我们提出了如何收集和处理电子低温断层整个线粒体的协议。该技术提供了详细分析上市的结构,功能和组织的大的膜蛋白复合物中天然生物膜。
电子冷冻断层扫描是在结构生物学的有力工具,能够可视化的生物样品,如细胞,细胞器,膜小泡或病毒在分子细节的三维结构。为了实现这一点,所述水性样品迅速玻璃化在液体乙烷,它保留它在近距离到本地的,冷冻的水合状态。在电子显微镜下,倾斜系列被记录在液氮温度下,从该三维断层图像进行重建。断层容积的信号 – 噪声比是固有地低。辨认,经常性的功能是由subtomogram平均,其中个别子卷切出,对准,平均降低噪音提高。以这种方式,三维映射为2纳米或更能够得到解决。一件合身可用的高分辨率结构的三维体积,然后产生蛋白质复合物的原子模型在他们的天然环境。在这里,我们将展示我们如何使用电子低温tomograpHY研究现场组织大型的膜蛋白复合物在线粒体中。我们发现,ATP合成酶的组织中的行沿内膜嵴高度弯曲的顶点的二聚体,而复合物I中随机地分布在膜的区域上的行的任一侧。通过subtomogram平均我们得到的嵴膜中的线粒体ATP合酶的二聚体的结构。
线粒体是电房小区。通过将电化学质子梯度跨线粒体膜成化学键的能量,线粒体ATP合酶产生最驱动的细胞过程中的ATP。为了理解后面线粒体能量转换机制,我们需要确定在原位 ATP合酶的结构,并发现它是如何布置和分布在线粒体内膜。虽然可用的大多数的整个复杂4线粒体ATP合成酶组分1-3和低分辨率图的高分辨率结构,它建立在工作酶的结构和构象中的膜是很重要的。的ATP合成酶的线粒体内膜的分布已被广泛地认为是随机的,但早期发现5和我们自己的初步结果6所示,这是不吨他的情况下。从我们的基团随后的研究和其他7已经证实,ATP合酶被布置在长行沿线粒体内膜嵴8的紧密弯曲的脊部的二聚体,而电子传递链的质子泵可能在位于两侧的行9。这种结构具有用于线粒体能量转换机制具有重要意义。
我们已经使用,以确定该布置的技术是电子冷冻断层摄影(冷冻ET)。冷冻ET是目前,在分子的分辨率提供了细胞,细胞区室或细胞器中的精确的三维(3D)的卷的唯一方法。冷冻ET特别适合用于研究的大复合体中的生物薄膜,因为该膜出现了具有良好对比度和很容易就可以跟踪在3D断层扫描体积。
其他的方法来研究细胞或细胞器的三维结构ES不提供分子细节。超分辨率光镜10,11是极好的露出位置或附接至具有几十nm的精度兴趣蛋白质的发光标签之间的距离,但它并没有揭示该蛋白本身的结构,即使在低的分辨率。连续切片12或块面的成像扫描塑料包埋的生物样品的电镜13透射电子显微镜提供蜂窝体积的低分辨率的意见,但同样没有揭示分子细节。原子力显微镜14在原理上可以实现分子甚至原子级的分辨率,但是仅在物体上的原子级平坦,固体支持物的表面上。最后,X射线断层摄影术15或强烈的X射线脉冲从自由电子激光散射16不太可能揭示大的,复杂的,非周期的对象的结构,例如在米全细胞或细胞器olecular分辨率在可预见的未来。因此,在目前,有没有替代冷冻ET的细胞或细胞器的三维结构的纳米级分辨率的研究。
冷冻ET是选择的方法用于检查的膜结合蛋白组合件包括核孔复合体17中,流感尖峰配合物18的结构和构象,和鞭毛马达蛋白22,23,而且整个细菌细胞19的机构和进入致病病毒如艾滋病病毒在细胞20-23。冷冻ET是无价的可视化丝状蛋白及其在细胞间的相互作用,包括肌动蛋白丝24或轴突25。分辨率可以通过subtomogram平均26,由此反复,常规功能子卷是由单粒子图像的亲切出一个断层量,平均提高到2纳米或更高cessing技术。
冷冻ET涉及收购了一系列的薄样品(<250纳米),在不同的倾斜角度在透射电子显微镜(TEM)拍摄的投影图像。试样必须是薄的,这样的电子,这与物质的强烈的相互作用,分散不超过一次。多次散射,使所得到的图像难以解释,并降低对比度。所选择的样本区域的图像的对齐相对于每个其它与投影到3D空间中通过合适的计算机程序,产生的样品的三维体积。的图像的排列是由金的基准标记,它与冷冻前的样品混合资助。理想的情况是10或更均匀分布的基准标记应该是存在于每一个图像,以实现良好的取向。
观察分子的细节,样品急跌冷冻在液态乙烷,它保留了其天然的水合状态。冷冻在液态乙烷是如此之快(〜10 5℃/秒)27使得水不会结晶而是保持在玻璃化,玻璃样状态。冰晶形成的损害敏感的生物结构。作为生物样品从辐射损伤患,是有一定限度的散射事件的标本可以容忍的总数。图像中的低剂量模式这样获取:感兴趣的区域被确定为低倍率(1500倍),用以下1 C的电子剂量– /纳米2(搜索模式)。该图像,然后集中在一个更高的放大倍率,关利益(对焦模式)的区域。被获取的图像,只有当中,感兴趣的区域上照射具有更高的电子剂量(曝光模式)。
这里,我们提出了如何收集和处理电子冷冻断层图像,利用ATP合酶的二聚体在线粒体内膜,例如一个概观。以下方案描述了如何制备线粒体为低温的ET,如何设置并收集与一个特定的电子总剂量,以及如何处理该倾斜系列以获得感兴趣区域的三维体积的倾斜系列。该过程的概述示于图1。
这里介绍的协议进行了介绍冷冻ET和线粒体subtomogram平均,但基本上相同的方法可应用于任何其他细胞区室或膜。为了获得最佳的数据,在手术过程中的关键步骤是样品制备,暴跌冻结过程和数据采集策略。样品的质量,这是至关重要的成功,取决于一个优化的冻结协议,以确保合适的冰的厚度,这对于良好的图像对比度非常重要的。最佳的数据采集策略取决于仪器和样品。要优化的参数包括每幅图像的电子剂量,倾斜机制和散焦。取得了良好的样本的良好断层扫描使所有进一步的处理步骤更容易,并确保一个满意的最终结果。
冷冻的ET结合subtomogram平均和原子模型拟合提供了如何蛋白质复合物被布置在第细节EIR天然细胞环境。该技术同样适合用于研究的大的膜蛋白复合物,诸如呼吸链supercomplexes(1.7 MDA),ATP合酶的二聚体(2×500 kDa的),或核孔复合物(〜120 MDA)8,9,17的结构。的ATP合酶的二聚体的组织进行不能由如X射线晶体学,核磁共振或单粒子冷冻电镜高分辨率技术可以观察到,因为该二聚体行由洗涤剂提取,这是在隔离的必要步骤打乱和的膜蛋白复合物的纯化。
在沿行嵴隆起二聚体的ATP合成酶的安排,是所有物种的线粒体的普遍组织原则。电子传递链的质子泵配合物,特别是复合物I(NADH脱氢酶),分别位于所述膜的区域中的行8的任一侧9,该组织在呼吸链中的具有线粒体生物能量产生深远的影响。如果该二聚体行不能由于缺乏二聚体特异性蛋白亚基组成,该细胞表现出更长的生成时间和减少细胞的健身,如在图3中41所示的酵母突变体观察到,随着在线粒体疾病的越来越大的兴趣,有详细治线粒体超微结构和功能的分子基础的认识是非常重要的。电子冷冻断层提供在所述膜的纳米尺度由高分辨率的方法测定蛋白质的结构和分布与这些蛋白质的结构之间的联系。这使得冷冻ET在健康和疾病的理解线粒体结构和功能的基本工具。
在低温ET技术上的进一步发展和改进包括蛋白质标记策略,以确定protei的位置Ñ亚基的大分子复合物或更小或更独特的蛋白(<0.5 MDA)在细胞中的位置。此外,混合动力EM的加工方法,其中结合subtomogram平均单粒子分析或螺旋重建最近确定的蛋白结构,以〜8 A 42,43。这些处理方法目前仅限于纯化的蛋白质,这是很好的分离在冰面或形成螺旋集会,目前并不适用于拥挤的细胞环境,如线粒体嵴膜。数据收集,正在开发新的计算和硬件工具,使自动化断层图像采集,增加图像的对比度和降低的总要求电子剂量。在低温ET的唯一基本限制是辐射损坏样品的电子束。这就是说,只有非常低的电子剂量可用于记录的断层倾斜系列的每个图像,从而产生信号叔差Ø信噪比,最终限制了可实现的分辨率。新的直接电子探测器,发布不到一年前,正在彻底改变单粒子冷冻电镜44,45领域。这些新的检测器提供更高的对比度和更好的分辨率更低的电子剂量。对于低温电子断层扫描,这意味着更小的步长,甚至双轴断层的倾角系列无需过多有关辐射损伤(1 CCD图像是在电子剂量相当于5直接电子探测器图像)的关注被收集。海量通过这些检测器产生的数据中创建数据的处理,处理和存储他们自己的挑战,这将必须被克服。
此外,相板,类似的原则与在光学显微镜经常使用的工作,以提高相衬,目前正在透射电子显微镜46,4开发7,这应该允许断层图像被收集更接近焦点,并因此以较高的分辨率,而同时保持低的分辨率提供必要的对准和断层体积的解释。总之,这些技术进步将极大地扩大了可以通过冷冻ET来解决生物学问题的范围。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由马克斯·普朗克学会(KMD,BD,AWM,结核病,台湾企银,粉喷桩,和星期),法兰克福卓越“大分子复合物”的集群由德意志研究联合会(星期)和一个博士后EMBO长期资金支持奖学金(VAMG)。
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |