Vi presenterar ett protokoll för hur man samlar in och bearbeta elektron Cryo-tomogram av hela mitokondrier. Tekniken ger detaljerade insikter i struktur, funktion och organisation av stora membranproteinkomplex i inhemska biologiska membran.
Elektron Cryo-tomografi är ett kraftfullt verktyg i strukturbiologi, med förmåga att visualisera den tredimensionella strukturen av biologiska prover, såsom celler, organeller, membran blåsor eller virus på molekylär detalj. För att uppnå detta är det vattenhaltiga provet snabbt förglasat i flytande etan, som bevarar den i en nära-to-native, frysta hydrerad tillstånd. I elektronmikroskop, är tilt-serien spelas in vid vätsketemperatur kväve, som 3D tomogram rekonstrueras. Förhållandet signal-till-brus av tomografiska volymen är i sig låg. Igenkännbara, återkommande fördelar som finns med subtomogram medelvärdes, genom vilken enskilda subvolymer skärs ut, i linje och i genomsnitt för att minska bullret. På detta sätt, 3D-kartor med en upplösning av 2 nm eller bättre kan uppnås. En passning av tillgängliga högupplösta strukturer för att 3D-volymen producerar sedan atommodeller proteinkomplex i sin ursprungliga miljö. Här visar vi hur vi använder elektron Cryo-tomography att studera in situ organisera stora membranproteinkomplex i mitokondrier. Vi finner att ATP-syntaser är organiserade i rader av dimerer längs starkt krökta spetsarna hos det inre membranet crista, medan komplex I är slumpvis fördelad i membranregioner på endera sidan av raderna. Genom subtomogram medelvärdes fick vi en struktur av mitokondriell ATP-syntas dimer i crista membranet.
Mitokondrierna är power-husen i cellen. Genom att omvandla en elektrokemisk protongradient över det inre mitokondriemembranet i kemisk bindning energi, producerar den mitokondriella ATP-syntas mesta av ATP som driver cellulära processer. För att förstå mekanismerna bakom mitokondriell energiomvandling, måste vi bestämma strukturen av ATP-syntas på plats, och för att ta reda på hur det är organiserat och distribueras i det inre mitokondriemembranet. Även högupplösta strukturer flesta mitokondriella ATP-syntas komponenter 1-3 och lågupplösta kartor över hela komplexet 4 finns tillgängliga, är det viktigt att fastställa strukturen och konforma av arbets enzymet i membranet. Fördelningen av ATP-syntas i den inre mitokondriemembranet har i stor utsträckning antas vara slumpmässigt, men en tidig hitta 5 och våra egna initiala resultat 6 indikerade att detta inte tHan fallet. Efterföljande studier från vår grupp och andra 7 har bekräftat att ATP-syntas är ordnade i långa rader av dimerer längs tätt böjda åsar av det inre mitokondriemembranet crista 8, medan protonpumparna i elektrontransportkedjan tycks vara belägen på endera sidan av raderna 9. Detta arrangemang har stor betydelse för mekanismerna för mitokondriell energiomvandling.
Tekniken som vi har använt för att fastställa detta arrangemang är elektron Cryo-tomografi (kryo-ET). Cryo-ET är för närvarande den enda metod som ger exakta tredimensionella (3D) volymer av celler, cellulära fack eller organeller på molekylär upplösning. Cryo-ET är särskilt lämplig för att studera stora komplex i biologiska membran, eftersom membranen visas med bra kontrast och är lätta att spåra i 3D tomografiska volymer.
Andra metoder för att studera 3D-strukturen av celler eller organelles ger inte molekylär detalj. Super-upplösning Ijusmikroskopi 10, 11 är utmärkt att avslöja positionen eller avstånden mellan Ijusemitterande etiketter fästa till proteiner av intresse med en precision på tiotals nm, men det avslöjar inte strukturen av proteinet självt, även vid låg upplösning . Transmissionselektronmikroskopi av seriella sektioner 12 eller blockera ansikte avbildning med svepelektronmikroskop 13 av plastinbäddade biologiska prover ger lågupplösta vyer av cellulära volymer men heller inte avslöja molekylär detalj. Atomkraftsmikroskopi 14 kan i princip leverera molekylär eller till och med atomär upplösning, men bara på ytan av föremål på ett atomärt plant, fast underlag. Slutligen 16 är det osannolikt att avslöja strukturen hos stora, komplexa, aperiodiska föremål såsom hela celler eller organeller vid m röntgentomografi 15 eller spridning av intensiva röntgenpulserna från frielektronlasrarolecular upplösning inom överskådlig framtid. Således närvarande finns det inget alternativ till Cryo-ET för studier av 3D-strukturen av celler eller organeller i nanometerupplösning.
Cryo-ET är metoden för att undersöka strukturen och konforma av membranassocierade proteinaggregat, inklusive den nukleära por komplex 17, influensa spik komplex 18, och flagmotorproteiner 22, 23 men också organisationen av hela bakterieceller 19 och inmatning av patogena virus såsom HIV in till celler 20-23. Cryo-ET är ovärderlig för att visualisera trådformiga proteiner och deras interaktioner i cellen, inklusive aktinfilament 24 eller axonemes 25. Upplösningen kan ökas till 2 nm eller bättre genom subtomogram genomsnitt 26, vari subvolymer upprepade, regelbundna drag skärs ut ur en tomografisk volym och i genomsnitt genom en enda partikel bild probetningstekniker.
Cryo-ET innebär förvärv av en serie av projektionsbilder av en tunn exemplar (<250 nm) som tas på olika lutningsvinklar i ett transmissionselektronmikroskop (TEM). Provet måste vara tunn, så att elektroner, som interagerar starkt med materia, är utspridda högst en gång. Multipel spridning gör de resulterande bilderna svårtolkade och minskar kontrasten. Bilder av den valda provområdet är inriktade i förhållande till varje annan och projiceras in i en 3D-rymd genom ett lämpligt datorprogram, alstra en 3D-volym av provet. Anpassningen av bilderna underlättas av guld referensmarkörer, som blandas med provet innan frysning. Helst 10 eller mer jämnt fördelade referensmarkörer bör finnas i varje bild för att uppnå en god anpassning.
För att observera molekylära detaljer, proverna dopp frysta i flytande etan, som bevarar deras naturliga hydratiserade tillståndet. Frysning i flytandeetan är så snabb (~ 10 5 ° C / s) 27 att vatten inte kristalliserar men finns kvar i en keramisk, glasliknande tillstånd. Iskristallbildning skadar känsliga biologiska strukturer. Som biologiska prover lider av strålningsskador, det finns en gräns för det totala antalet spridningsevenemang exemplaret kan tolerera. Bilderna alltså förvärvas i lågdos-läge: Ett område av intresse identifieras vid låg förstoring (1,500X) med ett elektron dos under 1 e – / nm 2 (sökläge). Bilden fokuseras sedan på en större förstoring, utanför intresseområdet (fokusläge). Först när en bild förvärvas, är det intressanta området bestrålas med en högre elektron dos (exponeringsläge).
Här presenterar vi en översikt över hur man samlar in och bearbeta elektron Cryo-tomogram, med hjälp av ATP-syntas dimerer i den inre mitokondriemembranet som exempel. Följande protokoll beskriver hur man förbereder mitokondrier för Cryo-ET, hur man ställer inoch samla in en lutning serie med en specifik total elektrondosen, och hur man bearbetar lutnings serien för att få en 3D-volym av det intressanta området. En översikt av förfarandet illustreras i fig 1.
Protokollet presenteras här ger en introduktion till cryo-ET och subtomogram medelvärdes av mitokondrier, men i huvudsak samma förfarande kan tillämpas på alla andra cellfack eller membran. För att få bästa möjliga information, kritiska steg under förfarandet är provberedning, steget frysprocessen och dataförvärvsstrategi. Prov kvalitet, vilket är avgörande för framgång, beror på ett optimerat frysning protokollet för att garantera lämpliga istjocklek, vilket är av största betydelse för god bildkontrast. Den optimala datainsamling strategi beror på instrumentet och provet. Parametrar som ska optimeras omfattar elektron dos per bild, tiltsystemet och minskad fokus. Förvärva en bra tomogram en bra prov gör all vidare behandling steg lättare och ger ett tillfredsställande slutresultat.
Cryo-ET kombinerat med subtomogram medelvärdes och atommodell montering ger detaljer om hur proteinkomplex är ordnade i their nativa cellulära miljö. Tekniken är lika väl lämpade för att undersöka strukturen hos stora membranproteinkomplex, såsom respiratoriska kedjan supercomplexes (1,7 MDA), ATP-syntas-dimerer (2×500 kDa), eller den nukleära por komplex (~ 120 MDA) 8, 9, 17. Organiseringen av ATP-syntas dimerer i rader kan inte observeras av högupplösta tekniker såsom röntgenkristallografi, NMR eller kryo-EM enda partikel, eftersom dimer raderna störs av detergentextraktion, vilket är ett nödvändigt steg i isoleringen och rening av membranproteinkomplex.
Arrangemanget av ATP-syntas i rader av dimerer längs crista åsar är en princip universell organisering av mitokondrier i alla arter. De protonpump komplex av elektrontransportkedja, särskilt komplex I (NADH dehydrogenas), finns i membranområdena vardera sidan av raderna 8,9. Denna organisation av andningskedjan har stor inverkan på mitokondriella bioenergetik. Om dimeren rader inte kan bildas på grund av frånvaron av dimer-specifik proteinsubenheter, cellerna uppvisar längre generationstider och minskad cellulär kondition, såsom observerats i jästmutant som visas i fig 3 41. Med det växande intresset för mitokondriella sjukdomar, en detaljerad förståelse av den molekylära grunden reglerar mitokondriell ultrastruktur och funktion är av största vikt. Elektron Cryo-tomografi ger en länk mellan proteinstruktur bestäms av högupplösta metoder, samt distribution och arrangemanget av dessa proteiner i membranet på skalan av nanometer. Detta gör Cryo-ET ett viktigt verktyg för att förstå mitokondriell struktur och funktion i hälsa och sjukdom.
Ytterligare tekniska utvecklingen och förbättringar av Cryo-ET inkluderar protein-märkning strategier för att identifiera positionen för protein subenheter i makromolekylära komplex eller platsen för mindre eller mindre distinkta proteiner (<0,5 MDA) i celler. Dessutom har bearbetningsmetoder hybrid EM, som kombinerar subtomogram medelvärdes med enda analys partikel eller spiral rekonstruktion nyligen fastställt proteinstrukturer till ~ 8 Å 42, 43. Dessa bearbetningsmetoder är för närvarande begränsad till renade proteiner, som är väl separerade i is eller bildar spiralformade församlingar och för närvarande inte tillämplig för trångt cellulära miljöer som mitokondrier och crista membran. För datainsamling, nya datorer och datorutrustning som utvecklas för att möjliggöra automatiserad tomogram förvärvet ökar bildens kontrast och minska den totala erforderliga elektrondosen. Den enda grundläggande begränsning i kryo-ET är strålningsskador på provet av elektronstrålen. Detta innebär att endast mycket låga elektron doser kan användas för att spela in varje bild av en tomografisk lutning serie, vilket resulterar i dålig signal-to-brusförhållande som i slutänden begränsar den uppnåbara upplösningen. De nya direktelektrondetektorer, som släpptes mindre än ett år sedan, för närvarande revolutionera området Cryo-EM 44, 45 single-partikel. Dessa nya detektorer ger högre kontrast och bättre upplösning vid lägre elektron doser. För elektron Cryo-tomografi, innebär detta att luta serie med mindre stegstorlekar eller till och med dubbla axel tomogram kan samlas in utan oro svåra skador strålning (en CCD är likvärdig i elektron dosen till fem direkta elektrondetektorbilder). De stora mängder data som produceras av dessa detektorer skapa sina egna utmaningar inom datahantering, bearbetning och lagring, som måste övervinnas.
Dessutom fas plattor, som fungerar på liknande principer som de som används rutinmässigt i ljusmikroskop för att öka fas kontrast, utvecklas för närvarande för transmissionselektronmikroskopi 46, 47. Detta bör göra det möjligt tomogram som ska samlas närmare fokusera och därmed hade högre upplösning, medan samtidigt bevara lågupplöst funktioner som behövs för anpassning och tolkning av tomografiska volymer. Sammantaget kommer dessa tekniska framsteg kraftigt öka utbudet av biologiska frågor som kan tas upp av Cryo-ET.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Max Planck-sällskapet (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM och WK), Cluster of Excellence Frankfurt "makromolekylära komplex" som finansieras av Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) och en postdoktoral EMBO Long-Term Fellowship (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |