Abstract
Moléculas odoríferas ligam aos seus receptores-alvo de forma precisa e coordenada. Cada receptor reconhece um determinado sinal e retransmite essa informação para o cérebro. Como tal, a determinação de como a informação é transferida para olfactiva do cérebro, modificando tanto a percepção e comportamento, a investigação mérito. Curiosamente, não há evidências emergentes que transdução celular e transcrição fatores estão envolvidos na diversificação de neurônio receptor olfativo. Aqui nós fornecemos um todo robusto montar método de marcação imunológica do ensaio in vivo olfativo organização neurônio receptor. Usando este método, identificamos todos os neurônios receptores olfativos com o anticorpo anti-elav, um marcador pan-neural conhecido e Or49a-mCD8 :: GFP, um neurônio receptor olfativo especificamente expressos em Nba neurônio usando anticorpo anti-GFP.
Introduction
O sistema olfactivo é usado para distinguir entre uma imensa variedade de moléculas de odor e, subsequentemente, para enviar a informação resultante para os centros do cérebro superior. Esta entrada é usada para controlar com precisão os comportamentos animais fundamentais, como alimentação e acasalamento 1-6. Como cada tipo de neurônio olfativo está associada a um conjunto específico de odores, a diversificação de neurônios receptores olfativos (ORN) s é essencial para o bom funcionamento do sistema olfativo 7.
Genética de Drosophila nos permite realizar investigação único nível celular que envolve mecanismos moleculares associados ao desenvolvimento de ORN e função fisiológica 8-16. Whole immunostaining montagem de Drosophila antenas nos permitiu compreender em maior detalhe os mecanismos moleculares envolvidos na diversificação de neurônios receptores olfativos (ORN) s 7. Aqui nós fornecemos uma descrição completa de um método simples para achieve este.
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Protocol
1. Prepare placa maçã
- Misture 12,5 g de agar, 125 ml de sumo de 100% disponível comercialmente de maçã, 12,5 g de glucose, e 375 ml de H 2 O. Microondas a mistura durante 1 a 2 minutos e derramar para o prato de cultura de 3 centímetros de células. Armazenar a 4 ° C.
2. Cruzamento genético
- Use o seguinte cruzamento genético representativo:
Or49a-mCD8 :: GFP / cyo x w 1118
3. Dissecção e coloração protocolo
- Anestesiar a voar e, em seguida, cortar a cabeça voar verticalmente, segurando-o com uma pinça.
- Com cuidado, coloque a parte que contém antenas em uma placa de maçã.
- Corte o terceiro segmento da antena com uma tesoura de dissecção finas.
- Colocar 90 mL de solução de fixação (4% de paraformaldeído em 0,1% de PBST (PBS com 0,1% de Triton X-100)) para o meio de um prato de cultura de fundo de vidro.
- Gentilmente transferir o antenn dissecadoae com uma agulha fina diretamente para a solução de fixação. Se necessário, submergir fisicamente as antenas na solução usando agulha.
- Incubar durante 40 minutos à temperatura ambiente (RT). Lava-se a antenas de 0,4% de PBST (PBS com 0,4% de Triton X-100), 3 x 10 minutos em cada um, mantê-los no mesmo prato. Utilize pontas amarelas para remover e adicionar solução PBST. Utilizar 90 mL de solução de lavagem de cada vez.
NOTA: Não coloque o prato em um shaker durante imunohistoquímica. Antes de retirar ou acrescentar a solução para o prato, trazer todas as antenas para o centro do prato utilizando a agulha e cuidadosamente adicionar ou retirar a solução a partir da borda do prato. - Bloquear as antenas com 90 ul de 5% de soro normal de cavalo a 0,1% em PBST, durante 20 minutos à RT.
- Após a remoção da solução de bloqueamento, incubar as antenas com 90μl de anticorpos primários em PBST contendo 0,1% a 5% de soro de cavalo durante 48 horas a 4 ° C em um recipiente tal como descrito previamente humedecida
- Lava-se a antenas de 6x 10 minutos em 0,4% de PBST.
- Incubar a antenas com 90 ul de anticorpos secundários em PBST contendo 0,1% a 5% de soro de cavalo durante 48 horas a 4 ° C. Lavar 6x 10 minutos usando 0,4% de PBST.
- Para montar as antenas, remover PBST a partir do prato de cultura, tanto quanto possível, e, gradualmente, apresentar duas concentrações diferentes de glicerol às antenas. Primeiro adicionar 40% de glicerol para o prato durante 1 a 2 minutos; em seguida, retire este e adicionar 80% de glicerol.
- Extrair cuidadosamente as antenas (incluindo 80% de glicerol) da placa de cultura com ponta amarela e colocá-las em um slide. Delicadamente, coloque uma lamela em cima e selar as bordas lamela com unha polonês. As antenas estão agora prontos a ser trabalhada por meio de microscopia de fluorescência.
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Representative Results
A garantia de que tanto a dissecção e fixação são realizadas rapidamente é um fator chave para alcançar o sucesso com este protocolo. Usando uma tesoura fina e pinças também é crucial. Após imunocoloração, fluorescentes rotulado antenas foram examinados sob um microscópio confocal. Nós, normalmente, seções 1 Hm usando uma lente de 20x. Nós rotulado Nba 7 ORNs usando Or49a-mCD8 :: GFP e contou o número de Nba ORNs no tipo selvagem antena. O repórter mCD8-GFP está localizada membrana celular e por isso a expressão visto na Figura 2 mostra a membrana da célula de OR49a ORNs expressando GFP. Na Figura 2 mostra a expressão da NBA ORNs usando anticorpo anti GFP e anti elav foi usada como um marcador de pan-neural. O número médio de ORNs NBA por antena é de 20 (n = 8).
Figura 1: Visão geral da dissectioprocesso n.
Figura 2: Projeção da confocal Z-série de uma antena dissecado com sucesso. Para detectar os neurónios anticorpo anti-elav foi usada como um marcador de pan-neural (A) e anticorpo anti-GFP para detectar a expressão específica do receptor olfactivo de (B) e imagem fundida como mostrado em (C).
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Discussion
A dissecção da antena Drosophila descrevemos é simples e fácil de executar em um ambiente de laboratório. Para garantir uma dissecção bem sucedido, é essencial utilizar uma tesoura fina gumes. Enquanto a antena imunocoloração dissecado, que é importante para incubar em um recipiente cheio de humidade para evitar a evaporação da solução de anticorpo. A antena dissecados tem uma tendência para flutuar na solução. Utilizando 0,1% de Triton em PBS, durante a fixação e bloqueio passos irá facilitar a submersão da antena na solução e para assegurar uma melhor coloração. Usando o "fundo de vidro prato de cultura" pode reduzir a perda de antenas durante imunomarcação e garantir os pequenas quantidades (90 L) de solução de anticorpos utilizados em cada experimento.
Diversificação de classe neuronal é uma característica central de neurogênese. Este processo fisiológico é exemplificado no sistema olfactivo, que utiliza uma grande variedade de neurónios receptores olfactivos (ORN)aulas. Geração de uma ampla variedade de ORNs com a expressão do receptor olfactivo e direccionamento axonal é essencial para gerar a diversidade neuronal requerida para a transmissão de informação a partir de moléculas de odor para os centros do cérebro superior. Toda a nossa montagem de antenas auxiliares de protocolo imunocoloração em aprofundar nossa compreensão do mecanismo molecular subjacente diversificação ORN.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Programa MEXT-suportada para a Fundação de Pesquisa Estratégica em Universidades Privadas e JSPS Jovem Cientista B subvenção para HT Gostaríamos de agradecer Ohtake Norihito para editar os vídeos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
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