Se presenta un protocolo de cómo recoger y electrones proceso de crio-tomografías de toda la mitocondria. La técnica ofrece una detallada comprensión de la estructura, función y organización de grandes complejos de proteínas de membrana en membranas biológicas nativas.
Electron crio-tomografía es una poderosa herramienta en biología estructural, capaz de visualizar la estructura tridimensional de muestras biológicas, tales como células, orgánulos, vesículas de membrana, o virus en detalle molecular. Para lograr esto, la muestra acuosa se vitrifica rápidamente en etano líquido, que conserva en un estado congelado-hidratado próxima al nativo. En el microscopio electrónico, la serie de inclinación se registran a la temperatura del nitrógeno líquido, de la que se reconstruyen las tomografías 3D. La relación señal-ruido del volumen tomográfica es inherentemente baja. Características reconocibles y recurrentes son realzados por un promedio subtomogram, por el cual subvolúmenes individuales se cortan, alineados y se promediaron para reducir el ruido. De esta manera, los mapas 3D con una resolución de 2 nm o mejor se puede obtener. Un ajuste de las estructuras de alta resolución disponibles para el volumen 3D a continuación, produce los modelos atómicos de complejos de proteínas en su ambiente nativo. Aquí te mostramos cómo usamos electrones crio-tomography para estudiar la organización in situ de grandes complejos de proteínas de membrana en las mitocondrias. Encontramos que ATP sintasas se organizan en filas a lo largo de dímeros ápices altamente curvadas de las crestas de la membrana interna, mientras que el complejo I se distribuye aleatoriamente en las regiones de membrana a cada lado de las filas. Por subtomogram de promedio se obtuvo una estructura de la ATP sintasa mitocondrial dímero dentro de la membrana crestas.
Las mitocondrias son los power-casas de la célula. Mediante la conversión de un gradiente de protones electroquímico a través de la membrana mitocondrial interna en energía de enlace químico, la ATP sintasa mitocondrial produce la mayor parte del ATP que impulsa procesos celulares. Con el fin de entender los mecanismos detrás de la conversión de energía mitocondrial, tenemos que determinar la estructura de la ATP sintasa in situ, y para averiguar cómo se organiza y se distribuye en la membrana mitocondrial interna. Aunque las estructuras de alta resolución de la mayoría de los componentes mitocondriales ATP sintasa 1-3 y mapas de baja resolución de todo el complejo 4 están disponibles, es importante establecer la estructura y conformación de la enzima de trabajo en la membrana. La distribución de la ATP sintasa en la membrana mitocondrial interna se ha asumido ampliamente que ser al azar, pero uno de los primeros 5 y la búsqueda de nuestros propios resultados iniciales 6 indicaron que este no es tél caso. Estudios posteriores de nuestro grupo y otros 7 han confirmado que la ATP sintasa está dispuesto en largas filas de dímeros a lo largo de las crestas fuertemente curvadas de la membrana mitocondrial interna crestas 8, mientras que las bombas de protones de la cadena de transporte de electrones parecen estar localizados a cada lado de las filas 9. Esta disposición tiene importantes implicaciones para los mecanismos de conversión de energía mitocondrial.
La técnica que hemos utilizado para determinar esta disposición es la crio-tomografía electrónica (crio-ET). Cryo-ET es actualmente el único método que ofrece en tres dimensiones (3D) los volúmenes exactos de las células, los compartimentos celulares u orgánulos con resolución molecular. Cryo-ET es particularmente adecuada para el estudio de grandes complejos en las membranas biológicas, ya que las membranas aparecen con buen contraste y son fáciles de rastrear en los volúmenes de tomográficas 3D.
Otros métodos para el estudio de la estructura 3D de las células o organelles no proporcionan detalles moleculares. Super-resolución microscopía de luz 10, 11 es excelente a revelar la posición o las distancias entre las etiquetas emisores de luz unidos a proteínas de interés con una precisión de decenas de nm, pero no revela la estructura de la proteína en sí, incluso a baja resolución . Microscopía electrónica de transmisión de secciones en serie 12 o imagen de bloque de cara por microscopía electrónica de barrido 13 de muestras biológicas de plástico embebido proporcionan vistas de baja resolución de los volúmenes celulares pero igualmente no revelan detalle molecular. Microscopía de fuerza atómica 14 puede entregar, en principio, resolución molecular o incluso atómica, pero sólo en la superficie de los objetos sobre un soporte atómicamente plana, sólida. Por último, la tomografía de rayos X 15 o dispersión de pulsos de rayos X intensos de láseres de electrones libres es poco probable para revelar la estructura de grandes complejos, objetos, aperiódicas tales como células enteras u orgánulos en 16 mresolución olecular en un futuro previsible. Así, en la actualidad, no hay alternativa a la crio-ET para el estudio de la estructura 3D de las células u orgánulos con una resolución nanométrica.
Cryo-ET es el método de elección para examinar la estructura y la conformación de los conjuntos de proteínas asociadas a la membrana, incluyendo el complejo del poro nuclear 17, el pico de la gripe complejos 18, y los flagelos proteínas de motor 22, 23 sino también la organización de las células bacterianas enteras 19 y la entrada de los virus patógenos como el VIH en las células a 20-23. Cryo-ET tiene un valor incalculable para la visualización de proteínas filamentosas y sus interacciones en la célula, incluyendo los filamentos de actina 24 o axonemas 25. La resolución puede ser mejorada a 2 nm o mejor por subtomogram promediando 26, mediante el cual subvolúmenes de repetidos, rasgos regulares se cortan de un volumen tomográfica y un promedio por partícula sola imagen protécnicas de procesamiento.
Cryo-ET implica la adquisición de una serie de imágenes de proyección de un espécimen delgada (<250 nm) tomadas en diferentes ángulos de inclinación en un microscopio electrónico de transmisión (TEM). La muestra debe ser delgada por lo que los electrones, que interactúan fuertemente con la materia, se dispersan más de una vez. Dispersión múltiple hace que las imágenes resultantes difíciles de interpretar y reduce el contraste. Las imágenes de la superficie de la muestra seleccionada están alineados uno con respecto al otro y se proyectan en un espacio 3D mediante un programa informático adecuado, generando un volumen 3D de la muestra. La alineación de las imágenes es ayudada por marcadores de referencia de oro, que se mezclan con la muestra antes de la congelación. Idealmente marcadores de referencia 10 o más uniformemente distribuidos deben estar presentes en cada imagen para conseguir una buena alineación.
Observar el detalle molecular, las muestras son-caída congelado en etano líquido, que conserva su estado hidratado nativo. Congelación en líquidoetano es tan rápido (~ 10 5 ° C / s) 27 de que el agua no cristaliza sino que permanece en un estado vitrificado, similar al vidrio. Cristal de hielo daños formación estructuras biológicas sensibles. Como muestras biológicas sufren de daños por radiación, hay un límite para el número total de eventos de dispersión de la muestra puede tolerar. Las imágenes se adquirieron por lo tanto en el modo de dosis baja: Un área de interés se identifica a bajo aumento (1,500X) con una dosis de electrones por debajo de 1 e – / 2 nm (en modo de búsqueda). Para enfocar la imagen a continuación, con un aumento más alto, fuera del área de interés (modo de enfoque). Sólo cuando se adquiere una imagen, el área de interés se irradia con una dosis de electrones superior (modo de exposición).
A continuación, presentamos una visión general de cómo recoger y electrones proceso de crio-tomografías, utilizando dímeros ATP sintasa en la membrana mitocondrial interna como ejemplo. El siguiente protocolo describe cómo preparar la mitocondria para la crio-ET, cómo configurary recoger una serie de inclinación con una dosis total de electrones específica, y cómo procesar la serie de inclinación para obtener un volumen 3D del área de interés. Una visión general del procedimiento se ilustra en la Figura 1.
El protocolo presentado aquí proporciona una introducción a la crio-ET y subtomogram promedio de las mitocondrias, pero esencialmente el mismo procedimiento se puede aplicar a cualquier otro compartimiento celular o membrana. Para obtener los mejores datos posibles, pasos críticos durante el procedimiento son: la preparación, la estrategia de adquisición proceso de congelación profunda y datos. La calidad de la muestra, lo cual es crítico para el éxito, depende de un protocolo de congelación optimizado para asegurar el espesor del hielo adecuado, el cual es de suma importancia para el buen contraste de la imagen. La estrategia óptima de adquisición de datos depende del instrumento y la muestra. Parámetros para ser optimizadas incluyen dosis de electrones por imagen, esquema de inclinación y desenfoque. La adquisición de una buena tomografía de una buena muestra hace todo el procesamiento de nuevas medidas más fácil y asegura un resultado final satisfactorio.
Cryo-ET combinado con un promedio subtomogram y ajuste del modelo atómico proporciona detalles de cómo los complejos de proteínas se disponen en lentorno celular nativo eir. La técnica es igualmente adecuado para la investigación de la estructura de grandes complejos de proteínas de membrana, tales como supercomplexes cadena respiratoria (1,7 MDA), dímeros de la ATP sintasa (2×500 kDa), o el complejo de poro nuclear (~ 120 MDa) 8, 9, 17. La organización de dímeros ATP sintasa en filas no puede ser observado por técnicas de alta resolución como la cristalografía de rayos X, RMN o de una sola partícula crio-EM, porque las filas de dímero se interrumpen por extracción con detergente, que es un paso necesario en el aislamiento y la purificación de complejos de proteínas de membrana.
La disposición de la ATP sintasa en filas a lo largo de las crestas de dímeros cristae es un principio de organización universal de las mitocondrias en todas las especies. Los complejos de bombeo de protones de la cadena de transporte de electrones, en particular, el complejo I (NADH deshidrogenasa), se encuentran en las áreas de membrana a cada lado de las filas 8,9. Esta organización de la cadena respiratoria tiene un profundo impacto en la bioenergética mitocondrial. Si las filas de dímero no pueden formar debido a la ausencia de subunidades de proteínas de dímero-específica, las células presentan tiempos de generación más largos y reducción de la aptitud celular, como se observa en el mutante de levadura se muestra en la figura 3 41. Con el creciente interés en las enfermedades mitocondriales, un detallado comprensión de las bases moleculares que regulan ultraestructura y la función mitocondrial es de suma importancia. Electron crio-tomografía proporciona un enlace entre la estructura de la proteína se determina por métodos de alta resolución, y la distribución y disposición de estas proteínas en la membrana en la escala de nanómetros. Esto hace que la crio-ET en una herramienta esencial para la comprensión de la estructura y función mitocondrial en la salud y la enfermedad.
Otros desarrollos técnicos y las mejoras en la crio-ET incluyen estrategias de proteína de etiquetado para identificar la posición de protein subunidades de los complejos macromoleculares o la localización de proteínas distintas más pequeños o menos (<0,5 MDA) en las células. Además, los métodos de procesamiento EM híbridos, que combinan subtomogram promediado con el análisis de una sola partícula o reconstrucción helicoidal han determinado recientemente estructuras de proteínas a ~ 8 Å 42, 43. Estos métodos de tratamiento se limitan actualmente a las proteínas purificadas, que están bien separados en hielo o forman asambleas helicoidales y en la actualidad no son aplicables a entornos celulares concurridos como las mitocondrias y crestas membranas. Para la recolección de datos, las nuevas herramientas informáticas y hardware se están desarrollando para permitir la adquisición tomografía automatizada, aumentar el contraste de la imagen y reducir la dosis total de electrones requerida. La única limitación fundamental en crio-ET es el daño por radiación a la muestra por el haz de electrones. Esto significa que sólo dosis muy bajas de electrones se pueden utilizar para grabar cada imagen de una serie de inclinación tomográfica, resultando en una mala señal-tratio que limita en última instancia, la resolución alcanzable o-ruido. Los nuevos detectores de electrones directo, lanzado hace menos de un año, están revolucionando el campo de una sola partícula crio-EM 44, 45. Estos nuevos detectores proporcionan mayor contraste y una mejor resolución en dosis más bajas de electrones. Para la crio-tomografía electrónica, esto significa que la serie de inclinación con tamaños de paso más pequeñas o tomografías ejes duales incluso se puede recoger sin preocupaciones sobre el daño por radiación excesiva (una imagen CCD es equivalente en dosis de electrones 5 imágenes directas del detector de electrones). Las grandes cantidades de datos producidos por estos detectores de crear sus propios desafíos en el manejo de datos, procesamiento y almacenamiento, lo que tendrá que superar.
Además, placas de fase, que funcionan sobre principios similares a los usados rutinariamente en la microscopía de luz para mejorar el contraste de fase, se están desarrollando actualmente para microscopía electrónica de transmisión 46, 47. Esto debería permitir que las tomografías que se recojan más cerca de enfocar y por lo tanto en una resolución más alta, mientras que al mismo tiempo que se preserva de baja resolución características necesarias para la alineación y la interpretación de los volúmenes de tomográficas. Tomados en conjunto, estos avances tecnológicos se ampliará considerablemente la gama de cuestiones biológicas que pueden ser abordadas por crio-ET.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Max Planck (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM, y WK), el Cluster de Excelencia Frankfurt "complejos macromoleculares", financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) y una postdoctoral EMBO a largo plazo Fellowship (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |