Summary
Vävnadsteknisk fibroblast-härledd infödda matris är ett framväxande verktyg för att generera en stromal substrat som stöder epitelcellsproliferation och differentiering. Här ett protokoll tillämpa denna metod för att bedöma effekterna av olika stromaceller celltyper på tumörcellbiologin presenteras.
Abstract
3D organotypiska kulturer av epitelceller på en matris inbäddat med mesenchymala celler används i stor utsträckning för att studera epitelial celldifferentiering och invasion. Rat svans typ I-kollagen och / eller matris kommer från Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkomceller har traditionellt används som substrat för att modellera matrisen eller stromal mikromiljö i vilken mesenkymala celler (vanligen fibroblaster) är befolkade. Även om experiment med användning av sådana matriser är mycket informativt, kan det hävdas att på grund av ett tvingande närvaron av ett enda protein (t ex i typ I-kollagen) eller en hög halt av basalmembrankomponenter och tillväxtfaktorer (såsom i matrisen härrörande från mus sarkomceller), dessa substrat inte bäst speglar bidraget till matrissammansättning gjorts av stromaceller själva. Att studera infödda matriser som produceras av primära dermala fibroblaster isolerade från patienter med en tumör benägen, genetisk blåsor disorder (recessiv dystrofiskepidermolysis bullosa), har vi anpassat en befintlig infödda matris protokoll för att studera tumörcellsinvasion. Fibroblaster induceras att producera sin egen matris under en längre tid i odling. Denna nativa matris därefter lösgöras från odlingsskålen och epitelceller sås på det innan hela samodling höjes till luft-vätskegränsytan. Celldifferentiering och / eller invasion kan sedan utvärderas med tiden. Denna teknik ger möjlighet att bedöma epithelial-mesenchymal cell-interaktioner i ett 3D-inställning utan behov av en syntetisk eller främmande matris med den enda nackdelen är den långa tidsperiod som krävs för att producera den nativa matrix. Här beskriver vi tillämpningen av denna teknik för att bedöma förmågan hos en enda molekyl uttryckt av fibroblaster, typ VII kollagen, för att hämma tumörcellinvasion.
Introduction
Användningen av biomaterial i 3D vävnadskultur har gjort det möjligt för forskare att studera cellens beteende i laboratoriet under fysiologiska förhållanden som mer liknar en in vivo-miljö än i en rekapituleras med 2D vidhäftning och ett plastsubstrat. Speciellt framåt stora framsteg har gjorts i modellering stratifierat epitel med antagandet av 3D odlingsmetoder vid luft-vätske-gränssnittet 1-4. Sådana tekniker härma troget keratinocytdifferentieringen och tumörcellsinvasion som möjliggör större flexibilitet och trohet för forskare som studerar dessa processer. Valet av biomaterial substrat för att efterlikna den stromal miljön har i första hand inneburit att användningen av typ I-kollagen, Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matris och de-epidermized dermis. Exempelvis har cancerassocierade fibroblaster visat sig bidra mot cancer invasion 5, initiering och progression via stromal-epithelial interaktioner 6,7 when odlas i sådana substrat.
Guldmyntfoten för att imitera stromal miljön i huden, den största och mest studerade stratifierat epitel som använder sådan teknik, anses vara de-epidermized mänskliga dermis (DED). Framställning av DED innebär avlägsnande av epidermis via trypsinering eller fysisk tagande från humant kadaver 3,4. Dock kan tillgång till en sådan hud vara mycket svårt för laboratorierna inte förknippas med kliniska institutioner, och sjuka dermis är nära omöjligt att få. Som ett alternativ, laboratorierna använder ofta en kombination av typ I-kollagen (isolerad från skolästfiskar) och / eller Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matris.
Efter upptäckten 1927 av Nageotte 8 att kollagen kan lätt isoleras med användning av ättiksyra och saltutfällning, dess tillämpning på vävnadskultur därefter uppfunnen av Huzella och kollegor 9. Kollagen beläggning visade sig vara överlägsen till glas för cellodling av 29 stammar och vävnadsexplantat som förhörs av Ehrmann och Gey 9. För närvarande är den viktigaste typen av kollagen som används i vävnadsodling isoleras från råttsvanssenor, och är oftast köpas från kommersiella källor. Emellertid är nackdelen för trogen substrat rekapitulation att råttsvanskollagen är inte identisk med humant kollagen, eller de humana dermis, där typ I-och III-kollagener är närvarande som huvudbeståndsdelar, och isolerade råttsvanskollagen är invariably fragmenterad.
Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matris är en geléproteinblandning som utsöndras av odlade Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkomceller 10. De viktigaste beståndsdelarna är laminin, typ IV kollagen, heparinsulfat proteoglycan, entaktin och nidogen och de exakta proportionerna av dessa proteiner kommer att variera från parti till parti. Förutom strukturella proproteiner, har denna matris också signifikanta nivåer av tillväxtfaktorer, såsom transformerande tillväxtfaktor β, epidermal tillväxtfaktor, insulinliknande tillväxtfaktor 1, bovint fibroblasttillväxtfaktor och blodplättshärledd tillväxtfaktor som skulle kunna ändra cellbeteende 11,12. Pekar mot komplexiteten i Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matris, har totalt 1,851 proteiner identifieras i en nyligen proteomic studie 13. Mot bakgrund av den rika och komplexa karaktär denna matris har försiktighet fått rådet vid tolkningen och jämföra olika experiment med hjälp av det 11.
Våra laboratorier har ett stort intresse för genetiska hudsjukdomar, särskilt de med en benägenhet att utveckla kutan skivepitelcancer (CSCC) 14. I fallet med recessiv dystrofisk epidermolysis bullosa (RDEB), en allvarlig blåsbildning sjukdom med nedärvda mutationer i COL7A1-genen
I denna uppsats de steg som används för att sammanfatta den kutana tumörer stromal mikromiljö (native matris) härstammar direkt från primära stromala fibroblaster in vitro beskrivs 18. Native matriser producerad genom långtidsodling av fibroblaster användes som en dermal ekvivalent med analys för CSCC cellinvasion. Vi presenterar data med hjälp av infödda matris kommer från antingen den extracellulära matrisen utsöndras av RDEB fibroblaster (med brist på typ VII kollagen (C7)) eller från RDEB fibroblaster retroviralt omvandlade med en typ VII kollagen uttrycker konstruera och demonstrera djupgående effekt på en enda kollagen på tumör cellinvasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen Principer och godkändes av lämpliga etiska kommittéer.
1. Beredning av media och reagens
- Framställning av 200x av L-askorbinsyra 2-fosfat lager
- Lös upp 29 mg L-askorbinsyra 2-fosfat per 5 ml av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM)-lösning och filtreras genom 0,22 | im membranfilter. Affär som 0,25 ml sterila alikvoter i -20 ° C.
- Lägg till 0,25 ml alikvot av 200x L-askorbinsyra 2-fosfat lager till varje 50 ml fibroblast medium (DMEM med 1% L-glutamin och 10% fetalt bovint serum) på dagen så krävs, för en slutlig koncentration av 0,1 mM L -askorbinsyra 2-fosfat.
- Framställning av keratinocyt-tillväxtmedium
- Isolering och kultur av primära SCC keratinocyter har beskrivits tidigare 21. Framställning av keratinocyt-tillväxtmedia beskrivesdäri också.
- I korthet förbereda media på följande sätt:
300 ml DMEM och 100 ml Hams F-12 kompletterat med 10% FBS
0,4 mg / ml hydrokortison
5 mg / ml insulin
10 ng / ml EGF
5 mg / ml transferrin
8,4 ng / ml koleratoxin
13 ng / ml liotyronin
1x penicillin-streptomycin lösning
2. In Vitro Konstruktion av fibroblast-härledd Native Matrix i L-askorbinsyra 2-fosfat kompletterat medium
- Seed 200,000 fibroblaster per brunn i 6-brunnars plattor (20000 celler / cm 2) i fibroblast-medium kompletterat med L-askorbinsyra 2-fosfat. Refeed var 2-3 dagar med 2-5 ml av media. (OBS: refeeding frekvens och volym kan justeras för att passa de individuella behoven hos olika celler Se "Diskussioner".).
- Ett tjockt lager av celler inbäddade i extracellulär matris bildas vid slutet av sex veckor, synliga för blotta ögat (
- Låt den infödda matris float och omforma i 5 dagar, föränderliga medie var 2-3 dagar. På grund av att draghållfastheten och inneboende remodeling inom matris, kommer matrisen krympa drastiskt och blir reducerad till en mindre, men tjockare nativa matris, och är redo att tas i anspråk för invasionsanalys.
3. Invasion analys med tumör SCC keratinocyter
- Plocka upp den infödda matrisen försiktigt med trubbig pincett och överföra till Nylon netto. Väl på nylonnät, sprida matrisen försiktigt för att ligga så plant som möjligt med hjälp av en 1 ml mikropipettspets och trubbig pincett.
- Förbered sterila klonala cylindrar genom att smeta en liten mängd sterilt vaselin på en ände.
- Placera klonala cylindrarna på infödda matrisen, med vaselin sidan nedåt. Detta för att säkerställa en tät förslutning mellan den nativa matrix och de klonala ringar.
- Lägg CSCC celler till de klonala cylindrar (250000 celler i 100 | il av keratinocyt-tillväxtmedium).
- Ta bort de klonala cylindrar efter 6 timmar när CSCC cellerna har slagit sig ned på den infödda matrisen.
- Lyft nylonnät med de infödda matrisen och CSCC celler till luft-vätska gränssnitt på böjt rostfritt ståltrådsnät stöd.
- Lägg keratinocyt tillväxtmedium kompletterat med askorbinsyra tills medienivån når bottnen av den nativa matrix.
- Ändra media var 2-3 dagar och skörd på 7 och 14 dagar efter sådd av CSCC celler.
4. Skörd av 3D-kulturer och Förberedelse för histologi
- Fix i 4% paraformaldehyde över natten vid rumstemperatur.
- Bisect proverna och bädda in i vax för formalinfixerade paraffininbäddade block, med snittytan vänd utåt.
- Alternativt bädda in tudelade proverna i oktober och snap-frysa omedelbart i flytande kväve för färska frysta vävnadsblock.
- Klipp 4 ìm avsnitt på mikrotom och avvaxa (om det behövs). Färga med standard hematoxylin och eosin. För att visualisera de CSCC celler, mus-monoklonal antikropp mot keratin 14 (LL001, in-house) kan användas i immunhistologi färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna teknik öppnar upp möjligheten att undersöka och jämföra den invasiva beteende av tumörceller (i detta fall CSCC) under olika 3D-stromal miljöer. Med denna teknik kan inte bara C7-brist infödda matriser som intagits RDEB huden miljö skapas, utan också ytterligare matriser som är genetiskt manipulerade till över-express C7 18. Såsom framgår av fig. 2, invasion av RDEB CSCC keratinocyter var signifikant retarderad i C7-uttrycker nativa matriser i jämförelse med C7-bristfälliga RDEB kontroll. Denna invasion visualiseras via standard histologiska metoder, där gelerna fasta, inbäddade i paraffinblock och sedan sektione och immun. Förslag på antikroppar för att använda för färgning är anti-keratin 14 (LL001) för CSCC celler och anti-vimentin (V9) för fibroblaster.
p_upload/51321/51321fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Arbetsflöde för generering av fibroblast-härledd infödda matrisen och tumörinvasion analysen. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Keratin 14 (LL001) färgning av CSCC invasion i den nativa matris härledd från kontroll RDEB fibroblast bristfällig i C7 (ai och bi), eller i RDEB fibroblaster överuttrycker fullängds-C7-expression (AII och bii), visar tydligt att den åter uttryck C7 i extracellulär matrix kan fördröja CSCC keratinocyte invasion. Kärnor färgades med DAPI (i blått) och fibroblaster med vimentin (i grönt) i bi-och BII.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av karaktären av detta experiment kan den totala tid som krävs för slutförande vara upp till två månader. Under hela denna tid, måste största försiktighet och steril vävnadsodlingsmetoder användas för att förhindra mikrobiell förorening.
Bortsett från dess roll som en kofaktor i syntesen av hydroxiprolin och hydroxilysin av kollagener, stimulerar askorbinsyra kollagen specifik mRNA-expression i fibroblaster 22. Askorbinsyran val här är den mer stabila L-askorbinsyra 2-fosfat 23. Refeeding rekommenderas tre gånger i veckan, men det kommer alltid att vara beroende av cellerna som studeras. De initiala fibroblastkulturer kommer att förbruka mer näringsämnen som veckorna passerar, och mer frekvent refeeding med större mediavolymer kan vara lämpligt. Det är viktigt att vara försiktig vid byte av media och försiktighet bör vidtas för att minimera störningar i cellskiktet under infödda matrisproduktion.
Matrisen bör bli synlig vanligen efter 2 veckor, särskilt runt omkretsen av brunnen. Sällan kommer matrisen befria sig själv utan någon mekanisk störning. Detta är en återspegling av den inneboende remodellering av matrisen och draghållfasthet, vilket drar matrisen inåt, men kan också vara ett tecken på att omkretsen av den nativa matrix stördes under byte av medium.
När du släpper och frigöra matriscellskiktet från plattan, måste man vara noga med att inte peta hål genom matrisen. Små trubbiga cell skrapor kan också användas i stället för 1 ml mikropipett tips. Placering av den frigjorda infödda matrisen på ett Nylon mesh först (var noga med att lägga den infödda matrisen platta) ger mycket enklare hantering och efterföljande lyft till luft-vätska gränssnitt.
Detta protokoll är den första att beskrivaanvändningen av nativ fibroblast matris såsom en dermal substrat för att modellera mikromiljön i tumörcellanalyser för att erhålla mer exakta och fysiologiskt relevanta data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
APS stöds av Debra International och British Skin Foundation. YZN stöds av A * STAR - University of Dundee Partnership Forskarskola.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- BD Biosciences - Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from: http://SPC-356230 Rev 5.0 Forthcoming.
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , Forthcoming.
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
