemente con la materia, sono sparsi in non più di una volta. Scattering multiplo rende le immagini risultanti difficili da interpretare e riduce il contrasto. Immagini dell'area campione selezionato sono allineati l'uno rispetto all'altro e proiettati in uno spazio 3D da un programma per computer adatto, generando un volume 3D del campione. L'allineamento delle immagini è aiutata da marker fiduciali oro, che si mescolano con il campione prima del congelamento. Marker fiduciali Idealmente 10 o più equamente distribuiti dovrebbero essere presenti in ogni immagine per ottenere un buon allineamento.
Per osservare dettaglio molecolare, i campioni sono tuffo congelati in etano liquido, che conserva il loro stato idratato nativo. Congelamento di liquidoetano è così veloce (~ 10 5 ° C / sec) 27 che l'acqua non cristallizza, ma rimane in uno stato simile al vetro vetrificato. Cristalli di ghiaccio danneggia formazione strutture biologiche sensibili. Come campioni biologici soffrono di danni da radiazioni, c'è un limite al numero totale di eventi di scattering il campione può tollerare. Le immagini vengono quindi acquisiti in modalità a basso dosaggio: Una zona di interesse è identificata a basso ingrandimento (1,500X) con una dose inferiore a 1 elettrone e – / nm 2 (modalità di ricerca). L'immagine viene poi messo a fuoco con un ingrandimento maggiore, l'area di interesse (modalità di messa a fuoco). Solo quando l'immagine viene acquisita, l'area di interesse viene irradiata con una dose elevata di elettroni (modo di esposizione).
Qui, vi presentiamo una panoramica di come raccogliere e di elettroni processo di crio-tomografie, utilizzando ATP sintasi dimeri nella membrana mitocondriale interna come un esempio. Il seguente protocollo descrive come preparare i mitocondri per crio-ET, come impostaree raccogliere una serie di inclinazione con una dose specifica di elettroni totale, e come elaborare la serie di inclinazione per ottenere un volume 3D della zona di interesse. Una panoramica della procedura è illustrata nella figura 1.
Il protocollo qui presentato fornisce un'introduzione alla crio-ET e subtomogram media dei mitocondri, ma essenzialmente la stessa procedura può essere applicata a qualsiasi altro compartimento cellulare o membrana. Per ottenere i migliori dati possibili, fasi critiche nel corso della procedura sono la preparazione del campione, la strategia di acquisizione processo di congelamento tuffo e dati. Qualità del campione, che è fondamentale per il successo, dipende da un protocollo di congelamento ottimizzato per garantire lo spessore del ghiaccio adatto, che è di fondamentale importanza per il buon contrasto dell'immagine. La strategia ottimale di acquisizione dati dipende dallo strumento ed il campione. Parametri da ottimizzare includono dose di elettroni per immagine, sistema di inclinazione e sfocatura. Acquisire una buona tomogramma di un buon campione rende ogni ulteriore trasformazione passaggi più facili e garantisce un risultato finale soddisfacente.
Cryo-ET combinato con subtomogram media e montaggio di modello atomico fornisce dettagli su come complessi proteici sono disposti in thambiente cellulare nativo EIR. La tecnica è ideale per indagare la struttura di grandi complessi proteici di membrana, come supercomplessi catena respiratoria (1.7 MDA), dimeri ATP sintasi (2×500 kDa), o il complesso del poro nucleare (~ 120 MDA) 8, 9, 17. L'organizzazione di ATP dimeri sintasi in righe non può essere osservato con tecniche ad alta risoluzione come la cristallografia a raggi X, NMR o singola particella crio-EM, perché le righe dimero sono interrotti per estrazione detergente, che è un passo necessario per l'isolamento e purificazione di complessi proteici di membrana.
La disposizione della ATP sintasi in file di dimeri lungo crinali creste è un principio organizzativo universale dei mitocondri in tutte le specie. I complessi protone-pompaggio della catena di trasporto degli elettroni, in particolare complesso I (NADH deidrogenasi), sono situati nelle zone di membrana lati delle righe 8,9. Questa organizzazione della catena respiratoria ha un impatto profondo sulla bioenergetica mitocondriale. Se le righe dimero non possono formare a causa dell'assenza di subunità proteiche specifica-dimero, le cellule presentano tempi di generazione più lunghi e ridotta idoneità cellulare, come osservato nel mutante di lievito mostrato in Figura 3 41. Con il crescente interesse per le malattie mitocondriali, una dettagliata comprensione delle basi molecolari che governano ultrastruttura e funzione mitocondriale è di fondamentale importanza. Electron crio-tomografia fornisce un collegamento tra struttura proteica determinata mediante metodi ad alta risoluzione, e la distribuzione e la disposizione di queste proteine nella membrana sulla scala dei nanometri. Questo rende crio-ET uno strumento essenziale per comprendere la struttura e la funzione mitocondriale in salute e malattia.
Ulteriori sviluppi tecnici e miglioramenti in crio-ET includono strategie di proteina-etichettatura per identificare la posizione di Protein subunità in complessi macromolecolari o la posizione delle proteine distinte più piccole o meno (<0,5 MDA) nelle cellule. Inoltre, i metodi di lavorazione EM ibridi, che combinano subtomogram media con l'analisi singola particella o ricostruzione elicoidale hanno recentemente determinato strutture proteiche a ~ 8 A 42, 43. Questi metodi di lavorazione sono attualmente limitati alle proteine purificate, che sono ben separati in ghiaccio o si formano gruppi elicoidali e non sono attualmente applicabili agli ambienti cellulari affollati come i mitocondri e le membrane creste. Per la raccolta dei dati, nuovi strumenti informatici e hardware sono in fase di sviluppo per l'acquisizione tomogram automatizzato, aumentare il contrasto dell'immagine e ridurre la dose totale richiesta di elettroni. L'unica limitazione fondamentale in crio-ET è danni da radiazioni al campione dal fascio di elettroni. Ciò significa che solo dosi molto basse di elettroni possono essere usati per registrare ogni immagine di una serie tomografica inclinazione, con conseguente scarsa segnale-trapporto che in ultima analisi, limita la risoluzione ottenibile o-rumore. I nuovi rivelatori di elettroni diretto, uscito meno di un anno fa, stanno rivoluzionando il campo di singolo-particella crio-EM 44, 45. Questi nuovi rivelatori forniscono un maggiore contrasto e una migliore risoluzione a dosi più basse di elettroni. Per elettrone crio-tomografia, questo significa che serie tilt con dimensioni di passo più piccole o addirittura tomogrammi biassiali possono essere raccolti senza preoccupazioni per i danni da radiazioni eccessive (una sola immagine CCD è equivalente a dosaggio elettronico a 5 immagini dirette rivelatore di elettroni). Le grandi quantità di dati prodotti da questi rilevatori di creare le proprie sfide nella gestione dei dati, trasformazione e stoccaggio, che dovranno essere superate.
Inoltre, le piastre di fase, che lavorano su principi simili a quelli utilizzati di routine in microscopia ottica per aumentare il contrasto di fase, sono attualmente in fase di sviluppo per la microscopia elettronica a trasmissione 46, 47. Ciò dovrebbe permettere tomogrammi da rilevare più vicino al fuoco e quindi a maggiore risoluzione, mentre allo stesso tempo conservando bassa risoluzione caratteristiche necessarie per l'allineamento e l'interpretazione dei volumi tomografiche. Presi insieme, questi progressi tecnologici espandere notevolmente la gamma di questioni biologiche che possono essere affrontati con crio-ET.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society (KMD, BD, AWM, la tubercolosi, TBB, DJM, e WK), il Cluster di Eccellenza Francoforte "complessi macromolecolari", finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) e un post-dottorato EMBO a lungo termine Fellowship (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |