Wir präsentieren ein Protokoll, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen von ganzen Mitochondrien. Die Technik liefert detaillierte Einblicke in die Struktur, Funktion und Organisation der großen Membranproteinkomplexen in nativen biologischen Membranen.
Elektronen Kryo-Tomographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, Strukturbiologie, der fähig ist die Visualisierung der dreidimensionalen Struktur von biologischen Proben, wie Zellen, Zellorganellen, Membranvesikel oder Viren molekularen Detail. Um dies zu erreichen, wird die wässrige Probe schnell in flüssigem Ethan, die es in einem nahe-zu-native, tiefgefrorenen Zustand bewahrt verglast. Im Elektronenmikroskop sind Kippserie bei Temperatur von flüssigem Stickstoff, aus dem 3D rekonstruierten Schichtbilder aufgezeichnet. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis des tomographischen Volumen inhärent niedrig. Erkennbar, wiederkehrende Funktionen werden von subtomogram Mittelung, von denen einzelne Teilvolumina werden ausgeschnitten, ausgerichtet und gemittelt, um Lärm zu reduzieren verbessert. Auf diese Weise Maps 3D mit einer Auflösung von 2 nm oder besser erhalten werden kann. Eine Anpassung der verfügbaren hochaufgelösten Strukturen auf die 3D-Volumen erzeugt dann Atommodelle von Proteinkomplexen in ihrer natürlichen Umgebung. Hier zeigen wir, wie wir mit Kryo-Elektronen tomography, um die in-situ-Organisation von großen Membran-Protein-Komplexe in den Mitochondrien zu untersuchen. Wir finden, dass die ATP-Synthase sind in Reihen entlang von Dimeren stark gekrümmten Scheitel der inneren Membran Cristae organisiert, während komplexe I zufällig in den Membranregionen auf beiden Seiten der Reihen verteilt. Durch Mittelung subtomogram eine Struktur der mitochondrialen ATP-Synthase-Dimeres erhalten wir innerhalb der Cristae-Membran.
Mitochondrien sind die Kraft-Häuser der Zelle. Durch Umwandeln eines elektrochemischen Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran in chemische Bindungsenergie erzeugt der mitochondrialen ATP-Synthase meisten der ATP, die zellulären Prozesse steuert. Um die Mechanismen der mitochondrialen Energieumwandlung zu verstehen, müssen wir die Struktur des ATP-Synthase in situ zu bestimmen, und um herauszufinden, wie es angeordnet ist und in der inneren mitochondrialen Membran verteilt. Obwohl hochaufgelösten Strukturen der meisten mitochondrialen ATP-Synthase-Komponenten 1-3 und niedriger Auflösung die Karten der ganzen Komplex 4 zur Verfügung stehen, ist es wichtig, die Struktur und die Konformation des Arbeits Enzym in der Membran zu etablieren. Die Verteilung der ATP-Synthase in der inneren mitochondrialen Membran wurde weithin angenommen, zufällig zu sein, aber ein frühes Auffinden 5 und eigenen ersten Ergebnisse 6 angegeben, dass dies nicht ter Fall ist. Nachfolgende Studien von unserer Gruppe und andere 7 bestätigt, dass die ATP-Synthase wird in langen Reihen von Dimeren entlang der eng gekrümmten Rippen der inneren Mitochondrienmembran Cristae 8 angeordnet, während die Protonenpumpen der Elektronentransportkette erscheinen auf beiden Seiten angeordnet sein der Reihen 9. Diese Anordnung hat wichtige Implikationen für die Mechanismen der mitochondrialen Energieumwandlung.
Die Technik, die wir verwendet haben, um diese Anordnung zu bestimmen, ist Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET). Kryo-ET ist derzeit die einzige Möglichkeit, die genaue dreidimensionale (3D) Volumen der Zellen, Zellkompartimente und Organellen führt bei Molekularauflösung. Kryo-ET ist besonders geeignet für die Untersuchung großer Komplexe in biologischen Membranen, weil die Membranen scheinen mit gutem Kontrast und sind leicht in 3D-Tomographievolumen verfolgen.
Andere Methoden die 3D-Struktur von Zellen oder Organelle, um zu studierenes bieten keine molekularen Detail. Super-Resolution Lichtmikroskopie 10, 11 ist hervorragend bei der Entdeckung der Position oder Abstände zwischen Leucht Etiketten auf Proteine von Interesse mit einer Genauigkeit von zehn nm angebracht, aber es zeigt nicht die Struktur des Proteins selbst, auch bei niedriger Auflösung . Transmissionselektronenmikroskopie von Serienschnitten 12 oder Block-face-Bildgebung mittels Rasterelektronenmikroskopie 13 aus Kunststoff eingebetteten biologischen Proben mit niedriger Auflösung bieten Aussicht auf Zellvolumen, aber ebenfalls nicht verraten molekularen Detail. Rasterkraftmikroskopie 14 kann im Prinzip liefern molekularen oder sogar atomare Auflösung, aber nur an der Oberfläche der Objekte auf einem atomar glatten, festen Träger. Schließlich ist 16 unwahrscheinlich, dass die Struktur von großen, komplexen aperiodischen Objekte wie ganze Zellen oder Zellorganellen in m zeigen Röntgentomographie 15 oder Streuung von intensiven Röntgenpulse von Freie-Elektronen-LaserMOLEKULARE Auflösung in absehbarer Zeit. So werden derzeit gibt es keine Alternative zu Cryo-ET für Studien der 3D-Struktur von Zellen oder Zellorganellen auf der Nanometerauflösung.
Kryo-ET ist die Methode der Wahl zur Untersuchung der Struktur und Konformation von Membran-assoziierten Protein Anordnungen des Kernporenkomplexes 17, die Influenza Spike-Komplexe 18 und die Flagellen Motorproteine 22, 23, sondern auch die Organisation des gesamten Bakterienzellen 19 und Eingabe von pathogenen Viren, wie HIV in den Zellen 20-23. Kryo-ET ist von unschätzbarem Wert für die Visualisierung filamentöse Proteine und deren Interaktionen in der Zelle, einschließlich der Aktinfilamente 24 oder 25 axonemes. Die Auflösung kann bis 2 nm oder besser durch subtomogram durchschnittlich 26, wobei Teilvolumina der wiederholten, regelmäßigen Zügen sind aus einem tomographischen Volumen von Single-Particle Image Pro Cut und gemittelt verbessert werdenVerarbeitung Techniken.
Kryo-ET ist der Erwerb einer Reihe von Projektionsbildern eines dünnen Probe (<250 nm) bei verschiedenen Neigungswinkeln in einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) aufgenommen. Die Probe muss dünn sein, so daß Elektronen, die stark mit Materie wechselwirken, sind nicht mehr als einmal gestreut. Mehrfachstreuung macht die resultierenden Bilder schwer zu interpretieren und verringert den Kontrast. Bilder der ausgewählten Probenbereich relativ zueinander aufeinander ausgerichtet und projiziert in einen 3D-Raum durch ein geeignetes Computerprogramm, Erzeugen eines 3D-Volumens der Probe. Die Ausrichtung der Bilder wird durch Goldbezugsmarkierungen, die mit der Probe vor dem Einfrieren gemischt werden unterstützt. Idealerweise 10 oder mehr gleichmäßig verteilt Bezugsmarkierungen sollte in jedem Bild, eine gute Ausrichtung zu erreichen.
Um molekulare Detail zu beobachten, sind Proben Sprung gefroren in flüssigem Ethan, die ihre Mutter hydrierten Zustand bewahrt. Einfrieren in flüssigemEthan ist so schnell (~ 10 5 ° C / s) 27, die Wasser nicht kristallisiert, sondern bleibt in einer verglasten, glasartigen Zustand. Bildung von Eiskristallen Schäden empfindlichen biologischen Strukturen. Da biologische Proben leiden Strahlenschäden, gibt es eine Grenze für die Gesamtanzahl von Streuereignissen kann die Probe zu tolerieren. Bilder werden somit in Niedrigdosis-Modus erworben: Ein Bereich von Interesse ist bei geringer Vergrößerung (1,500X) mit einer Elektronendosis unter 1 e identifiziert – / nm 2 (Suchmodus). Das Bild wird dann bei einer höheren Vergrößerung fokussiert, aus dem Bereich von Interesse (Fokusmodus). Nur wenn ein Bild aufgenommen wird, wird der Bereich von Interesse mit einer höheren Elektronendosis (Belichtungsmodus) bestrahlt.
Hier präsentieren wir einen Überblick, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen mit ATP-Synthase-Dimere in der inneren Mitochondrienmembran als Beispiel. Das folgende Protokoll beschreibt, wie Mitochondrien für Kryo-ET vorbereiten, wie Sieund Sammeln eines Neigungs Reihe mit einer bestimmten Gesamt-Elektronendosis, und wie die Neigung Reihe mit einem 3D-Volumen des Bereichs von Interesse zu erhalten, zu verarbeiten. Ein Überblick über das Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.
Die hier vorgestellten Protokoll bietet eine Einführung in Cryo-ET und subtomogram Lung von Mitochondrien, aber im Wesentlichen die gleiche Vorgehensweise kann zu jeder anderen Zellkompartiment oder einer Membran aufgetragen werden. Um die bestmöglichen Daten zu erhalten, kritische Schritte während des Verfahrens sind die Probenvorbereitung, die Tauchgefrierprozess und Datenakquisitionsstrategie. Probenqualität, die für den Erfolg entscheidend ist, hängt von einer optimierten Gefrierprotokoll an geeignete Eisdicke, die aus guten Bildkontrast größter Bedeutung ist zu gewährleisten. Die optimale Datenakquisitionsstrategie hängt von dem Instrument und der Probe. Parameter, die optimiert werden können, umfassen Elektronendosis pro Bild, Neigung und Unschärfe-Schema. Erwerb eine gute Schnittbild eines guten Proben macht alle weiteren Verarbeitungsschritte einfacher und sorgt für ein zufriedenstellendes Endergebnis.
Cryo-ET mit subtomogram Mittelung und Atommodell passend kombiniert bietet Details, wie Protein-Komplexe sind in th angeordnetEIR nativen Zellumgebung. Die Technik ist gleichermaßen geeignet für die Untersuchung der Struktur von großen Membranproteinkomplexen, wie Atmungskette-Super (1,7 MDa), ATP-Synthase-Dimere (2×500 kDa), bzw. des Kernporenkomplexes (~ 120 MDA) 8, 9, 17. Die Organisation der ATP-Synthase-Dimere in Zeilen kann nicht durch hochauflösende Techniken wie Röntgenkristallographie, NMR oder Einzelpartikel-Kryo-EM beobachtet werden, da die Dimer-Reihen durch Detergens-Extraktion, die ein notwendiger Schritt bei der Isolierung gestört und Reinigung der Membranproteinkomplexen.
Die Anordnung der ATP-Synthase, die in Reihen von Dimeren entlang Cristae Rippen ist ein universelles Organisationsprinzip der Mitochondrien in allen Arten. Die Protonen-Pumpen-Komplexe der Elektronentransportkette, insbesondere Komplex I (NADH-Dehydrogenase), sind in den Membranflächen zu beiden Seiten der Reihen 8 angeordnet,9. Diese Organisation der Atmungskette hat tiefgreifende Auswirkungen auf die mitochondriale Bioenergetik. Wenn die Dimer-Reihen nicht auf das Fehlen von Dimer-spezifische Protein-Untereinheiten bilden, die Zellen aufweisen Generationszeiten länger und reduzierten zellulären Fitness, wie in der in Figur 3 41 gezeigt Hefe-Mutante beobachtet. Mit dem wachsenden Interesse an mitochondrialer Erkrankungen, eine detaillierte Verständnis der molekularen Grundlagen über mitochondrialen Ultrastruktur und Funktion ist von größter Bedeutung. Elektronen Kryo-Tomographie eine Verbindung zwischen Proteinstruktur durch hochauflösende Methoden bestimmt, und die Verteilung und Anordnung dieser Proteine in der Membran in der Größenordnung von Nanometern. Dies macht Kryo-ET ein wesentliches Instrument für das Verständnis der mitochondrialen Struktur und Funktion in Gesundheit und Krankheit.
Weitere technische Entwicklungen und Verbesserungen in der Kryo-ET sind Protein-Markierungsstrategien, um die Position zu ermitteln protein Untereinheiten in makromolekulare Komplexe oder die Lage der kleinere oder weniger ausgeprägten Proteine (<0,5 MDa) in Zellen. Darüber hinaus haben Hybrid-EM Verarbeitungsmethoden, die subtomogram Mittelung mit Einzelpartikelanalyse oder Wendel Rekonstruktion kombinieren kürzlich bestimmt Proteinstrukturen zu ~ 8 Å 42, 43. Diese Verarbeitungsverfahren sind derzeit auf gereinigte Proteine, die gut in Eis getrennt sind oder bilden spiralförmigen Baugruppen und sind derzeit nicht für überfüllten zellulären Umgebungen wie Mitochondrien und Cristae Membranen beschränkt. Für die Datenerhebung werden neue Computer-und Hardware-Tools entwickelt, um die automatische Schnittbild Erwerb zu ermöglichen, erhöhen den Bildkontrast und reduzieren insgesamt benötigte Elektronendosis. Die einzige grundlegende Einschränkung in Kryo-ET Strahlung Schädigung der Probe durch den Elektronenstrahl. Dies bedeutet, dass nur sehr geringe Elektronendosen verwendet werden, um jedes Bild einer tomographischen Kippserie aufzuzeichnen, was zu einem schlechten Signal-t werdeno-Rausch-Verhältnis, die letztlich begrenzt die erreichbare Auflösung. Die neue direkte Elektronendetektoren, veröffentlicht weniger als vor einem Jahr, revolutionieren derzeit den Bereich des Einzelpartikel-Kryo-EM 44, 45. Diese neuen Detektoren höheren Kontrast und eine bessere Auflösung bei niedrigeren Elektronendosen. Für Kryo-Elektronentomographie bedeutet dies, dass Kippserie mit kleineren Schrittweiten oder auch Doppelachsenschnittbilder ohne übermäßig hohe Strahlenschäden (ein CCD-Bild entspricht in Elektronendosis bis 5 direkten Elektronendetektor Bilder) gesammelt werden. Die riesigen Datenmengen, die von diesen Detektoren erzeugten ihre eigenen Herausforderungen im Umgang mit Daten, Verarbeitung und Lagerung, die es zu überwinden werden.
Außerdem Phasenplatten, die auf ähnlichen Prinzipien wie die routinemäßig in der Lichtmikroskopie verwendet zu arbeiten, um Phasenkontrast zu erhöhen, werden derzeit für die Transmissionselektronenmikroskopie 46, 4 entwickelt7. Damit sollte Schichtaufnahmen näher gesammelt, um zu fokussieren und damit mit einer höheren Auflösung, während zur gleichen Zeit die Erhaltung niedriger Auflösung bietet für die Ausrichtung und Interpretation der tomographischen Mengen notwendig. Zusammengenommen werden diese technologischen Fortschritte stark erweitern die Palette der biologischen Fragen, die durch Kryo-ET angesprochen werden können.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM und WK), des Exzellenzclusters Frankfurt "Makromolekulare Komplexe" von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (WK) und einem Postdoc-EMBO Long-Term finanziert unterstützt Fellowship (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |