DNBS / TNBS kolit modeller: Ge Insights Into inflammatorisk tarmsjukdom och effekter av Dietary Fat

Summary

DNBS / TNBS inducerad kolit erbjuder ett alternativ och billig metod för att studera pathobiologyen av inflammatorisk tarmsjukdom. Protokollet diskuteras i detta dokument beskriver en framgångsrik tillämpning av DNBS att inducera kolit hos möss och råttor, och gör att man noggrant studera värdmedierad intestinal svar.

Abstract

Inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD), inklusive Crohns sjukdom och ulcerös kolit, har länge varit förknippad med en genetisk grund, och mera nyligen värd immunsvar mot mikrobiella och faktorer i miljön. Dinitrobensen sulfonsyra (DNBS)-inducerad kolit gör att man kan studera patogenesen för IBD tillhörande miljö-triggers som stress och kost, effekter av potentiella terapier, och mekanismerna bakom tarminflammation och mucosal skada. I denna skrift har vi undersökt effekterna av diet n-3 och n-6-fettsyror på colonic mucosal inflammatoriska svaret på DNBS-inducerad kolit hos råttor. Alla råttorna matades identiska dieter med undantag för olika typer av fettsyror [tistelolja (SO), rapsolja (CO) eller fiskolja (FO)] under tre veckor före exponering för intrarektal DNBS. Kontroll råttor som fick intrarektal etanol fortsatte upp i vikt under 5 dagars studie, medan, DNBS-behandlade råttor som matats fettdieter alla lost vikt med FO och CO matade råttor visar betydande viktminskning med 48 timmar och råttor som matats SO med 72 tim. Viktökning återupptas efter 72 timmar efter DNBS, och 5 dagar efter DNBS hade FO-gruppen en högre kroppsvikt än SO eller CO-grupper. Kolon sektioner samlas fem dagar efter DNBS-behandling visade fokal sår, crypt förstörelse, bägare cellbristen, och mucosal infiltration av både akuta och kroniska inflammatoriska celler som skilde sig i svårighetsgrad mellan dietgrupperna. Den så trött gruppen visade den allvarligaste skadan, följt av CO, och FO matade grupper som visade den mildaste graden av vävnadsskada. Likaså colonic myeloperoxidas (MPO)-aktivitet, en markör för neutrofil aktivitet var signifikant högre i den följd av CO matade råttor, med FO råttor matade med signifikant lägre MPO-aktivitet. Dessa resultat visar att användningen av DNBS-inducerad kolit, som beskrivs i detta protokoll, för att bedöma effekten av dieten i patogenesen för IBD.

Introduction

Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) kännetecknas av kronisk återkommande inflammationer i det gastrointestinala (GI) området, vilket resulterar i symtom på diarré, viktminskning, och buksmärtor. Ulcerös kolit (UC) och Crohns sjukdom (CD) är de två huvudsakliga formerna av IBD, och kan särskiljas genom platsen för inflammation i mag-tarmkanalen. I UC patienter, inflammationen innebär normalt ändtarmen och sträcker sig intill varandra upp i tjocktarmen för ett varierande utsträckning påverkar bara den ytliga slemhinnan. Däremot kan CD påverka någon del av mag-tarmkanalen, även om det främst drabbar ileum och blindtarmen. CD manifesterar ofta som transmural inflammation förknippas ofta med granulom och leder till stricturing (fibrostenotic) och / eller penetrerande (fistulizing) sjukdom. Även om etiologin av IBD är fortfarande instabil, är det väl accepterat att IBD är multifaktoriell, involverar interaktioner mellan värdarna immunsystem, genetisk känslighet och ansvarSES till miljö-och mikrobiella faktorer.

Hittills har olika modeller av IBD föreslagits att visa olika kliniska, histologiska och immunsvar som är karaktäristiska för UC och CD. De vanligaste modellerna omfattar genetiskt modifierade möss (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), infektion inducerade modeller (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), adoptiv överföringsmodeller (CD45 + RB Hög, CD62L + cellöverföring i SCID-möss) och kemiskt inducerad kolit modeller (Dextran natriumsulfat (DSS), trinitrobensensulfonsyra (TNBS), och dinitrobensen sulfonsyra (DNBS)). På grund av deras låga kostnader och snabbt insättande av sjukdom, är kemiska modeller anses ovärderlig för studier av olika aspekter av IBD. Var och en av de kemiska kolit modeller som anges har fördelar och begränsningar i vissa aspekter av deras kliniska, immunologiska och histopatologiska relevans för IBD. DSS är ett av de vanligaste kemiska metoder som används för att inducera colitis hos gnagare ^1. Administration av 3-10% DSS (MW: 42 kDa) i 7-10 dagar i dricksvattnet hos möss kan framkalla symtom och tecken på kolit inklusive viktminskning, diarré med blod, kolon förkortning, mucosal sår och neutrofil infiltration. Denna modell är speciellt användbart för drogscreeningstudier, samt utforska mekanismerna för epithelial förnyelse, effekterna av medfödd immunitet på slemhinnor homeostas, och rollen av inflammation i främjandet av intestinal dysplasi och adenocarcinom utveckling. Det finns dock vissa nackdelar med DSS-modellen, bland annat variationer i koncentrationen av DSS behövs för att framkalla kolit hos olika djuranläggningar, samt inkonsekvent vattenupptagning från möss och därmed inkonsekvent exponering för DSS, vilket resulterar i variationer i grad, omfattning och distribution av gastrointestinala skador och sår i kolon. Alla dessa funktioner leder till heterogenitet resultat och begränsar möjligheten att jämföra resultat mellan studier frOM olika forskargrupper.

Ett alternativ till DSS-modellen är den hapten-inducerade DNBS eller TNBS modeller av kolit. Denna modell använder rektal instillation av slemhinnor sensibiliserande ämnen DNBS eller TNBS, utspädda i varierande koncentrationer av etanol. Administreringen av etanol är en förutsättning för att bryta den colonic mucosal barriären för att medge penetrering av DNBS eller TNBS i lamina propria. DNBS / TNBS kommer sedan haptenize de lokaliserade kolon och tarmmikrobiella proteiner för att bli immunogena, vilket orsakade den värd medfödda och adaptiva immunsvar. I allmänhet är denna modell i samband med allvarlig och ibland blodig diarré, viktminskning och tarmvägg förtjockning men symptomen varierar beroende på vilken typ av gnagare som används, liksom tidpunkten, dosen och graden av exponering för DNBS eller TNBS används i studien. Viktiga skillnader mellan råttor och möss bör noteras, med fördelarna av lägre kostnader för inköp och styrelse, samt lower kroppsmassa för att minska per-djur kostnader för behandling in vivo. Detta skall ställas mot den mer plötslig och svår kurs av kolit i möss, där de mer ömtåliga och lyhörda djur snabbt kan nå en human slutpunkt.

Den tarminflammation leder initialt ur etanol-inducerad skada på tarmepitelceller, vilket leder till ökad epitelial permeabilitet, mikrobiell penetration in i slemhinnan, haptenization av värdproteiner, allt detta resulterar i infiltrering av neutrofiler, makrofager och Th1-T-lymfocyter in i den skadade slemhinnan. I jämförelse med DNBS är TNBS betraktas som en farlig kemikalie på grund av sin mycket oxidativa egenskaper som kan utgöra en risk för explosion vid kontakt med baser såsom natrium-och kaliumhydroxid. Därför DNBS för närvarande betraktas som en föredras av kemikalier över TNBS att framkalla kolit. Hos gnagare är DNBS kolit anses som en av de mest praktiska metoder för att studera fölvinge IBD associerade modifierare av sjukdom:

1. Depression och reaktivering av kolit: Det har visat att stress, ångest och depression i IBD-patienter är ofta förknippade med sjukdomen återfall. DNBS kolit är en lämplig modell för att studera rollen av depression och dess konsekvenser på reaktivering av kolit i möss. Metoden innebär normalt initial induktion av kolit av DNBS, följt av upplösning av kolit genom att lämna möss i 6-8 veckor. Mössen administreras sedan med depression som orsakar medel såsom reserpin eller lukt bulbectomy att framkalla depression följt av att testa dem för reaktivering av kolit genom utmaning med en subcolitic dos DNBS ^2.
2. Stress och reaktivering av kolit: Stress är en annan gemensam miljöfaktor som har kopplats till IBD patogenes. Det finns en växande mängd bevis som tyder på ett starkt samband mellan kronisk stress och uppkomsten av symtom på UC och CD i gnagares liksom hos människor och icke-mänskliga primater ^3. DNBS kolit är en bra modell för att studera stress associerad reaktivering av kolit hos både möss och råttor. Metoden användes vanligen på ett liknande sätt som nämnts ovan för depression utom i stället för fördjupningen djuren utsätts för stressfaktorer såsom sonisk och återhållsamhet stressen ^4.
3. Neurogen inflammation: Ett antal studier har beskrivit antingen övergående eller permanenta förändringar i det enteriska nervsystemet (ENS) struktur och funktion, vilket kan ses i vävnadsprover från djurmodeller och från patienter med IBD. DNBS är en bra modell för att undersöka effekterna av inflammation på ENS ⁵ och studera både noradrenerga och kolinerga nervbanor ^6.
4. Skada-reparationsmekanismer: Under IBD patogenes, värd-härledda skade mediatorer som reaktiva syreradikaler (ROS), kväveoxid (NO), intercellulär adhesionsmolekyl 3 (ICAM-3) och P-selektin har alla visat sig plägga en roll i intestinal epithelial störningar. DNBS är en utmärkt modell för att studera skador orsakade av uppreglering av dessa mediatorer samt reparationsmekanismer som regleras med hjälp av selektiva läkemedel eller hämmare ^7,8.
5. Transmural inflammation: Förutom de ovan nämnda tillämpningar av DNBS, modellen kan också användas för att studera transmural inflammation i tarmen, en klassisk funktion hos patienter med CD. Både DNBS och TNBS-inducerad kolit är förknippade med betydande infiltration av lymfocyter, in kolonmukosa gör dessa modeller särskilt användbart för att studera T-cellsberoende immunmekanismer.

Jämfört med DSS-modellen, fördelarna med DNBS och TNBS-inducerade kolit innefattar låg kostnad, snabb utveckling av kolit (kräver vanligtvis 1-3 dagar att visa reproducerbar sår och inflammation) och konsekvent lokaliserad skada på distala kolon. Men nackdelarna är ett krav på enhögre teknisk kompetens, optimering av DNBS / TNBS dos, och behovet av anestesi för rektal administrering.

I detta metod papper studerade vi effekterna av olika koncentrationer av n-6 och n-3 fleromättade fettsyror på att förändra kolon mukosalt svar på DNBS-inducerad kolit hos råttor genom att använda vegetabiliska oljor safflorolja (SO) och rapsolja (CO) , och fiskolja (FO). Det har visat sig att n-6 och n-3-fettsyror är viktiga mediatorer av intestinala inflammatoriska sjukdomar genom deras roll som acylenheter av cellmembran phosopholipids ^9. I motsats till den proinflammatoriska potentialen av n-6-fettsyror, n-3-fettsyror vid tillräckligt höga intag är potentiellt potenta anti-inflammatoriska medel. De antiinflammatoriska åtgärder av n-3-fettsyror förmedlas direkt genom ersättning av arakidonsyra som eikosanoid substrat, hämma arakidonsyrametabolism och indirekt genom förändring av proinflammatory genuttryck och cellsignalering. De n-3-fettsyror ger också upphov till resol, en familj av anti-inflammatoriska mediatorer. Högt intag av n-3-fettsyror är associerad med en minskning i produktionen av proinflammatoriska eikosanoider, cytokiner, kemokiner, reaktiva syretyper och uttryck av vidhäftningsmolekyler. I denna studie gavs råttor matades ad libitum dieter identiska i samtliga näringsämnen förutom fettsyror, med, som en procent energi från fett, 20% SO, 20% CO, eller 18% fiskolja plus 2% safflorolja (FO) ^10-11 . I procent av det dagliga energi, SO kost förutsatt 15% linolsyra (LA), med <0,06% α-linolensyra (ALA) och ingen eikosapentaensyra (EPA) och dokosahexaensyra (DHA), hade CO kost 4.2 % LA och 1,9% ALA utan EPA och DHA, och FO dieten förutsatt 1,4% EPA, 4,9% DHA, 0,32% LA, och 0,12% ALA. Tre veckor efter initiering av fettdieter, mössen administrerades intrarektala DNBS eller 50% etanol och avlivades 5 dagar senare. Den inflammatory respons utvärderades genom bedömning av viktminskning, histologiska skador poäng och vävnads myeloperoxidasaktivitet.

Protocol

Rutiner som involverar djurförsök följer riktlinjer djurskötsel beskrivs av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of British Columbia.

Rutiner som nämns i detta protokoll kommer att beskrivas för både råttor och möss, medan de representativa resultaten kommer att presenteras från Sprague-Dawley.

1. Beredning av DNBS och intrarektal administrering

1. För rektal instillation av DNBS hos råttor, nyligen förbereda 15-30 mg DNBS/250 pl av 50% etanol. För möss, förbereda 2-6 mg DNBS/100 pl av 50% etanol. Notera: Optimera exakt DNBS koncentrationen som ska administreras vid varje anläggning. Sprague-Dawley-råttor och C57BL / 6 möss föredras för induktion av DNBS kolit, kan emellertid andra mus-och råttstammar användas. Möss och råttor som behandlats enbart med 50% etanol kan användas som kontrollgrupper ges dock effekterna av etanol är milda eller frånvarande, man kan omit införandet av denna grupp för en studie ^12.
2. Fäst en 1 ml spruta med en 19 G nål som har en polyetenkateter (PE-90 - råttor eller PE-50 - möss) fäst vid dess slut.
3. Lätt söva råtta eller mus som vilar på en värmedyna (t.ex. genom administrering av 1,5% isofluran via noskonen bör djuren fortfarande har blink-och sväljreflexer och uppvisar regelbunden andning). Applicera riva gel till sina ögon för att undvika att ögonen torkar ut.
4. Tryck försiktigt med fingertopparna på den bakre änden av djuret att avlägsna varje pall som kan vara närvarande i den distala kolon.
5. Försiktigt in katetern intrarektalt, med katetern når ca 8 cm proximalt till anus för råttor, eller 3-4 cm för möss. Injicera en liten mängd av lösningen under införing av katetern för att smörja, vilket möjliggör lättare införing. Anm: Om något motstånd känns när du sätter katetern, inte fortsätta att sätta in eftersom detta kan leda till perforering avtarmväggen. Ta bort katetern och försök att försiktigt sätta tillbaka, återigen smörja tjocktarmen som fortsätter.
6. Injicera långsamt 250 (råtta) eller 100 (mus) il DNBS, eller en lika stor volym eller 50% etanol för kontroller. När du har injicerat DNBS, placera djurhuvud-ner under 90 sekunder för att undvika förlust av DNBS.
7. Efter DNBS administration, mata djuren 8% sackaros vatten i 0,2% saltlösning för att förhindra uttorkning under den första veckan.
8. Noggrant observera djuren, med daglig övervakning för viktminskning och tecken på uttorkning eller ångest under hela experimentet. OBS: Viktnedgång kan snabbt närmar sig CCAC rekommendationer vikt högsta tillåtna förlust. Eftersom detta främst härrör från uttorkning, bör viktminskning användas som en indikator för att administrera lakterad Ringers lösning för att begränsa uttorkning. Se till att rådgöra med anläggningen veterinären om hälsofrågor som är lämpligt.

2. Collecting Vävnader och bedöma Histologisk Skador i DNBS Utmanad Möss

1. Vid önskad tidpunkt efter provokation med DNBS, avliva djuren genom att överdosera med isofluran i en anestesikammare med tillsats av tillräcklig mängd syre. Observera djuret tills ingen stigande eller fallande i bröstet ses och det finns ingen påtaglig hjärtslag. Bekräfta djuret är korrekt avlivas genom frånvaron av ett svar på tå nypa eller beröring av hornhinnan, följt av halsdislokation.
2. Öppna bukhålan och avlägsna hela tjocktarmen. Öppna tarmen längdled; makroskopiska mukosala sår bör observeras ungefär 5-6 cm proximalt från den distala änden av tjocktarmen hos råttor (2-3 cm i möss). Obs: När du tar bort tjocktarmen, bedöma makroskopiska skador poäng om så önskas. Samla segment av kolon från motsvarande anatomisk plats från kontrolldjur. Anm: De individer scoring vävnaden för makroskopiska skador poängen börförblindas till identiteten av behandlingsgrupperna. Betyg vävnadssnitt med hjälp av följande eller liknande kriterier: hur allvarlig och omfattande sårbildning (0-10), summerade med poängen för frånvaron eller närvaron av diarré (0 eller 1), sammanväxningar (0, 1 eller 2) och maximal kolon väggtjocklek i millimeter ^11.
3. Samla 0,5 cm sektioner proximalt platsen för maximal makroskopisk skada. Snap frysa ett avsnitt 0,5 cm i flytande kväve för att senare bedöma myeloperoxidas (MPO)-aktivitet (ett mått på neutrofil infiltration), och placera den andra sektionen i 10% neutral buffrad formalin för histologisk analys. Anm: snabbfrystes vävnader för myeloperoxidas-analys kan lagras vid -80 ° C i upp till en månad.
4. Tillåt vävnader uppsamlade för histologisk analys i steg 2,3 för att fixa i formalin över natt, och tvätta sedan med 70% etanol. Bädda in vävnader i paraffin och skärs till önskad tjocklek (3-5 um), fläcken med hemotoxylin och eosin (HE) för histologisk scoring. Har två observatörer poäng minst tre vävnadssnitt från varje djur under ett ljusmikroskop för att bestämma de histologiska skador poängen för varje grupp. Anm: De individer scoring vävnaden för histologiska skador poängen ska förblindas till identiteten av behandlingsgrupperna. Betyg vävnadssnitt med hjälp av följande eller liknande kriterier: omfattning av inflammatorisk cell infiltrat (0 = frånvarande, 3 = transmural), förlust av mucosal arkitektur (0 = frånvarande, 3 = svår), närvaro eller frånvaro av crypt abscesser (0-1) , och bägare cellbristen (0-3). Bestäm histologiska skador poäng som summan av dessa poäng ^11.

3. Utföra Myeloperoxidas (MPO)-analys DNBS Utmanad Intestinal Tissue

1. Analys MPO aktivitet i 0,5 cm kolon klyftor som erhållits i steg 2.3. Homogenisera vävnad i MPO homogeniseringsbuffert (0,5% hexadecyltrimethyl-ammoniumbromid i 50 mM kaliumfosfatbuffert (pH 6,0)) för att ge en 50 mg kolon segment / ml homogeniseringsbuffert fjädring.
2. Alikvotera den homogeniserade lösningen till 1 ml portioner och centrifugera vid 4 ° C under 2 min vid 10000 x g..
3. Blanda 100 pl av varje alikvot med 2,9 ml av 50 mM fosfatbuffert (pH 6,0) innehållande 0,167 mg / ml av o-dianisidinedihydrochloride och 0,0005% väteperoxid i en kyvett.
4. Mät hastigheten av absorbansen med användning av en spektrofotometer vid 460 nm. Anm: MPO-aktivitet definieras som den mängd enzym som bryter ned en imol / min _{H2O 2} till _H2O vid rumstemperatur, och är uttryckt i enheter per mg vävnad.

Representative Results

Utmaning av råttor (Sprague-Dawley) eller möss (C57BL / 6) med DNBS resulterar normalt i övergående viktminskning och diarré, ibland med blod i avföringen. Däremot kan faktorer såsom genetik, kost och tarmfloran ändrar känsligheten för DNBS inducerad kolit. Därför djur som ingår i försöken bör vara från samma institution, antingen härledas lokalt eller beställas från ett djur leverantör. Alla djur bör övervakas noggrant för graden av viktminskning och symtom på ångest lidit under kolit.

De resultat som presenteras i figurerna 1-4 representerar ett experiment där effekten av tre kost oljor: safflorolja, rapsolja och fiskolja på den resulterande svårighetsgrad DNBS kolit bedömdes. Statistiska skillnader mellan grupperna bestämdes med användning av ANOVA följt av post hoc Tukey test, med användning av en dataanalys programvara. AP-värde på <0,05 var consibeställas betydande.

Efter intrarektal utmaning med DNBS (20 mg DNBS/250 xl av 50% etanol), var signifikant viktminskning observerades av 48-tim hos råttor som kompletterats med FO och CO och efter 72 h i råttor som kompletterats med SO (P <0,05). Maximal viktminskning ses på 48 timmar i råttor kompletterat med FO och med 72 timmar i råttor kompletterat med CO och SO. Viktökning återupptas efter 72 timmar, och efter 5 dagar efter DNBS, FO och SO grupper visar kroppsvikt liknande utgångsvärden. Kontroll råttor kompletteras med kost och utmanade med intrarektal etanol fortsätter att gå upp i vikt under 5 dagars studieperioden.

Tarm skador orsakade av DNBS kan vara utbrett, men området för maximal skada i allmänhet lokaliserad till de distala 6 cm i tjocktarmen hos råttor, och de distala 3 cm i möss. Makroskopiskt kan detta ses som kolon vägg förtjockning, mucosal sår, och tillfällig vidhäftning av distal kolon till angränsande organ, såsom urinblåsan. Vid närmare histologisk utvärdering, omfattande epitelial skada, i vissa områden som leder till bildandet av sår, immuncellinfiltration (främst neutrofiler och lymfocyter), cryptitis, slem utarmning, och ödem observeras. Även om dessa histologiska tecken på inflammation och vävnadsskada är uppenbara i alla tre kostolje kompletteras grupper på utmaning med DNBS, är den allvarligaste skada ses i oljegruppen safflor, följt av oljegruppen canola, medan råttorna i fiskoljegruppen demonstrera minimal epitelial skada och begränsad infiltrering av inflammatoriska celler i slemhinnan (Figur 2).

Skillnader i histologiska skador kan kvantifieras för att möjliggöra en bättre jämförelse mellan grupper. Kriterier för att bedöma histologiska skador ingår omfattningen av inflammatorisk cell infiltrat, förlust av mucosal arkitektur, bägare cellbristen, och närvaron av kryptot bölder. I fig 3 är de histologiska skador poäng för de tre kostoljegrupperna under DNBS kolit. Såsom framgår av de H & E färgade snitt i figur 2, har safflorolja kompletterad grupp den största omfattningen av skador, följt av oljegruppen canola, medan fiskoljegruppen visar den minsta mängden av skada.

Omfattningen av inflammatorisk cell infiltrat, särskilt av neutrofiler, kan undersökas ytterligare genom att utföra en myeloperoxidas (MPO) aktivitetsanalys. MPO anses vara en markör av inflammation, eftersom det är ett enzym som finns i granulerna av neutrofila granulocyter och andra celler av myeloid härkomst. Bedömning av MPO-aktivitet i råtta kolon på dag 5 efter DNBS exponering avslöjar en ökad aktivitet i alla tre grupperna (Figur 4). Den största MPO-aktivitet observeras i oljegruppen safflor, följt av oljegruppen canola, medan den lägsta MPO-aktivitet ses ifiskolja grupp, motsvarande de histologiska skador poängen bedömts i figur 3.

Figur 1. Förändringar i kroppsvikt (% av utgångsvärdet) efter intrarektal administration av 50% etanol (kontroll) eller dinitrobensen sulfonsyra (DNBS) hos vuxna Sprague-Dawley (250-500 g) matas SO, CO, eller FO. Råttorna övervakas sedan för förlust av kroppsvikt från dag 1 till dag 5 efter behandling. Den procentuella förlusten av kroppsvikt är avsatt mot dagar efter DNBS behandling. Värdena är medelvärden ± SEM, n = 5 / grupp. Jämfört med icke-DNBS behandlade motsvarigheter, råttor som matats med CO och FO hade en betydande minskning av deras initiala kroppsvikt så tidigt som dag 1 inlägg DNBS behandling medan dag 3 alla tre grupperna av råttor hade betydande viktminskning i förhållande till baseline vikt (P <0,01). Alla kolit grupper visar viktökning efter 72 timmar, med vikt återvänder till utgångsvärdet i FO och så matade grupper. Råttor i etanolkontrollgrupper visar viktökning under 5 dagars studieperioden. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Histologiskt utseende hos representativa H & E färgade snitt kolon vävnad fem dagar efter intrarektal tillförsel av 50%-ig etanol (CTL) eller DNBS till vuxna honråttor matas SO, CO, eller FO. Vävnaden samlas upp i 10% formalin och fick fixera under minst av 24 h, följt av vävnadssnittning och HE-färgning. Denvävnadssnitt från råttor som utfodras SO och CO visar betydande störningar av epitelial integritet med varierande grad av epitelial skada, krypta hoppar, sårbildning och transmural immun cellinfiltration, med mer markanta förändringar som ses med SO. I CO matade möss, är bevis på epitelial förnyelse och restitution sett. Däremot råttor matades FO underhålls epitelial integritet och hade begränsad infiltration av inflammatoriska celler begränsas till lamina propria. (M-slemhinna, SM-sub-slemhinnan och U-sår, original förstoring 100X, skala bar: 100 nm). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Histologisk skada värdering av kolon vävnader 5 dagar ifter intrarektal administration av 50% etanol (klar bar) eller DNBS (fylld stapel) till vuxna honråttor matas SO, CO, eller FO. Vävnadssnitt görs av en erfaren utredare, blinda för de behandlingar, med hjälp av en uppsättning kriterier baserade på histologiska skador. De kriterier som används för denna studie ingår: inflammatorisk cellinfiltration (0 = frånvarande, 3 = transmural), förlust av mucosal integritet (0 = frånvarande, 3 = svår), crypt abscessbildning (0 = frånvarande, 1 = närvarande) bägare cellbristen (0 = frånvarande, 3 = hög). Den histologiska skador värdering bestäms som en summa av poäng som erhålls genom att göra poäng ett minimum av tre vävnadssnitt från varje djur. Resultaten visar tydligt en reducerad histologisk skada i FO matade råttor jämfört med SO och CO matade råttor. Värdena är medelvärden ± SEM, n = 5 / grupp. Jämfört med respektive kontroller etanol, är DNBS administration förknippad med en betydande ökning av skador poäng (P <0,05), kolit grupper med olika symboler signifikant skilda (P <;. 0,01) Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. MPO-aktivitet i kolonvävnad 5 dagar efter intrarektal tillförsel av 50%-ig etanol (klar bar) eller DNBS (fylld stapel) till vuxna honråttor utfodrats SO, CO, eller FO. Inflammerade colonic vävnader snabbfrystes i flytande kväve och analyserades för myeloperoxidasaktivitet , som ett index på granulocyt infiltration. Colitic råttor matades FO show minskade MPO aktivitet jämfört med SO och CO Värdena är medel ± SEM, n = 5 / grupp. Jämfört med respektive kontroller etanol, är DNBS administration förknippad med en betydande ökning av MPO-aktivitet (P <0,001), kolit grupper med olika symboler significantly olika (P <0,05). Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Den DNBS modell beskrivs i detta protokoll är en värdefull, billigt och reproducerbar kolit-modell som kan användas för att studera olika aspekter av IBD. Vid administrering intrarektalt till råttor eller möss, DNBS inducerar en väsentlig grad av inflammation och vävnadsskada i tjocktarmen, som liknar människans Crohns sjukdom i termer av dess olika histologiska funktioner inklusive transmural infiltration av polymorfonukleära celler och dominerande NF-kB-beroende Th1 aktivering.

Denna modell har använts för att studera olika faktorer tros påverka IBD som stress, depression, och kost, och enteriska nervsystemet engagemang, skada-reparationsmekanismer, transmural inflammation, och prekliniska terapier. Den DNBS modellen är också ett lämpligt alternativ till TNBS-inducerad inflammation hos möss och råttor och erbjuder ett billigare alternativ till andra vanligen använda kemiska modeller av kolit såsom DSS. De steg som beskrivs i den här protocol kommer att tillåta en att framgångsrikt genomföra denna modell.

Konsekvent med andra experimentella modeller av kolit ^13-16, stärker den aktuella studien de variabla effekter av fett på tarmslemhinnans immunsvar, där högt intag av EPA och DHA konsumeras före och efter DNBS exponering dämpar, medan högt intag av ARA med minimal n -3 fettsyror förvärrar kolit. De positiva effekterna av kost n-3-fettsyror som observerades i denna studie är beror delvis på n-3-fettsyror effektivt lägre vävnads fosfolipid ARA både genom att hämma syntes av ARA från LA och genom att ersätta ARA med EPA och DHA. Denna förändring förskjuter fettsyrasubstrat för frigivning och efterföljande eikosanoid syntes mot en mindre proinflammatoriska miljö. Däremot är det höga intaget av n-6-fettsyror i samband med en hög kolon ARA med efterföljande syntes av proinflammatoriska mediatorer som förvärrar slemhinnor immunsvar. I keeping med vår senaste studie i Citrobacter rodentium inducerad kolit, råttor matade rapsolja med mindre ARA än safflorolja, men med n-3 ALA och ingen EPA eller DHA hade en mellan inflammatoriskt svar ^16.

Det finns flera viktiga steg som kan påverka det framgångsrika genomförandet av DNBS modellen. Olika studier har använt olika koncentrationer av DNBS sträcker sig 3-6 mg / mus eller 15-30 mg / råtta att etablera kolit. Därför är det viktigt för de enskilda utredarna att optimera doseringen av DNBS för sina studier, eftersom optimala doser kan variera från en djuranläggning till den andra. Det är också viktigt att notera att koncentrationen av DNBS kommer att variera beroende på typ och arter av djur som en utredare använder (Ex: vissa stammar kan vara mer mottagliga och andra mer resistenta mot DNBS). Försiktighet bör vidtas för att se till att koncentrationen av DNBS inte är för hög eftersom det kan leda till en snabb död av djur resulting från tarmperforation och sepsis. Ett annat viktigt steg för att använda denna modell är att utveckla en lämplig metod för intrarektal kateter sätts in i distala colon av djuret. Närvaron av avföring i tjocktarmen kan förhindra tillräcklig införing av katetern under instillation. För att undvika detta, tryck försiktigt på den bakre änden av anus av lätt sövda möss att ta bort någon avföring i distala colon / rektum. Det rekommenderas att föra in katetern ca 3-4 cm från anus, även om den kan förlängas till max 6-8 cm i råttor till mjälten fotled (en skarp krök mellan tvärgående och fallande kolon) ^7. Det är viktigt att notera att under instillationsförfarandet, smörj katetern genom insprutning DNBS / etanol i små volymer möjliggör lättare införing av katetern. För att undvika den retrograda återflöde av DNBS ut ur anus, är det viktigt att hålla djuren i en head-down position till 90 sek eller alternativt,möss kan förvaras under 15 min i Trendelenburgläge (ryggläge där fötterna är placerade högre än huvudet av 15 till 30 °).

Vävnader kan samlas in vid utvalda tidpunkter beroende på de intressen som utredare och huruvida studien fokuserar på akut eller kronisk inflammation. Dessutom kan vävnaderna också användas för att studera de intestinala ENS och medfödda och adaptiva immunsystemet. Det är dock viktigt att se till att vävnader ordentligt provtas. Det rekommenderas att samla vävnaderna i en riklig mängd av 10% formalin i en 5 ml injektionsflaskor i motsats till mindre volymer flaskor för att säkerställa korrekt fixering. Lämplig fixering av prov är en nyckel för att studera både den histopatologiska skadan och visualisering av målmolekyler i vävnader genom H & E och immunofärgning, respektive. Histologisk poängsättning av vävnader bör utföras av erfarna personer som är blinda för de experimentella förhållanden, med hjälp av fastställda kriterier som than enskild utredare ^11,17. Myeloperoxidas (MPO) fungerar som en bra markör för inflammation, vävnadsskada och neutrofil infiltration i mag vävnader ^11. För att utföra MPO analyser, föreslås att knäppa frysa vävnaderna i flytande kväve och på dagen för analysen, rekommenderas att arbeta med nylagade buffertar och lösningar för att få de bästa och mest korrekta resultat. Denna modell kan också användas för att studera inflammatoriska celler som infiltrerar tarmen, de mekanismer som är inblandade i kemotaxi och transmigration av inflammatoriska celler och de olika banorna som är involverade i aktivering och frisättning av andra proinflammatoriska involverade i vävnadsskada mediatorer samt mediatorer är involverade vid modulering det inflammatoriska svaret och i vävnad reparera.

De kliniska nackdelar närvarande ses med hjälp av immunosuppressiva läkemedel eller rikta en proinflammatoriska cytokiner såsom TNF-α bör uppmuntra Investigtörer för att utveckla bättre behandlingsstrategier för att hantera patienter med IBD. Modeller, till exempel DNBS modellen, låter utredare för att öka vår förståelse för patogenesen vid IBD, potentiellt identifiera nya terapeutiska mål och utveckla / förbättra strategier för att kontrollera inflammation med hjälp av nya inflammatoriska vägar och nya terapier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD Biosciences	309659
19 G Needle	BD Biosciences	305187
Polyethylene tubing PE-50	BD Biosciences	427517	for intrarectal administration in mice
Polyethylene tubing PE-90	BD Biosciences	427519	for intrarectal administration in rat
DNBS	MP Bio	150959
Tear gel	Novartis	63601662596
10% Formalin	Fisher	5F93-4
Warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510
Ethanol	Fisher	A-962.4
Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide	Sigma-Aldrich	H5882
Potassium phosphate buffer solution	Sigma-Aldrich	79628-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	D3252
30% H2O2	Sigma-Aldrich	31642	hydrogen peroxide
Spectrophotometer	BioRad	Benchmarker Plus
Light Microscope	Zeiss	Axio Image.Z1
Data analysis software program	GraphPad Software	GraphPad Prism Software Version 4.00	www.graphpad.com