Abstract
Пахучих молекул связываются с их целевыми рецепторами в точном и скоординированным образом. Каждый рецептор распознает специфический сигнал и передает эту информацию в мозг. Таким образом, определение того, как обонятельная информация передается в мозг, изменяя как восприятие и поведение, заслуживает изучения. Интересно, что появляется все больше доказательств, что сотовой трансдукции и транскрипционные факторы участвуют в диверсификации обонятельной нейрона рецептора. Здесь мы предлагаем надежные вся гора иммунологический способ маркировки для анализа в естественных условиях обонятельный организацию рецепторов нейронов. Используя этот метод, мы определили все обонятельные нейроны рецептора с анти-Elav антитела, известный пан-нейронной маркера и Or49a-mCD8 :: GFP, обонятельного рецептора нейрона специально выражается в НБА нейрона с использованием анти-GFP антитела.
Introduction
Обонятельная система используется, чтобы различать между огромным разнообразием молекулами запаха и впоследствии отправить получаемую информацию на высших мозговых центров. Этот вход используется для точного контроля фундаментальные поведения животных, такие как кормление и спаривание 1-6. Поскольку каждый обонятельный Тип нейрон связан с определенным набором запахов, диверсификации обонятельных рецепторных нейронов (ORN) с является жизненно необходимым для обонятельной системы функции 7.
Drosophila генетика позволяет нам выполнять один расследование клеточном уровне с участием молекулярных механизмов, связанных с развитием ORN и физиологической функции 8-16. Вся гора иммуноокрашивание Drosophila антенн позволило нам понять более подробно молекулярные механизмы, участвующие в диверсификации обонятельных рецепторных нейронов (ORN) с 7. При этом мы предоставляем всестороннее описание простой метод для переменного токаhieve это.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка яблочный пластину
- Смешайте 12,5 г агара, 125 мл 100% коммерчески доступного яблочный сок, 12,5 г глюкозы и 375 мл H 2 O. Микроволновая смеси в течение от 1 до 2 минут и вылить на блюдо 3 см клеточной культуре. Хранить при температуре 4 ° C.
2. Генетическая крест
- Используйте следующую представительство генетический крест:
Or49a-mCD8 :: GFP / суо х Ш 1118
3. Протокол Вскрытие и окрашивание
- Обезболить муху, а затем вырезать летать голову вертикально, удерживая его с помощью пинцета.
- Аккуратно положите антенн, содержащий часть на яблоко пластины.
- Разрежьте третий сегмент антенны с использованием тонких ножниц рассечение.
- Поместите 90 мкл фиксирующего раствора (4% параформальдегида в 0,1% PBST (PBS с 0,1% Triton X-100)) в середине со стеклянным дном чашки для культивирования.
- Аккуратно передачи расчлененный Antennае с острой иглой непосредственно в фиксирующем растворе. При необходимости физически погрузить антенны в растворе с использованием иглы.
- Инкубировать в течение 40 минут при комнатной температуре (RT). Вымойте антенны в 0,4% PBST (PBS с 0,4% Triton X-100), 3x 10 минут в каждом, держа их в том же блюде. Используйте желтые советов, удалять и добавлять решение PBST. Используйте 90 мкл промывочного раствора каждый раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не устанавливайте блюдо в шейкер во иммуногистохимии. Перед удалением или добавлением раствора в блюдо, принести все антенны в центр блюда, используя иглу и осторожно добавить или удалить решение от края тарелки. - Блок антенн с 90 мкл 5% нормальной лошадиной сыворотки в 0,1% PBST в течение 20 минут при комнатной температуре.
- После удаления блокирующего раствора, инкубировать антенн с 90 мкл первичных антител в 0,1% PBST, содержащем 5% лошадиной сыворотки в течение 48 ч при 4 ° С в увлажненной контейнера, как описано ранее
- Вымойте антенны 6x 10 минут в 0,4% PBST.
- Инкубируйте антенны с 90 мкл вторичных антител в 0,1% PBST, содержащем 5% лошадиной сыворотки в течение 48 ч при 4 ° С. Вымойте 6х 10 минут с помощью 0,4% PBST.
- Для установки антенны, удалить PBST из культуральной чашке, насколько это возможно, и постепенно вводить двух разных концентраций глицерина к антеннам. Сначала добавьте 40% глицерина в чашке в течение от 1 до 2 минут; затем снимите это и добавить 80% глицерина.
- Осторожно извлечь усики (в том числе 80% глицерина) из культуральной блюдо, используя желтый наконечник и разместить их на слайд. Аккуратно поместите покровное на вершине и печать покровное края с лаком для ногтей. Усики готов для включения в образ с помощью флуоресцентной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обеспечение соответствия рассечение и фиксация выполняются быстро является ключевым фактором в достижении успеха с этим протоколом. Использование тонких ножниц и щипцов также имеет решающее значение. После иммуноокрашивания, люминесцентные помечены антенны исследовали под конфокальной микроскопии. Мы обычно занимает 1 мкм разделы, используя 20x объектив. Мы помечены НБА 7 ORNs используя Or49a-mCD8 :: GFP и подсчитывали количество НБА ORNs в дикого типа антенны. MCD8-GFP репортер клеточная мембрана локализованы и поэтому выражение показано на рисунке 2 имеет клеточной мембране OR49a ORNs выражая GFP. На рисунке 2 показано, выражение NBA ORNs с использованием анти GFP антитела и анти ELAV был использован в качестве пан-нейронной маркера. Среднее число НБА ORNs на антенны 20 (п = 8).
Рисунок 1: Общий обзор dissectioн процедура.
Рисунок 2: Проектирование конфокальной Z-серии с успешно расчлененного антенны. Чтобы обнаружить нейроны анти-ELAV антитела были использованы в качестве пан-нейронной маркера (А) и анти-GFP антитела для выявления специфическую экспрессию рецептора одоранта (B) и объединены картину, как показано в (С).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рассечение антенны Drosophila мы описываем является простым и легким для выполнения в лабораторных условиях. Чтобы обеспечить успешное вскрытие, важно использовать тонкой краями ножниц. В то время как иммунного окрашивания рассеченные антенну, важно, чтобы инкубировать их в влаги заполненный контейнер, чтобы избежать испарения раствора антител. Расчлененный антенна имеет тенденцию всплывать в растворе. Использование 0,1% Triton в PBS в течение фиксации и блокировки шаги будут способствовать погружение антенны в растворе и для обеспечения лучшей окрашивание. Использование "стеклянным дном культуры блюдо" может снизить потери антенн во иммуноокрашивания и обеспечить небольшое количество (90 мкл) раствора антител, используемых в каждом эксперименте.
Диверсификация нейронов-класс представляет собой центральный элемент нейрогенеза. Это физиологический процесс иллюстрируется в обонятельной системе, которая использует большой массив обонятельной нейрона рецептора (ORN)классы. Генерация широкого спектра ORNs с одоранта экспрессии рецептора и аксонов таргетинга имеет решающее значение для генерации нейронов разнообразие, необходимое для передачи информации от молекул запаха в высших центров головного мозга. Вся наша средства протокола иммуноокрашивание крепление антенны в углубления нашего понимания молекулярных механизмов, лежащих ORN диверсификации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано МПКСНТ программы, поддерживаемой для исследовательского Фонда стратегической в частных университетах и JSPS молодых ученых B гранта на HT Мы хотели бы поблагодарить Ohtake Норихито редактировать видеоклипы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , New York. 201-232 (2000).
- Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
- Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
- Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. , (2011).
- Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
- Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
- Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
- Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
- Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
