Summary
קוליטיס המושרה DNBS / TNBS מציע אלטרנטיבה ושיטה זולה ללמוד pathobiology של מחלות מעי דלקתיות. הפרוטוקול שנדון במאמר זה מתאר את היישום המוצלח של DNBS כדי לגרום לדלקת מעי גסה בעכברים וחולדות ומאפשר לאדם ללמוד ביסודיות את תגובות מעיים בתיווך מארחת.
Abstract
מחלות מעי דלקתיות (IBD), כוללים מחלת קרוהן וקוליטיס כיבית, כבר מזמן מזוהות עם בסיס גנטי, ולאחרונה לארח את תגובה חיסונית לסוכני חיידקים וסביבתיים. קוליטיס Dinitrobenzene חומצת sulfonic (DNBS) מושרה מאפשר אחד כדי ללמוד את הפתוגנזה של גורמים סביבתיים הקשורים IBD כגון מתח ודיאטה, את ההשפעות של טיפולים פוטנציאליים, ואת מנגנוני פציעת דלקת ברירית מעי בסיסית. במאמר זה, אנחנו בדקנו את ההשפעות של חומצות n-3 ו-n-6 חומצות שומן תזונתיות בתגובה הדלקתית ברירית המעי הגס לקוליטיס-Induced DNBS בחולדות. כל החולדות קבלו תזונה זהה למעט סוגים שונים של חומצות שומן מ[ שמן חריע (SO), שמן קנולה (CO), או שמן דגים (FO)] במשך שלושה שבועות לפני החשיפה לintrarectal DNBS. חולדות בקרה נתון אתנול intrarectal המשיכו לעלות במשקל על המחקר של 5 ימים, ואילו, חולדות שטופלו DNBS דיאטות שומנים האכילו את כל losמשקל לא עם חולדות FO וCO הפד הוכחת ירידה משמעותית במשקל על ידי 48 שעות וחולדות שהוזנו זאת על ידי 72 שעה. עלייה במשקל התחדשה לאחר 72 ההודעה hr DNBS, ועל ידי 5 הודעה ימי DNBS, קבוצת FO הייתה משקל גוף גבוה מכך או קבוצות CO. סעיפים במעי הגס שנאספו 5 ימים לאחר DNBS הטיפול הראה כיב מוקד, הרס קריפטה, דלדול תא גביע, וחדירה רירית של שני תאים דלקתיים חריפים וכרוניים, שהשוני בחומרה בין קבוצות דיאטה. הקבוצה כל כך שיגע הראתה נזק החמור ביותר ואחריו CO, וFO האכיל קבוצות שהראו את המידה המתונה ביותר של פגיעה ברקמות. כמו כן, פעילות myeloperoxidase הגס (MPO), סמן של פעילות נויטרופילים היה גבוהה באופן משמעותי בכל כך אחרי חולדות CO הפד, עם חולדות שהוזנו FO שיש פעילות MPO נמוכה באופן משמעותי. תוצאות אלו מראות את השימוש של קוליטיס-Induced DNBS, כפי שתואר בפרוטוקול זה, על מנת לקבוע את ההשפעה של תזונה בפתוגנזה של מחלת מעי דלקתי.
Introduction
מחלות מעי דלקתיות (IBD) מאופיינת בדלקת כרונית התקפי בדרכי העיכול (GI), וכתוצאה מכך תסמינים של שלשולים, ירידה במשקל, וכאבי בטן. קוליטיס כיבית (UC) ומחלת קרוהן (CD) הם שתי הצורות העיקריות של מחלת מעי דלקתי, ויכול להיות מכובד על ידי המיקום של הדלקת בתוך מערכת העיכול. בחולי UC, הדלקת כרוכה בדרך כלל פי הטבעת והוא משתרע בסמיכות את המעי הגס הלמשפיעה על הרירית השטחית רק מידה משתנה. לעומת זאת, CD יכול להשפיע על כל חלק של מערכת העיכול, למרות שזה בעיקר משפיע על המעי וcecum. תקליטור לעתים קרובות בא לידי ביטוי כדלקת transmural קשור לעתים קרובות עם גרנולומות ומובילה לstricturing (fibrostenotic) ו / או חדירת מחלה (fistulizing). למרות אטיולוגיה של IBD נותרת חמקמקה, מקובל גם כי IBD תלוי בכמה גורמים, הכולל אינטראקציות בין המארחים מערכת חיסונית, רגישות גנטית וresponses לגורמים סביבתיים וחיידקים.
עד כה, מודלים שונים של IBD הוצעו שמציגים תגובות קליניות, היסטולוגית וחיסוניות שונות אופייניות לUC ו-CD. הדגמים הנפוצים ביותר כוללים עכברים מהונדסים גנטי (IL-2, IL-10 SAMP / yit,) מודלים מושרה, זיהום (rodentium Citrobacter, typhimurium סלמונלה), מודלים העברת מאמצת (CD45 + RB גבוה, העברה לתא CD62L + לעכברים SCID) ו מודלים קוליטיס כימי שגרמו (Dextran נתרן סולפט (DSS), חומצת sulfonic Trinitrobenzene (TNBS), וחומצת sulfonic Dinitrobenzene (DNBS)). בשל העלות הנמוכה שלהם והתפרצות מהירה של מחלה, מודלים כימיים נחשבים לא יסולא בפז לחקר היבטים השונים של מחלת מעי דלקתי. לכל אחד מדגמי קוליטיס הכימיים המפורטים יתרונות כמו גם מגבלות בהיבטים מסוימים של הרלוונטיות הקלינית, חיסונית וhistopathological למחלת המעי דלקתית. DSS הוא אחת מהשיטות כימיות הנפוצות ביותר המועסקות כדי לגרום coliTIS במכרסמים 1. מנהל של 3-10 DSS% (MW: 42 KDA) ל7-10 ימים במי השתייה של עכברים יכול לגרום לסימפטומים וסימנים של דלקת המעי הגס, כולל ירידה במשקל, שלשולים עם דם, קיצור מעי הגס, כיבים ברירית וחדירת נויטרופילים. מודל זה שימושי במיוחד עבור מחקרי הקרנת סמים, כמו גם לבחון את מנגנוני התחדשות אפיתל, את ההשפעה של חסינות מולדת על הומאוסטזיס הרירי, ואת התפקיד של דלקת בקידום דיספלזיה במעי והתפתחות אדנוקרצינומה. יש עם זאת כמה חסרונות למודל DSS, כולל וריאציה בריכוז של DSS הדרוש כדי לגרום לקוליטיס במתקנים שונים של בעלי חיים, כמו גם ספיגת מים עולים בקנה אחד על ידי עכברים וחשיפה ובכך עולה בקנה אחד לDSS, וכתוצאה מכך הווריאציה בתואר, במידה ו הפצה של פגיעה ברירית וכיבים במעי הגס. כל התכונות הללו יובילו לההטרוגניות של תוצאות ולהגביל את היכולת להשוות את התוצאות על פני fr לימודיםקבוצות מחקר שונות אום.
אלטרנטיבה למודל DSS היא DNBS-Induced hapten או המודלים TNBS של קוליטיס. מודל זה מעסיק החדרה רקטלית של רירית רגישות DNBS סוכנים או TNBS, בדילול מלא בריכוזים שונים של אתנול. הממשל של אתנול הוא תנאי הכרחי כדי לשבור את מחסום רירית המעי כדי לאפשר חדירה של DNBS או TNBS לpropria lamina. אז DNBS / TNBS יהיה haptenize חלבונים במעי הגס וחיידקי מעיים המקומיים להפוך immunogenic, ובכך מפעילה את המארח מולדים ואת התגובה חיסונית אדפטיבית. באופן כללי, מודל זה קשור לשלשולים חריפים ולעתים עקובים מדם, ירידה במשקל ועיבוי קיר מעיים עם זאת סימפטומים משתנים בהתאם לסוג של מכרסם בשימוש, כמו גם העיתוי, מינון ומידת חשיפה לDNBS או TNBS משמש ב מחקר. הבחנות חשובות בין חולדות ועכברים יש לציין, עם היתרונות של עלות נמוכה יותר לרכישה ולוח, כמו גם לואוr מסת גוף להפחתת עלויות לכל בעלי חיים של טיפול בגוף חי. זה צריך להיות מוגדר נגד כמובן יותר מהיר וחמור של קוליטיס בעכברים, שבו החיות יותר שבירות ותגובה עשויות להגיע לנקודת סיום הומנית במהירות.
דלקת המעיים בתחילה כתוצאה מנזק הנגרם על אתנול לתאי האפיתל במעי, שמוביל לחדירות מוגברת אפיתל, חדירה של חיידקים לרירית, haptenization של חלבוני מארח, כל זה וכתוצאה מכך ההסתננות של נויטרופילים, מקרופאגים ולימפוציטים Th1 T לתוך הרירית הפגועה. בהשוואה לDNBS, TNBS נחשב כימי מסוכן בשל מאפייני חמצוני ביותר שלה, שיכול להוות סיכון לפיצוץ במגע עם בסיסים כגון נתרן ואשלגן הידרוקסידי. לכן DNBS נחשב כיום כבחירה מועדפת של חומר כימי על TNBS לגרום לדלקת מעי גס. במכרסמים, קוליטיס DNBS נחשב כאחת השיטות הנוחה ביותר ללמוד folloIBD הכנף קשור מכפילי של מחלה:
- דיכאון והפעלה מחדש של קוליטיס: הוכח כי לחץ, חרדה ודיכאון בחולי IBD לעתים קרובות קשורים עם הישנות מחלה. קוליטיס DNBS הוא מודל מתאים ללמוד את התפקיד של דיכאון והשלכותיו על הפעלה מחדש של קוליטיס בעכברים. השיטה כרוכה בדרך כלל אינדוקציה ראשונית של קוליטיס ידי DNBS, ואחריו ברזולוציה של קוליטיס על ידי השארת העכברים עבור 6-8 שבועות. אז העכברים מנוהלים עם סוכני דיכאון גורם כגון reserpine או על ידי bulbectomy חוש הריח כדי לגרום לדיכאון ואחרי בדיקה אותם להפעלה מחדש של קוליטיס דרך אתגר עם מינון subcolitic של DNBS 2.
- מתח והפעלה מחדש של קוליטיס: מתח הוא עוד גורם סביבתי נפוץ שנקשר לפתוגנזה של IBD. ישנו גוף הולך וגדל של ראיות המצביע על קשר חזק בין לחץ כרוני והופעת תסמינים של UC ו-CD במכרסמיםזה, כמו גם בבני אדם ופרימטים לא אנושיים 3. קוליטיס DNBS הוא מודל טוב ללמוד מחדש הקשורים ללחץ של קוליטיס בשני עכברים וחולדות. השיטה בדרך כלל מועסקת באופן דומה כאמור לטיפול בדיכאון אלא במקום של דיכאון, בעלי החיים שנחשפו ללחצים כגון קולי ומתח איפוק 4.
- דלקת נוירוגנית: מספר המחקרים שתואר גם שינויים חולפים או קבועים במערכת העצבים enteric מבנה (ENS) ופונקציה, כפי שניתן לראות בדגימות רקמה ממודלים של בעלי חיים ושל חולים עם מחלת מעי דלקתי. DNBS הוא מודל טוב כדי לחקור את ההשפעות של דלקת בENS 5 וללמוד הן noradrenergic ומסלולים עצביים הכולינרגית 6.
- מנגנוני פציעה תיקון: בפתוגנזה של IBD, מתווכי פגיעה הנגזר מארח כגון מיני חמצן תגובתי (ROS), תחמוצת חנקן (NO), מולקולת הידבקות אינטר 3 (ICAM-3), ו-P-selectin כולם הוכחו pלהניח תפקיד בשיבוש אפיתל במעי. DNBS הוא מודל מצוין ללמוד פציעות שנגרמו על ידי עד הוויסות של מתווכים אלה, כמו גם מנגנוני תיקון שמוסדרים על ידי שימוש בסמים או מעכבי 7,8 סלקטיבית.
- דלקת transmural: בנוסף ליישומים שהוזכרו לעיל של DNBS, המודל יכול להיות מיושם גם כדי ללמוד דלקת transmural של המעיים, תכונה קלאסית שנמצאה בחולים עם תקליטור. DNBS וקוליטיס-Induced TNBS שניהם קשורים עם חדירה משמעותית של לימפוציטים, לרירית המעי הגס מה שהופך את הדגמים האלה שימושיים במיוחד ללמוד מנגנונים חיסוניים תלויים תא T.
בהשוואה למודל DSS, היתרונות של DNBS וקוליטיס-Induced TNBS כוללים עלות נמוכה, התפתחות מהירה של דלקת המעי הגס (בדרך כלל דורש 1-3 ימים כדי להראות כיבים ודלקות לשחזור) ונזק מקומי עקבי למעי גס דיסטלי. עם זאת החסרונות הם דרישה לרמה גבוהה יותר של מומחיות טכנית, אופטימיזציה של מינון DNBS / TNBS, ואת הצורך בהרדמה לממשל בפי הטבעת.
במאמר זה אנו מתודולוגיים חקרנו את ההשפעות של ריכוזים שונים של n-6 ו n-3 חומצות שומן רב בלתי רוויות על שינוי תגובת רירית המעי לקוליטיס-Induced DNBS בחולדות באמצעות שמן חריע שמנים צמחיים (SO) ושמן קנולה (CO) , ושמן דגים (FO). הוכח כי חומצות n-6 ו-n-3 שומן הם מתווכים חשובים של מחלה דלקתית של מעי דרך את תפקידם כmoieties acyl של phosopholipids קרום תא 9. בניגוד לפוטנציאל מעודדי דלקת של n-6 חומצות שומן, n-3 חומצות שומן במספיק גבוהה הצריכה הן פוטנציאל חומרים אנטי דלקתיים חזקים. הפעולות אנטי דלקתיות של n-3 חומצות שומן בתיווך ישירות דרך החלפה של חומצה הארכידונית כמצע eicosanoid, עיכוב חילוף חומרים חומצה הארכידונית ובעקיפין באמצעות שינוי של proinflביטוי ammatory גן ואיתות תא. N-3 חומצות השומן גם להצמיח resolvins, משפחה של מתווכים אנטי דלקתיים. צריכה גבוה של n-3 חומצות שומן קשור לירידה בייצור של eicosanoids מעודדי דלקת, ציטוקינים, כמוקינים, מיני חמצן תגובתי וביטוי של מולקולות הדבקות. במחקר זה, חולדות דיאטות כרצונך מודעה זהות בכל החומרים המזינים, למעט חומצות שומן נמאס, עם כאנרגית אחוזים מהשומן, 20% SO, CO 20%, או 18% שמן דגים בתוספת 2% שמן חריע (FO) 10-11 . כאחוז מהאנרגיה היומית, הדיאטה כן ובלבד 15% חומצה לינולאית (LA), עם <חומצת 0.06% α-לינולנית (ALA) ולא חומצת eicosapentaenoic (EPA) או חומצת docosahexaenoic (DHA), דיאטת CO הייתה 4.2 % לוס אנג'לס ו1.9% ALA ללא EPA או DHA, ודיאטת FO סיפקו 1.4% EPA, 4.9% DHA, 0.32% לוס אנג'לס, ו0.12% ALA. שלושה שבועות לאחר תחילת דיאטת השומנים בדם, העכברים ניתנו DNBS intrarectal או 50% אתנול והקריבו 5 ימים לאחר מכן. Inflתגובת ammatory הוערכה על ידי הערכה של ירידה במשקל, ציוני נזק היסטולוגית ופעילות myeloperoxidase רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליכים כרוכים בנושאי בעלי חיים לעקוב אחר הנחיות טיפול בבעלי החיים שהותוו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטה של קולומביה הבריטית.
נהלים שהוזכרו בפרוטוקול זה יהיה מתואר עבור שני חולדות ועכברים, ואילו נציג התוצאות יוצגו מחולדות ספראג-Dawley.
1. הכנת DNBS וIntrarectal המינהל
- להחדרה רקטלית של DNBS בחולדות, טרי להכין 15-30 מ"ג של DNBS/250 μl 50% אתנול. לעכברים, להכין 2-6 מ"ג של DNBS/100 μl 50% אתנול. הערה: לייעל את ריכוז DNBS המדויק כדי להינתן בכל מתקן. חולדות זכרים ספראג-Dawley, ועכברי C57BL / 6 הם העדיפו לאינדוקציה של קוליטיס DNBS, ניתן להשתמש בזני עכבר וחולדה אחרים לעומת זאת. עכברים וחולדות שטופלו רק עם 50% אתנול יכולים לשמש כקבוצות ביקורת אך בהתחשב בהשפעות של אתנול הם קלים או נעדרים, אפשר אומיt ההכללה של קבוצה זו למחקר 12.
- צרף מזרק 1 מיליליטר למחט 19 G שיש לו קטטר פוליאתילן (PE-90 - חולדות או PE-50 - עכברים) מהודק עד סופו.
- קל להרדים את העכברוש או מנוחת עכבר על כרית חימום (למשל על ידי מתן isoflurane 1.5% באמצעות חרטומו, עדיין צריכה להיות חיות הרף ורפלקסים בליעה ולהציג את נשימה רגילה). החל ג'ל המדמיע לעיניה, כדי למנוע את עיני התייבשות.
- בעדינות להפעיל לחץ עם קצות אצבעות לקצה האחורי של החיה כדי להסיר כל צואה שעלולה להיות נוכח במעי גס דיסטלי.
- הכנס בעדינות את הקטטר intrarectally, עם קטטר והגיע לכ 8 הפרוקסימלי סנטימטר אל פי הטבעת לחולדות, או 3-4 סנטימטר לעכברים. להזריק כמות קטנה של הפתרון בזמן החדרת הצנתר לשמן, המאפשר החדרה קלה יותר. הערה: אם כל התנגדות מורגשת בזמן החדרת הצנתר, אל תמשיך להכניס מכיוון שהדבר עלול להוביל לניקוב שלבדופן המעי. הסר את הקטטר ותנסה להכניס מחדש בעדינות, שוב שימון המעי הגס שכימשיך.
- לאט לאט להזריק 250 (חולדות) או 100 μl (עכברים) של DNBS, או נפח שווה או 50% אתנול לפקדים. לאחר הזרקת DNBS, מקם את בעלי החיים את הראש למטה ל90 שניות כדי למנוע אובדן של DNBS.
- לאחר מתן DNBS, להאכיל את החיות 8% מים סוכרוז בתמיסת מלח 0.2% על מנת למנוע התייבשות בשבוע הראשון.
- להתבונן היטב את בעלי החיים, עם מעקב יומי לירידה במשקל וסימנים של התייבשות או מצוקה לתקופת הניסוי. הערה: ירידה במשקל עשויה מתקרבת במהירות את המלצות CCAC של ירידה במשקל המרבית המותרת. מאז זה בעיקר נובע מהתייבשות, יש להשתמש בירידה במשקל כמדד לניהול הפתרון של רינגר לקטט להגביל התייבשות. אנא הקפד להתייעץ עם וטרינר המתקן בנושאי בריאות כמתאים.
2. שיתוףllecting רקמות והערכת נזק היסטולוגית בDNBS עכברים פיגור
- בנקודת הזמן הרצויה לאחר אתגר עם DNBS, להרדים בעלי חיים על ידי מינון יתר עם isoflurane בתא הרדמה בתוספת מספיק חמצן. שים לב לבעלי החיים עד שלא עולה או יורדים מהחזה נתפס ואין דופק מוחשי. לאשר את החיה כבר מורדמים כראוי על ידי העדר תגובה לקמצוץ הבוהן או נוגעים ללב של הקרנית, ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- פתח את חלל הבטן ולהוציא את המעי גס כולו. פתח את מעי אורכים; צריכים להיות שנצפו כיבים ברירית מקרוסקופית כ 5-6 הפרוקסימלי סנטימטר מהקצה הדיסטלי של המעי הגס בחולדות (2-3 סנטימטר בעכברים). הערה: לאחר הסרת המעי גס, להעריך את ציוני נזק מקרוסקופית אם תרצה בכך. לאסוף קטעים של מעי גס ממקבילים מיקום האנטומי מבעלי השליטה. הערה: האנשים הבקיע הרקמות לציוני נזק מקרוסקופית צריכיםלהיות עיוור לזהותו של קבוצות הטיפול. ציון סעיפי רקמות באמצעות הקריטריונים הבאים או דומים: חומרה והיקף של כיב (0-10), סיכמו עם ציונים על היעדרות או נוכחות של שלשול (0 או 1), הידבקויות (0, 1 או 2) ועובי דופן מעי הגס מקסימאלי במילימטרים 11.
- לאסוף 0.5 סעיפי סנטימטר הפרוקסימלי לאתר של נזק מקרוסקופית מקסימאלי. הצמד להקפיא סעיף 0.5 סנטימטר אחד בחנקן נוזלי בהמשך כדי להעריך myeloperoxidase פעילות (MPO) (מדד של חדירת נויטרופילים), ולמקם את הסעיף האחר ב10% ניטראלי שנאגרו פורמלין לניתוח היסטולוגית. הערה: הצמד רקמות קפואות עבור assay myeloperoxidase ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1.
- לאפשר לרקמות שנאספו לניתוח היסטולוגית בשלב 2.3 לתקן בפורמלין לילה, ולאחר מכן לשטוף עם 70% אתנול. להטביע רקמות בפרפין ולחתוך לעובי רצוי (3-5 מיקרומטר), כתם עם hemotoxylin ו eosin (HE) לניקוד היסטולוגית. יש שני משקיפים להבקיע לפחות שלושה חלקי רקמות מכל חיה תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע את ציוני נזק היסטולוגית לכל קבוצה. הערה: האנשים הבקיע הרקמות לציוני נזק היסטולוגית צריכים להיות עיוורים לזהותו של קבוצות הטיפול. ציון סעיפי רקמות באמצעות הקריטריונים הבאים או דומים: היקף לחדור תא דלקתי (0 = נעדר, 3 = transmural), אובדן של אדריכלות רירית (0 = נעדר, 3 = חמורה), נוכחות או עדר של מורסות קריפטה (0-1) , ודלדול גביע תא (0-3). לקבוע ציון נזק היסטולוגית כסכום של ציונים אלה 11.
3. רקמת מעי פיגור הבמה Myeloperoxidase (MPO) Assay על DNBS
- פעילות MPO assay ב0.5 פלחים הגס סנטימטר שהושגו בשלב 2.3. Homogenize רקמות במאגר המגון MPO (0.5% ברומיד hexadecyltrimethyl-אמוניום בחיץ פוספט אשלגן 50 מ"מ (pH 6.0)) לתת segme מעי גס 50 מ"גNT / מיליליטר של השעיה חיץ הומוגניזציה.
- Aliquot הפתרון הומוגני לתוך 1 מיליליטר מנות ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב 10,000 X גרם.
- מערבבים את כל aliquot 100 μl עם 2.9 מיליליטר של 50 מ"מ חיץ פוספט (pH 6.0) המכיל 0.167 מ"ג / מיליליטר של o-dianisidinedihydrochloride ו0.0005% מי חמצן בקובט.
- מדוד את קצב ספיגת באמצעות ספקטרופוטומטר ב460 ננומטר. הערה: פעילות MPO מוגדרת ככמות האנזים משפילה 1 μmol / דקות של H 2 O 2 לH 2 O בטמפרטורת חדר, והוא בא לידי ביטוי ביחידות למ"ג של רקמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אתגר של חולדות (ספראג-Dawley) או עכברים (C57BL / 6) עם DNBS בדרך כלל תוצאות בירידה במשקל זמנית ושלשולים, לפעמים עם הווה דם בצואה. עם זאת, גורמים כגון גנטיקה, תזונה וחיידקי מעיים יכולים לשנות את רגישות לקוליטיס DNBS המושרה. לכן, בעלי החיים שנכללו בניסויים צריכים להיות מאותו המוסד, או נגזר באופן מקומי או הורה מספק חיה אחת. כל בעלי החיים צריכים להיות במעקב צמוד לתואר של ירידה במשקל וסימפטומים של מצוקה סבלה במהלך קוליטיס.
התוצאות מוצגות באיורים 1-4 מייצגות ניסוי שבו ההשפעות של שלושה שמנים תזונתיים: שמן חריע, שמן קנולה ושמן דגים לחומרת קוליטיס DNBS וכתוצאה מכך הוערכו. הבדלים סטטיסטיים בין קבוצות נקבעו באמצעות ANOVA ואחרי הבדיקה של פוסט הוק Tukey, תוך שימוש בתוכנת ניתוח נתוני תכנית. ערך AP של <0.05 היה considered משמעותי.
בעקבות אתגר intrarectal עם DNBS (20 DNBS/250 מ"ג μl של 50% אתנול), ירידה משמעותית במשקל נצפתה על ידי 48-HR בחולדות בתוספת FO ו-CO ועל ידי 72 שעות בחולדות בתוספת כל כך (P <0.05). ירידה במשקל מרבי נתפס ב48 שעות בחולדות בתוספת FO ועל ידי 72 שעות בחולדות בתוספת CO וכך. עלייה במשקל התחדשה לאחר 72 שעה, ועל ידי 5 DNBS הודעה ימים, FO וכן קבוצות להראות משקל גוף דומה לערכי בסיס. חולדות בקרה בתוספת הדיאטות ומאותגרות עם אתנול intrarectal ימשיכו לעלות במשקל במהלך תקופת המחקר של 5 ימים.
הנזק במעיים הנגרמים על ידי DNBS יכול להיות נרחב, לעומת זאת האזור של נזק מקסימאלי הוא בדרך כלל מקומי לדיסטלי 6 סנטימטר של המעי הגס בחולדות, ו3 סנטימטר דיסטלי בעכברים. Macroscopically זה יכול להיות שנצפה כעיבוי קיר מעי הגס, כיבים ברירית, והידבקות מזדמנת של distמעי גס אל לאיברים סמוכים, כגון שלפוחית השתן. על הערכה קרובה יותר היסטולוגית, פגיעת אפיתל נרחבת, באזורים מסוימים שמוביל להיווצרות כיבים, חדירת תאים חיסונית (בעיקר נויטרופילים ולימפוציטים), cryptitis, דלדול ריר, ובצקת הוא ציין. למרות סימנים אלה היסטולוגית של דלקת ונזק לרקמות ניכרים בכל שלוש קבוצות הנפט בתוספת תזונתיות על אתגר עם DNBS, הנזק החמור ביותר הוא לראות את קבוצת שמן חריע, ואחריו את קבוצת שמן קנולה, ואילו חולדות בקבוצת שמן הדגים להפגין פגיעה מינימאלית אפיתל וחדירה מוגבלת של תאי דלקת לתוך הרירית (איור 2).
הבדלים בנזק היסטולוגית ניתן לכמת, כדי לאפשר השוואה טובה יותר בין קבוצות. קריטריונים המשמשים להערכת נזק היסטולוגית כללו את היקף לחדור דלקתי תא, אובדן הארכיטקטורה רירית, דלדול תא גביע, ואת הנוכחות של crypאבצס לא. שמוצגים באיור 3 הם ציוני הנזק היסטולוגית לשלוש קבוצות הנפט התזונתיות במהלך קוליטיס DNBS. כפי שראה בסעיפי H & E המוכתמות באיור 2, קבוצת השמן בתוספת חריע יש מידה הגדולה של נזק, ואחריו את קבוצת שמן קנולה, ואילו קבוצת שמן הדגים מראה את הכמות המינימאלית של נזק.
היקף לחדור תא דלקתי, בעיקר של נויטרופילים, יכול להיבחן עוד יותר על ידי ביצוע assay פעילות myeloperoxidase (MPO). MPO נחשב סמן של דלקת, כפי שהוא אנזים שנמצא בגרגרים של גרנולוציטים נויטרופילים ותאים אחרים של שושלת מיאלואידית. הערכה של פעילות MPO בנקודתי החולדה 5 חשיפת הודעה DNBS היום במגלה גידול בפעילות בכל שלוש הקבוצות (איור 4). פעילות MPO הגדולה ביותר שנצפתה בקבוצת שמן חריע, ואחריו את קבוצת שמן קנולה, ואילו פעילות MPO הנמוכה ביותר היא לראות אתקבוצת שמן דגים, המקביל לציוני הנזק היסטולוגית העריכו באיור 3.
איור 1. שינויים במשקל גוף (% מבסיס) הבאים ממשל intrarectal 50% אתנול (שליטה) או dinitrobenzene חומצת sulfonic (DNBS) בחולדות ספראג-Dawley נקבה בוגרת (250-500 גר ') האכילה SO, CO, או FO. החולדות אז פיקוח על אובדן משקל גוף מיום 1 יום 5 לאחר טיפול עד. אובדן אחוז ממשקל הגוף הוא זמם נגד ימים שלאחר טיפול DNBS. ערכים הם ממוצעי ± SEM, n = 5 / קבוצה. בהשוואה למים שאינם DNBS טופל עמיתים, חולדות שהוזנו עם CO וFO הייתה הפחתה משמעותית במשקל הגוף הראשוני שלהן מוקדם ככל טיפול לאחר DNBS יום 1 ואילו ביום 3 בכל שלוש הקבוצות של חולדות היו significant ירידה במשקל ביחס למשקל בסיס (P <0.01). כל קבוצות קוליטיס להפגין עלייה במשקל לאחר 72 שעה, עם המשקל חוזר לנקודת ההתחלה בFO וקבוצות כל כך נמאס. חולדות בקבוצת ביקורת אתנול להפגין עלייה במשקל במהלך תקופת המחקר של 5 ימים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. הופעה היסטולוגית של קטעי רקמת מעי גס נציג H & E מוכתמת 5 ימים לאחר מתן intrarectal 50% אתנול (CTL) או DNBS לחולדות נקבות בוגרות האכילה SO, CO, או FO. הרקמה נאסף בפורמלין 10% ואפשרה לתקן למינימום של 24 שעות ואחריו חתך רקמות והוא מכתים.חלקי רקמות מחולדות שהוזנו SO וCO להפגין שיבוש משמעותי של יושרת אפיתל עם מידה שונה של פגיעת אפיתל, קריפטה לנשור, היווצרות כיב וחדירה לתא חיסונית transmural, עם שינויים בולטים יותר ראו עם כל כך. בעכברי CO הפד, עדות להתחדשות אפיתל ושבת הוא ראה. לעומת זאת, חולדות שהוזנו FO שמר על ניקיון אפיתל והייתה חדירה מוגבלת של תאים דלקתיים מוגבלים לpropria lamina. (M-רירית, SM-תת רירי וU-כיב; ההגדלה מקורית 100X; סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. ציון נזק היסטולוגית של רקמות מעי הגס 5 ימיםממשל intrarectal חרי של 50% אתנול (בר ברור) או DNBS (בר מוצק) לחולדות נקבות בוגרות האכיל SO, CO, או FO. סעיפי רקמות מקבלים נקודות על ידי חוקר מנוסה, שהתעוור לטיפולים, תוך שימוש בקריטריונים שנקבעו על סמך היסטולוגית נזק. הקריטריונים המשמשים למחקר זה כולל: חדירה דלקתית סלולרי (0 = נעדר, 3 = transmural), אובדן שלמות רירית (0 = נעדרה, 3 = חמורה) היווצרות, קריפטה מורסה (0 = 1 = נעדר, הווה) דלדול גביע תא (0 = נעדרו, 3 = גבוהים). הציון הנזק היסטולוגית נקבע כסכום של ציונים שהושגו על ידי הבקיע מינימום של שלושה קטעי רקמה מכל חיה. התוצאות מראות בבירור נזק היסטולוגית מופחת בחולדות FO האכילו בהשוואה לכך, וחולדות שהוזנו CO. ערכים הם ממוצעי ± SEM, n = 5 / קבוצה. בהשוואה לבקרת אתנול בהתאמה, ממשל DNBS קשור עם עלייה משמעותית בציון נזק (P <0.05); קוליטיס קבוצות עם סמלים שונים שונה באופן משמעותי (P <;. 0.01) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. פעילות MPO ברקמות מעי הגס 5 ימים לאחר מתן intrarectal 50% אתנול (בר ברור) או DNBS (בר מוצק) לחולדות נקבות בוגרות האכילו SO, CO, או FO. רקמות מעי הגס מודלקות הם הצמד קפואים בחנקן נוזלי וassayed לפעילות myeloperoxidase , כמדד לחדירת גרנולוציט. חולדות Colitic האכילו פעילות MPO מופע מופחתת FO בהשוואה לכך, וערכים ושות הם אמצעי ± SEM, n = 5 / קבוצה. בהשוואה לבקרת אתנול בהתאמה, ממשל DNBS מזוהה עם גידול משמעותי בפעילות MPO (P <0.001); קוליטיס קבוצות עם סמלים שונים significantly שונה (P <0.05). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל DNBS המתואר בפרוטוקול זה הוא מודל קוליטיס יקר, זול, ושחזור שיכול להיות מנוצל ללימוד היבטים שונים של מחלת מעי דלקתי. כאשר מנוהל intrarectally לחולדות או עכברים, DNBS גורם מידה ניכרת של דלקת ופגיעה ברקמות במעי הגס, שמזכיר מחלת קרוהן האנושית במונחים של התכונות היסטולוגית השונות שלה כוללים חדירת transmural של תאי Th1 polymorphonuclear והפעלת NF-κB תלויה דומיננטית.
דגם זה כבר נעשה שימוש כדי לחקור גורמים שונים חשבו להשפיע על מחלת מעי דלקתי כגון מתח, דיכאון, ודיאטה, כמו גם מעורבות של מערכת העצבים enteric, מנגנוני פציעה תיקון, דלקת transmural, וטיפולים פרה. מודל DNBS הוא גם חלופה מתאימה לדלקת הנגרמת TNBS בעכברים וחולדות ומציע אלטרנטיבה פחות יקרה למודלים אחרים בכינוי מועסקים כימיים של קוליטיס כגון DSS. הפעולות המתוארות בעמ 'זהrotocol יאפשר אחד כדי לבצע מודל זה בהצלחה.
עולה בקנה אחד עם מודלים ניסיוניים אחרים של קוליטיס 13-16, המחקר הנוכחי מחזק את ההשפעות המשתנה של שומן תזונתי על תגובות ברירית מעיים חיסוניים שבו צריכה גבוה של EPA ו-DHA שנצרכו לפני ואחרי חשיפת DNBS פוחתת, ואילו צריכה גבוה של ARA עם n המינימלי -3 חומצות שומן מחריפות את דלקת המעי הגס. ההשפעות המיטיבות של n-3 חומצות שומן תזונתיות שנצפו במחקר זה הן נובע בחלקו n-3 חומצות שומן בצורה יעילה ARA פוספוליפידים רקמות התחתון הן על ידי עיכוב סינתזה של ARA מלוס אנג'לס ועל ידי החלפת ARA עם EPA ו-DHA. שינוי זה מסיט את מצע חומצת שומן זמין לשחרור וסינתזת eicosanoid לאחר מכן כלפי סביבה פחות מעודדי דלקת. לעומת זאת, צריכה הגבוהה של n-6 חומצות שומן מזוהה עם ARA מעי הגס גבוה עם הסינתזה הבאה של מתווכים מעודדי דלקת שיחריפו את התגובה חיסונית ברירית. במשאירg עם המחקר שנערך לאחרונה שלנו בקוליטיס rodentium המושרה Citrobacter, חולדות שהוזנו בשמן קנולה עם פחות ARA מאשר שמן חריע, אבל עם n-3 ALA ולא EPA או DHA הייתה תגובה דלקתית ביניים 16.
ישנם מספר צעדים קריטיים שיכול להשפיע על היישום המוצלח של מודל DNBS. מחקרים שונים השתמשו בריכוזים שונים של DNBS החל 3-6 מ"ג / עכבר או 15-30 מ"ג / עכברוש להקים קוליטיס. לכן, חשוב לחוקרים בודדים כדי לייעל את המינון של DNBS ללימודיהם, שכן במינונים אופטימליים עשויים להשתנות ממתקן בעלי חיים אחד למשנהו. כמו כן, חשוב לציין כי הריכוז של DNBS יהיה שונה בהתאם לסוג והמינים של בעלי חיים שחוקר משתמש (לדוגמה: זנים מסוימים עשויים להיות רגישים יותר ואחרים עמידים יותר בפני DNBS). צריך להקפיד על מנת להבטיח כי הריכוז של DNBS אינו גבוה מדי כמו זה יכול לגרום למותו המהיר של בעלי החיים resulting מניקוב מעי ואלח הדם. עוד צעד קריטי לשימוש במודל זה הוא לפתח את השיטה המתאימה להחדרת קטטר intrarectal לתוך המעי הגס הדיסטלי של בעלי החיים. הנוכחות של צואה במעי הגס יכולה למנוע כניסה מספקת של קטטר במהלך החדרה. כדי להימנע מכך, בעדינות להפעיל לחץ בקצה האחורי של פי הטבעת של עכברים מורדמים קל כדי להסיר כל צואה במעי הגס / פי הטבעת דיסטלי. מומלץ להכניס את הצנתר כ 3-4 סנטימטר מטבעת, למרות שהיא עשויה להתארך עד למקסימום של 6-8 סנטימטר בחולדות עד כפף הטחול (עיקול חד בין רוחבי ומעי גס יורד) 7. חשוב לציין כי במהלך הליך החדרה, סיכה הצנתר על ידי הזרקת DNBS / אתנול בכמויות קטנות תאפשר כניסה קלה יותר של הקטטר. על מנת להימנע מריפלוקס המדרדר של DNBS מתוך פי הטבעת, זה הוא קריטי כדי להחזיק את בעלי החיים בראש מטה עמדה ל90 שניות או לחלופין,יכולים להיות כל הזמן עכברים במשך 15 דקות בעמדת Trendelenburg (מצב שכיבה שבו הרגליים ממוקמות גבוהות יותר מראשו על ידי 15-30 °).
ניתן לאסוף רקמות בנקודות נבחרות זמן, בהתאם לאינטרסים של החוקר והאם המחקר מתמקד בדלקת אקוטית או כרונית. בנוסף, יכולות לשמש גם הרקמות ללמוד ENS המעיים ומערכת חיסון מולדת ובעלי כושר הסתגלות. עם זאת, הוא חיוני כדי להבטיח כי רקמות נדגמים כמו שצריך. מומלץ לאסוף את הרקמות בנפח גדול של פורמלין 10% ב5 מיליליטר בקבוקונים בניגוד לבקבוקוני נפח קטנים יותר על מנת להבטיח קיבוע נכון. קיבעון מתאים של דגימות הוא מפתח ללמוד הן נזק histopathological והדמיה של מולקולות מטרה ברקמות על ידי H & E וimmunostaining, בהתאמה. ניקוד היסטולוגית של רקמות צריכה להתבצע על ידי אנשים מנוסים שהתעוורו לתנאי ניסוי, תוך שימוש בקריטריונים קבועים שנקבעו על ידי tהוא 11,17 חוקר בודד. Myeloperoxidase (MPO) משמש כסמן טוב של דלקת, פגיעה ברקמות וחדירת נויטרופילים לרקמות במערכת העיכול 11. כדי לבצע את מבחני MPO, הוא הציע לצלם להקפיא את הרקמות בחנקן נוזלי וביום של ניתוח, מומלץ לעבוד עם חוצצים ופתרונות מוכנים טרי כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר ומדויקות ביותר. גם מודל זה יכול לשמש כדי לחקור תאים דלקתיים הלחדור המעי, המנגנונים מעורבים בchemotaxis וגלגול של תאים דלקתיים והמסלולים השונים המעורבים בהפעלה והשחרור של מתווכים אחרים מעודדי דלקת מעורבת בפגיעה ברקמות, כמו גם מתווכים מעורבים בויסות את התגובה הדלקתית ובתיקון רקמות.
החסרונות הקליניים ראו כיום בשימוש בתרופות לדיכוי המערכת החיסונית או מיקוד ציטוקינים מעודדי דלקת אחד כגון TNF-α צריכים לעודד investigators לפתח אסטרטגיות טיפוליות טובות יותר לניהול בחולים עם מחלת מעי דלקתי. מודלים, כגון מודל DNBS, מאפשר לחוקרים להגביר את ההבנה של הפתוגנזה של מחלת מעי הדלקתית שלנו, שעלול להיות בזיהוי מטרות טיפוליות חדשות ופיתוח / שיפור אסטרטגיות כדי לשלוט בדלקת באמצעות השימוש במסלולים דלקתיים רומן וטיפולים חדשניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הפועלים לKJ ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC) וקרוהן וקוליטיס הקרן של קנדה (CCFC). VM נתמך על ידי מלגת CFRI וGB מלגת לימודים לתואר שני מן המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR). BAV הוא ילדים עם מעיים והפרעות בכבד יו"ר הקרן (ילד) למחקר בילדים מחל מעי דלקתי וקנדה מחקר הקתדרה בילדים לגסטרואנטרולוגיה וKJ הוא המטפל מדען בכיר נתמך על ידי ילד והילד ומשפחה מכון מחקר תכנית (CFRI) המטפל מדענים בפרס , אוניברסיטה של קולומביה הבריטית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 G Needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intrarectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intrarectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| Tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| Warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BioRad | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | www.graphpad.com |
References
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Biotechnol, J. . B. iomed , (2012).
- Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression. Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).
- Reber, S. Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).
- Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis. Nat. Med. 5 (10), 1178-1182 (1999).
- Boyer, L., et al. Myenteric plexus injury and apoptosis in experimental colitis. Auto. Neurosci. Basic Clin. 117 (1), 41-53 (2005).
- Saunders, P., et al. Noradrenergic and cholinergic neural pathways mediate stress-induced reactivation of colitis in the rat. Auto. Neurosci. Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).
- Cuzzocrea, S., et al. Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat. Gut. 48 (4), 478-488 (2001).
- Cuzzocrea, S., et al. Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).
- Innis, S., Jacobson, K. Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease. Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).
- Innis, S. M., de La Presa Owens, S. Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain. J. Nutr. 131 (1), 118-122 (2001).
- Jacobson, K. Mundra H.,Innis S.M. Intestinal responsiveness to experimental colitis in young rats is altered by maternal diet. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, 13-20 (2005).
- Sanovic, S., Lamb, D. P., Blennerhassett, M. G. Damage to the enteric nervous system in experimentalcolitis. Am. J. Pathol. 155 (4), 1051-107 (1999).
- Vilaseca, J., Salas, A., Guarner, F., Rodriguez, R., Martinez, M., Malagelada, J. R. Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis. Gut. 31, 539-544 (1990).
- N-3 fatty acid-rich diet prevents early response of interleukin-6 elevation in trinitrobenzene sulfonic acid-induced enteritis. Int. J. Mol. Med. Andoh, A., Tsujikawa, T., Ishizuka, I., Araki, Y., Sasaki, M., Koyama, S., Fujiyama, Y. 12, 721-725 (2003).
- Barros, K. V., Xavier, R. A., Abreu, G. G., Martinez, C. A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis. Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).
- Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).
- Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).
