Summary
Manipuleret væv fibroblast-afledte native matrix er en ny værktøj til at generere en stromal substrat, som understøtter epitelcelleproliferation og differentiering. Her en protokol at anvende denne metode til at vurdere virkningerne af forskellige stromale celletyper på tumor cellebiologi præsenteres.
Abstract
3D organotypiske kulturer af epitelceller på en matrix indlejret med mesenchymale celler er almindeligt anvendt til at studere epitelial celledifferentiering og invasion. Rotte hale kollagen type I og / eller matrix afledt fra Engelbreth-Holm-Swarm muse sarcomaceller traditionelt er blevet anvendt som substrater til at modellere matrix eller stromale mikromiljø, hvori mesenchymale celler (sædvanligvis fibroblaster) er befolket. Selvom forsøg med sådanne matricer er meget informativ, kan det hævdes, at på grund af en mere tungtvejende tilstedeværelsen af en enkelt protein (som i type I kollagen), eller et højt indhold af basalmembrankomponenter og vækstfaktorer (såsom i matrix stammer fra mus sarcomaceller), har disse substrater ikke bedst afspejler bidraget til matrixsammensætning fra stromacellerne selv. At studere indfødte matricer produceret af primær dermalfibroblaster isoleret fra patienter med en tumor udsat, genetisk blærer lidelse (recessive dystrofiskepidermolysis bullosa), har vi tilpasset en eksisterende native matrix protokol til at studere tumorcelleinvasion. Fibroblaster tilskyndet til at producere deres egen matrix over en længere periode i kultur. Denne native matrix derefter løsrevet fra dyrkningsskålen og epitelceller udsås på det før hele cokultur hæves til luft-væske-grænsefladen. Cellulær differentiering og / eller invasion kan derefter vurderes over tid. Denne teknik giver mulighed for at vurdere epitel-mesenchymale celle interaktioner i en 3D-indstilling uden behov for en syntetisk eller udenlandsk matrix med den eneste ulempe er den lange periode, der kræves for at producere den native matrix. Her beskrives anvendelsen af denne teknik til at vurdere evnen af et enkelt molekyle udtrykt af fibroblaster, type VII collagen, til at inhibere tumorcelleinvasion.
Introduction
Anvendelse af biomateriale i 3D vævskultur har gjort det muligt for forskerne at studere celle adfærd i laboratoriet under fysiologiske betingelser mere beslægtet med et in vivo-miljøet end én gentaget med 2D-adhæsion og et plastunderlag. Især fremad store fremskridt der er gjort i modellering lagdelt epiteler med vedtagelsen af 3D dyrkningsmetoder på luft-væske grænsefladen 1-4. Sådanne teknikker trofast efterligner keratinocytdifferentiering og tumorcelleinvasion muliggør større fleksibilitet og troskab for forskere studerer disse processer. Valget af biomateriale substrat til at efterligne det stromale miljø har primært involveret anvendelse af type I collagen, Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrix og de-epidermized dermis. For eksempel har cancerassocierede fibroblaster vist sig at bidrage mod cancer invasion 5, initiering og progression via stromale-epitel interaktioner 6,7 when dyrkes i sådanne substrater.
Den gyldne standard for at efterligne det stromale miljø i huden, de største og mest udbredte studerede stratificerede epitel ved hjælp af sådanne teknikker, anses for at være de-epidermized menneskelige dermis (DED). Udarbejdelse af DED omfatter fjernelse af overhuden via trypsinisering eller fysisk afstandtagen fra humant kadaverhud 3,4. Dog kan adgang til en sådan hud være meget svært for laboratorierne ikke er associeret med kliniske institutioner, og syge dermis er nær umuligt at opnå. Som et alternativ, laboratorier ofte bruger en kombination af type I kollagen (isoleret fra rotte haler) og / eller Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrix.
Efter opdagelsen i 1927 af Nageotte 8 at kollagen let kan isoleres under anvendelse af eddikesyre og saltudfældning, blev dets anvendelse på vævskultur senere udviklet af Huzella og kolleger 9.. Kollagen overtræk viste sig at være overlegen i forhold til glas til cellekultur af 29 stammer og vævseksplantater som interrogerede af Ehrmann og Gey 9. I øjeblikket er den største type af kollagen anvendes i vævskultur isoleret fra rotte-hale sener, og er normalt købt fra kommercielle kilder. Den ulempe til trofast substrat sammenfatning er imidlertid, at rotte hale kollagen er ikke identisk med human collagen, eller de humane dermis, hvor type I og III collagens er til stede som hovedbestanddele, og isolerede rotte hale kollagen er uvægerligt fragmenteret.
Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrix er en gelatinøs proteinblanding udskilles af dyrkede Engelbreth-Holm-Swarm muse sarcomaceller 10. De vigtigste bestanddele er laminin, type IV collagen, heparinsulfat proteoglycan entactin og nidogen og den nøjagtige mængde af disse proteiner vil variere fra batch til batch. Bortset fra strukturelle proproteiner, indeholder denne matrix også betydelige niveauer af vækstfaktorer, såsom transformerende vækstfaktor β, epidermal vækstfaktor, insulin-lignende vækst faktor 1, kvæg fibroblast-vækstfaktor, og trombocyt-afledt vækst faktor, som ville ændre cellulære adfærd 11,12. Peger mod det store kompleksitet Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrix, blev identificeret i alt 1.851 proteiner i en nylig proteom undersøgelse 13. I lyset af de rige og komplekse karakter af denne matrix, er forsigtighed blevet rådgivet ved fortolkning og sammenligning af forskellige eksperimenter med brug af det 11.
Vores laboratorier har en stor interesse i genetiske hudsygdomme, især dem med en disposition for at udvikle kutant planocellulært karcinom (CSCC) 14.. I tilfælde af recessive dystrofisk epidermolysis bullosa (RDEB), en alvorlig blærer sygdom med germline mutationer i COL7A1-genet
I dette papir de trin, der anvendes til rekapitulere den kutane tumor stroma mikromiljø (native matrix) afledt direkte fra primære stromale fibroblaster in vitro beskrives 18. Native matricer produced af langvarig kultur af fibroblaster blev anvendt som svarer til assay for CSCC celleinvasion dermal. Vi præsenterer data ved hjælp af indfødte matrix stammer fra enten den ekstracellulære matrix, der udskilles af RDEB fibroblaster (med mangelfuld typen VII kollagen (C7)) eller fra RDEB fibroblaster retrovirustransformerede transduceret med en type VII collagen udtrykker konstruere og demonstrere dybtgående effekt af en enkelt collagen på tumor celleinvasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen Principper og blev godkendt af de relevante etiske komitéer.
1.. Udarbejdelse af medier og reagenser
- Fremstilling af 200x af L-ascorbinsyre-2-phosphat-lager
- 29 mg L-ascorbinsyre 2-phosphat pr 5 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) opløses og filtreres gennem 0,22 um membranfilter. Store som 0,25 ml sterile portioner i -20 ° C.
- Tilføj 0,25 ml alikvot af 200x L-ascorbinsyre 2-phosphat lager til hver 50 ml fibroblast medier (DMEM med 1% L-glutamin og 10% føtalt bovint serum) på dag, der kræves for en slutkoncentration på 0,1 mM L -ascorbinsyre 2-phosphat.
- Fremstilling af keratinocyt vækstmedier
- Isolering og dyrkning af primære SCC keratinocytter er blevet beskrevet tidligere 21.. Fremstilling af keratinocyt medier er beskrevetderi samt.
- Kort fortalt, forberede medierne som følger:
300 ml DMEM og 100 ml Hams F-12 suppleret med 10% FBS
0,4 mg / ml hydrocortison
5 mg / ml insulin
10 ng / ml EGF
5 mg / ml transferrin
8,4 ng / ml koleratoksin
13 ng / ml liothyronine
1x penicillin-streptomycin-opløsning
2.. In vitro Konstruktion af fibroblast-afledte Native Matrix i L-ascorbinsyre 2-Phosphate Suppleret Media
- Seed 200.000 fibroblaster per brønd i plader med 6 brønde (20.000 celler / cm 2), fibroblast-medium suppleret med L-ascorbinsyre-2-phosphat. Refeed hver 2-3 dage med 2-5 ml medier. (Bemærk: refeeding frekvens og volumen kan justeres til at passe de individuelle behov hos forskellige celler Se "diskussioner".).
- Et tykt lag af celler indlejret i ekstracellulær matrix dannes ved udgangen på 6 uger, der er synlige for det blotte øje (
- Lad den native matrix svømmeren og remodel i 5 dage, skiftende medier hver 2-3 dage. På grund af trækstyrke og iboende remodeling inden matrix, vil matrixen trække drastisk og blive reduceret til en mindre, men tykkere native matrix, og er klar til at blive udnyttet til invasion assay.
3. Invasion Assay med Tumor SCC Keratinocytter
- Saml den indfødte matrix forsigtigt med stumpe pincet og overføre til Nylon net. Når du er på nylonnet, sprede matricen forsigtigt at ligge så fladt som muligt ved hjælp af en 1 ml mikropipettespids og stumpe pincet.
- Forbered sterile klonale cylindre ved at smøre en lille mængde af steril vaseline den ene ende.
- Placer klon cylindre på den oprindelige matrix med vaseline nedad. Dette er for at sikre en tæt forsegling mellem den native matrix og de klonale ringe.
- Tilføj CSCC celler til de klonede cylindre (250.000 celler i 100 ul keratinocytdyrkning medier).
- Fjern de klonale cylindre efter 6 timer, når CSCC cellerne har slået sig ned på den oprindelige matrix.
- Løft Nylon net med de indfødte matrix og CSCC celler til luft-væske grænsefladen på bøjet rustfrit stål trådnet support.
- Tilføj keratinocytdyrkning medium suppleret med ascorbinsyre, indtil mediet niveau rører bunden af det native matrix.
- Skift medier hver 2-3 dage og høst på 7 og 14 dage efter udsåning af CSCC celler.
4.. Høst af 3D Cultures og forberedelse til histologi
- Fix i 4% pariaformaldehyde natten over ved stuetemperatur.
- Gennemskære prøver og integrere i voks for formalin-fikseret paraffin indlejret blokke, med skærefladen vender udad.
- Alternativt integrere gennemskæres prøver i OLT og snap-freeze straks i flydende nitrogen for friske frosne væv blokke.
- Skær 4 um sektioner på mikrotom og afvoksning (hvis nødvendigt). Farv anvendelse af standard hæmatoxylin og eosin. At visualisere CSCC celler, muse-monoklonalt antistof mod keratin 14 (LL001, in-house) kan anvendes i immunhistologi farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne teknik åbner mulighed for at undersøge og sammenligne den invasive opførsel af tumorceller (i dette tilfælde CSCC) under forskellige 3D stromale miljøer. Ved hjælp af denne teknik, kan ikke blot C7-deficiente native matricer, gentaget den RDEB dermal miljø dannes, men også yderligere matricer, som er blevet genetisk manipuleret til over-express C7 18. Som det ses i figur 2, invasion af RDEB CSCC keratinocytter var signifikant forsinket i C7-overudtrykker native matricer i forhold til C7-deficient RDEB kontrol. Denne invasion visualiseres via standard histologiske metoder, hvor geler blev fastsat, indlejret i paraffin blokke og derefter sektionerede og immunofarvede. Foreslåede antistoffer til brug for farvning er anti-keratin 14 (LL001) for CSCC celler og anti-vimentin (V9) for fibroblaster.
p_upload/51321/51321fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Workflow for produktionen af fibroblast-afledte indfødte matrix og tumor invasion analysen. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Keratin 14 (LL001) farvning af CSCC invasion i den native matrix afledt af kontrol RDEB fibroblast mangelfuld i C7 (ai & bi) eller i RDEB fibroblaster overudtrykker fuld længde C7 ekspression (aii og bii), viser tydeligt, at genudtrykning C7 i ekstracellulær matrix kan forsinke CSCC keratinocyt invasion. Kerner blev farvet med DAPI (i blåt) og fibroblaster med vimentin (i grønt) i bi og bii.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af karakteren af dette forsøg, kan den samlede tid, der kræves for færdiggørelse være op til to måneder. I hele denne gang, skal yderste omhu og sterile vævskultur praksis anvendes til at forhindre mikrobiel kontaminering.
Bortset fra sin rolle som en cofaktor i syntesen af hydroxyprolin og hydroxylysin af kollagener, ascorbinsyre stimulerer collagen specifik mRNA-ekspression i fibroblaster 22. Ascorbinsyre valg her er den mere stabile L-ascorbinsyre 2-phosphat 23. Refeeding tilrådes tre gange om ugen, men det vil altid være afhængig af cellerne blive undersøgt. De indledende fibroblastkulturer vil forbruge flere næringsstoffer som ugerne går, og hyppigere refeeding med større medier mængder kan være tilrådeligt. Det er vigtigt at være forsigtig, når der bør tages skiftende medier og omhu for at minimere forstyrrelser i cellelaget under native matrix produktion.
Matrixen bør være synlige normalt efter 2 uger, især omkring omkredsen af brønden. Sjældent vil matrixen frigøre sig selv uden nogen mekanisk afbrydelse. Dette er en afspejling af den iboende ombygning af matrixen og trækstyrke, som trækker matrixen indad, men kan også være et tegn på, at omkredsen af den native matrix blev forstyrret under medieændringer.
Når du slipper og frigøre matrix cellelag fra pladen, skal man være forsigtig med ikke at stikke huller gennem matrixen. Små blunt celle skrabere kan også anvendes i stedet for 1 ml mikropipette tips. Placering af frigivet indfødte matrix på en Nylon mesh først (sørg for at lægge den indfødte matrix flad) gør for meget lettere håndtering og efterfølgende ophævelse til luft-væske grænsefladen.
Denne protokol er den første til at beskriveanvendelse af nativ fibroblast matrix som en dermal substrat at modellere mikromiljø tumorcellelinier assays for at opnå mere præcise og fysiologisk relevante data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
APS er støttet af Debra International og British Skin Foundation. YZN understøttes af A * STAR - University of Dundee Partnership ph.d.-studiet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- BD Biosciences - Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from: http://SPC-356230 Rev 5.0 Forthcoming.
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , Forthcoming.
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
