Summary
Tissue konstruert fibroblast-avledede opprinnelige matrise er en ny verktøy for å generere en stromal substrat som understøtter epitelial cellevekst og differensiering. Her en protokoll å bruke denne metoden for å vurdere effekten av ulike stromal celletyper på kreftcellebiologi er presentert.
Abstract
3D organotypic kulturer av epitelceller på en matrise med innebygde mesenchymalceller er mye brukt til å studere epitelial celledifferensiering og invasjon. Rotte hale type I kollagen og / eller matrise avledet fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom celler har tradisjonelt blitt brukt som underlag for å modellere matrise eller stromal mikromiljøet der mesenchymalceller (vanligvis fibroblaster) er befolket. Selv om forsøk ved bruk av slike matriser er meget informative, kan det hevdes at på grunn av en overordnet tilstedeværelsen av et enkelt protein (for eksempel i type I kollagen) eller et høyt innhold av kjellermembrankomponenter og vekstfaktorer (slik som i matrise utledet fra mus sarcom-celler), kan disse substrater ikke best reflekterer bidrag til matrise-blandingen gjort av stromale celler selv. Å studere innfødte matriser produsert av primær dermal fibroblaster isolert fra pasienter med en svulst utsatt, genetisk blemmer forstyrrelse (recessive dystrofeEpidermolysis bullosa), har vi tilpasset en eksisterende innfødte matrise-protokollen for å studere svulst celle invasjon. Fibroblaster er overtalt til å produsere sin egen matrise over en lengre periode i kultur. Denne opprinnelige matrise blir så løsnet fra dyrkningsskål og epitelceller blir sådd ut på den før hele coculture heves til luft-væske-grensesnittet. Cellulær differensiering og / eller invasjon kan deretter vurderes over tid. Denne teknikken gjør det mulig å vurdere epitel-mesenchymale celle interaksjoner i en 3D-innstillingen uten behov for en syntetisk eller fremmed matriks med den eneste ulempe er den lengre tid som kreves for å frembringe den opprinnelige matrise. Her beskriver vi anvendelse av denne teknikk for å vurdere evnen til en enkelt molekyl uttrykt av fibroblaster, kollagen type VII, for å hemme tumorcelle invasjon.
Introduction
Bruken av biomateriale i 3D vevskultur har gjort det mulig forskere for å studere oppførselen celle i laboratoriet under fysiologiske betingelser mer beslektet med en in vivo miljø enn en rekapitulert med 2D-adhesjon og en plast-substrat. Spesielt store fremskritt fremover har blitt gjort i modellering stratifisert epitel med innføringen av 3D-kultur metoder på luft-væske-grensesnittet 1-4. Slike teknikker trofast etterligne keratinocyte differensiering og svulst celle invasjon muliggjør større fleksibilitet og troskap for forskere som studerer disse prosessene. Valget av biomateriale substrat å etterligne stromal miljøet har primært involvert bruk av type I kollagen, Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrix og de-epidermized dermis. For eksempel har kreftassosierte fibroblaster vist seg å bidra til kreft invasjon 5, initiering og progresjon via stromal-epitel interaksjoner 6,7 When vokst i slike underlag.
Gullstandarden for ligne stromal miljøet i huden, de største og mest studerte stratifisert epitel ved hjelp av slike teknikker, regnes for å være de-epidermized menneskelige dermis (DED). Fremstilling av DED omfatter fjerning av overhuden via trypsinering eller fysisk disassociation fra humant kadaver skin 3,4. Men, kan tilgang til slik hud være svært vanskelig for laboratorier ikke forbundet med kliniske institusjoner, og syke dermis er nær umulig å oppnå. Som et alternativ, laboratorier ofte bruke en kombinasjon av type I kollagen (isolert fra rottehaler) og / eller Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrise.
Etter oppdagelsen i 1927 av Nageotte 8 at kollagen kan lett bli isolert ved hjelp av eddiksyre og salt nedbør, ble sin søknad til vev kultur senere utviklet av Huzella og kolleger ni. Kollagen belegg viste seg å være bedre enn glass for cellekultur av 29 stammer og vev eksplantater som forhørt av Ehrmann og Gey ni. For tiden, er den større type av kollagen benyttes i vevskultur isolert fra rotte-hale sener, og er vanligvis kjøpes fra kommersielle kilder. Imidlertid er ulempen for trofast substrat gjentagelse er at rottehale kollagen ikke er identisk med humant kollagen, eller de humane dermis, hvor type I-og III-kollagen er tilstede som hoved-bestanddeler, og isolert rottehale kollagen er alltid fragmentert.
Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrise er en geléaktig protein blanding utskilt av dyrkede Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom celler 10. De viktigste bestanddelene er laminin, type IV kollagen, heparin sulfat proteoglycan, entactin og nidogen og de eksakte prosenter av disse proteinene vil variere fra parti til parti. Bortsett fra strukturelle proproteiner, inneholder denne matrisen også signifikante nivåer av vekstfaktorer slik som transformerende vekstfaktor β, epidermal vekstfaktor, insulin-lignende vekstfaktor-1, bovin fibroblast vekstfaktor og blodplateavledet vekstfaktor som ville endre cellulære oppførselen 11,12. Peker mot selve kompleksiteten i Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrise, ble totalt 1851 proteiner identifisert i en fersk proteomikk studie 13. I lys av den rike og komplekse natur av denne matrisen, har forsiktig blitt informert når tolke og sammenligne ulike eksperimenter med bruk av det 11.
Våre laboratorier har en interesse i genetiske hudsykdommer, særlig de med en predisposisjon for utvikling av cutaneous plateepitelkarsinom (CSCC) 14. I tilfelle av recessive dystrofe Epidermolysis bullosa (RDEB), en alvorlig blemmer sykdom med germline mutasjoner i COL7A1 genet
I denne utredningen trinnene som brukes til å rekapitulere den cutaneous svulst stromal mikromiljøet (native matrise) stammer direkte fra primær stromal fibroblaster in vitro er beskrevet 18. Native matriser produced ved langtidskultur av fibroblaster ble anvendt som en dermal ekvivalent med assay for CSCC celle invasjon. Vi presentere data ved hjelp av innfødte matrise stammer enten fra den ekstracellulære matrise utskilt av RDEB fibroblaster (mangelfull i type VII kollagen (C7)) eller fra RDEB fibroblaster retrovirally transduserte med en type VII kollagen uttrykke konstruere og demonstrere den dype effekten av en enkelt kollagen på tumor celle invasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøkelsen ble gjennomført i henhold til Helsinkideklarasjonen Prinsipper og ble godkjent av de relevante etiske komiteer.
En. Utarbeidelse av Media og reagenser
- Fremstilling av 200x av L-askorbinsyre 2-fosfat lager
- Oppløs 29 mg av L-askorbinsyre 2-fosfat pr 5 ml av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM)-løsning og filtreres gjennom 0,22 um membranfilter. Lagre som 0,25 ml sterile alikvoter i -20 ° C.
- Til 0,25 ml alikvot av 200x L-askorbinsyre 2-fosfat lager til hver 50 ml fibroblast medium (DMEM med 1% L-glutamin og 10% føtalt bovint serum) på dagen som er påkrevet for en endelig konsentrasjon på 0,1 mM L -askorbinsyre 2-fosfat.
- Utarbeidelse av keratinocyte vekstmedier
- Isolering og kultur av primære SCC keratinocytter er blitt beskrevet tidligere 21. Utarbeidelse av keratinocyte vekstmedier er beskrevetderi også.
- Kort, forberede mediene som følger:
300 ml DMEM og 100 ml av Hams F-12 supplert med 10% FBS
0,4 mg / ml hydrokortison
5 mg / ml insulin
10 ng / ml EGF
5 mg / ml transferrin
8,4 ng / ml koleratoksin
13 ng / ml liothyronine
1x penicillin-streptomycin løsning
2. In Vitro Bygging av fibroblast-avledet Native Matrix i L-Ascorbic Acid 2-Phosphate supplert Media
- Seed 200000 fibroblaster per brønn i 6-brønners plater (20 000 celler / cm 2) i fibroblast media supplert med L-askorbinsyre 2-fosfat. Refeed hver 2-3 dager med 2-5 ml av media. (Merk: refeeding frekvens og volum kan justeres for å passe til de individuelle behovene til ulike celler Se "diskusjoner".).
- Et tykt lag av celler innleiret i ekstracellulær matriks danner ved slutten av 6 uker, synlig for det blotte øye (
- La den opprinnelige matrisen flyte og oppussing for 5 dager, skiftende medie hver 2-3 dager. Med hensyn til strekkstyrke og egen ombygging innenfor matrisen, vil grunnmassen trekke seg sammen og bli drastisk redusert til en mindre, men tykkere opprinnelige matrise, og er klar til å bli utnyttet for invasjon assay.
Tre. Invasion analysen med Tumor SCC Keratinocytter
- Plukk opp den opprinnelige matrisen forsiktig med butt pinsett og overføre til Nylon nett. Gang på Nylon nett, spre matrisen forsiktig å ligge så flatt som mulig ved hjelp av en 1 ml micropipettetips og sløv tang.
- Forbered sterile clonal sylindere ved å smøre en liten mengde sterilt vaselin på den ene enden.
- Plasser de klonale sylindere på den opprinnelige matrise, med vaselin siden ned. Dette er for å sikre en tett forsegling mellom den opprinnelige matrise og de klonale ringene.
- Legg CSCC celler til de klonale sylindere (250,000 celler i 100 ul av keratinocytt vekstmedier).
- Fjern clonal sylindere etter seks timer når CSCC celler har slått seg ned på den opprinnelige matrisen.
- Løft Nylon nett med de innfødte matrise og CSCC celler til luft-væske-grensesnittet på bøyd rustfritt stål netting støtte.
- Legg keratinocytt vekstmedier supplert med askorbinsyre til medienivået i berøring med bunnen av den opprinnelige matrise.
- Endre media hver 2-3 dager og innhøsting på 7 og 14 dager etter såing av CSCC celler.
4. Høsting av 3D Cultures og klargjøring for histologi
- Fix i 4% pariaformaldehyde over natten i romtemperatur.
- Halvere prøvene og bygge inn i voks for formalinfiksert parafin innebygde blokker, med snittflaten vendt utover.
- Alternativt bygge inn bisected prøvene i oktober og hurtigfrys umiddelbart i flytende nitrogen for Dypfryst vevsblokker.
- Skjær fire mikrometer seksjoner på Mikrotomen og dewax (om nødvendig). Flekk bruker standard haematoxylin og eosin. For å visualisere de CSCC celler, muse monoklonalt antistoff mot keratin 14 (LL001, in-house) kan brukes i immunohistologi farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne teknikken åpner opp muligheten for å undersøke og å sammenlikne den invasive oppførsel av tumorceller (i dette tilfelle CSCC) under forskjellige 3D stromale miljøer. Ved hjelp av denne teknikken, kan ikke bare C7-mangel innfødte matriser som recapitulated den RDEB dermal miljøet bli generert, men også flere matriser som er genmodifisert til å over-uttrykke C7 18. Som vist i figur 2, invasjon av RDEB CSCC keratinocytter var betydelig retardert i C7-overekspresjon innfødte matriser i forhold til C7-mangel RDEB kontroll. Denne invasjonen visualiseres via standard histologiske metoder, der gels ble løst, innebygd i parafinblokker og deretter seksjonert og immunostained. Forslag antistoffer til å bruke til farging er anti-keratin 14 (LL001) for CSCC celler og anti-vimentin (V9) for fibroblaster.
p_upload/51321/51321fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Arbeidsflyt for generering av fibroblast-avledet innfødte matrise og svulsten invasjonen analysen. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Keratin 14 (LL001) farging av CSCC invasjonen i den innfødte matrise avledet fra kontroll RDEB fibroblast mangelfull i C7 (ai & bi), eller i RDEB fibroblaster over-uttrykke full lengde C7 uttrykk (aIIe og BII), viser tydelig at re-uttrykk for C7 i ekstracellulære matrise kan forsinke CSCC keratinocyte invasjon. Nuclei var farget med DAPI (i blått) og fibroblaster med vimentin (i grønt) i bi og BII.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av arten av dette forsøk, kan den totale tid som kreves for fullføring være opp til to måneder. I løpet av denne tiden må ytterste forsiktighet og sterile vevskultur fremgangsmåter anvendes for å forhindre mikrobiell forurensning.
I tillegg til sin rolle som en kofaktor i syntesen av hydroksyprolin og hydroksylysin av kollagen, stimulerer askorbinsyre kollagenspesifikke mRNA ekspresjon i fibroblaster 22. Den askorbinsyre valg her er den mer stabile L-askorbinsyre 2-fosfat 23. Refeeding tilrådes tre ganger i uken, men dette vil alltid være avhengig av at cellene blir studert. De innledende fibroblastkulturer vil forbruke mer næringsstoffer som ukene går, og hyppigere refeeding med større medievolum kan være tilrådelig. Det er viktig å være forsiktig når skiftende media og omsorg bør tas for å minimere forstyrrelser til cellelaget i løpet av innfødte matrise produksjon.
Matrisen skal bli synlige vanligvis etter 2 uker, spesielt rundt omkretsen av brønnen. Sjelden, vil matrisen frigjøre seg selv uten mekanisk avbrudd. Dette er en refleksjon av den iboende remodellering av matrisen og strekkstyrke, noe som trekker grunnmassen innover, men kan også være et tegn på at omkretsen av det opprinnelige matrise ble forstyrret under media endringer.
Når du slipper og frigjøre matrisen celle laget fra platen, må man være forsiktig med å stikke hull gjennom matrisen. Små sløv celle skraper kan også brukes i stedet for en ml mikropipette tips. Plassering av de frigitte opprinnelige matrise på en nylon mesh første (være sikker på å legge den opprinnelige matrise flat) gir mye enklere håndtering og etterfølgende løfting til den luft-væske-grensesnittet.
Denne protokollen er den første til å beskriveved bruk av nativt fibroblast matriks som en dermal substrat for å modellere mikromiljøet i tumor celle-analyser for å oppnå mer nøyaktige og fysiologisk relevante dataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
APS er støttet av Debra International og British Skin Foundation. YZN støttes av A * STAR - University of Dundee Partner PhD-programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- BD Biosciences - Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from: http://SPC-356230 Rev 5.0 Forthcoming.
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , Forthcoming.
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
