Summary
L'ingénierie tissulaire natif matrice dérivé des fibroblastes est un nouvel outil pour générer un substrat du stroma qui supporte la prolifération cellulaire et la différenciation epitheliale. Voici un protocole application de cette méthodologie pour évaluer l'impact de différents types de cellules stromales de la biologie des cellules tumorales est présenté.
Abstract
Cultures organotypiques 3D des cellules épithéliales sur une matrice incorporée avec les cellules mésenchymateuses sont largement utilisés pour étudier la différenciation des cellules epitheliales et l'invasion. Type de queue de rat collagène et / ou de la matrice dérivée de cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm ont été traditionnellement utilisé comme substrats pour modéliser la matrice ou stromale microenvironnement dans lequel les cellules mésenchymateuses (fibroblastes en général) sont remplies. Bien que des expériences à l'aide de ces matrices sont très instructifs, on peut affirmer qu'en raison d'une présence dominante d'une seule protéine (comme en collagène de type I) ou une teneur élevée en sous-sol composants de la membrane et des facteurs de croissance (tels que dans la matrice dérivée de la souris des cellules de sarcome), ces substrats ne reflètent pas la meilleure contribution de composition de matrice faite par les cellules stromales eux-mêmes. Pour étudier matrices indigènes produites par les fibroblastes dermiques primaires isolées de patients avec une tumeur sujettes, trouble génétique cloques (dystrophique récessiveépidermolyse bulleuse), nous avons adapté un protocole de matrice native existante pour étudier l'invasion des cellules tumorales. Les fibroblastes sont induites à produire leur propre matrice sur une période prolongée dans la culture. Cette matrice native est ensuite détaché de la boîte de culture et les cellules épithéliales sont ensemencés sur elle avant que l'ensemble de co-culture est portée à l'interface air-liquide. Différenciation et / ou l'invasion cellulaire peuvent ensuite être évaluées au cours du temps. Cette technique permet d'évaluer les interactions des cellules épithéliales-mésenchymateuses dans un environnement 3D sans la nécessité d'une matrice synthétique ou étrangère avec le seul inconvénient étant le laps de temps prolongé requis pour produire la matrice native. Nous décrivons ici l'application de cette technique pour évaluer la capacité d'une seule molécule exprimée par les fibroblastes, le collagène de type VII, d'inhiber l'invasion des cellules tumorales.
Introduction
L'utilisation d'un biomatériau dans une culture de tissu en 3D a permis aux chercheurs d'étudier le comportement des cellules dans le laboratoire dans des conditions physiologiques plus semblables à un environnement in vivo que celle de l'adhérence avec une récapitulé 2D et un substrat en matière plastique. En particulier, de grands progrès ont été réalisés dans la modélisation épithéliums stratifiés avec l'adoption de méthodes de culture 3D à l'interface air-liquide 1-4. De telles techniques imitent fidèlement la différenciation des kératinocytes et l'invasion des cellules tumorales permettant une plus grande souplesse et la fidélité pour les chercheurs étudiant ces processus. Le choix du substrat biomatériau pour imiter l'environnement stromal a principalement impliqué l'utilisation de collagène de type I, Engelbreth-Holm-Swarm matrice de sarcome de la souris et du derme dé-epidermized. Par exemple, les fibroblastes associés au cancer ont été montrés pour contribuer à l'invasion de cancer 5, l'initiation et la progression par l'intermédiaire d'interactions de stroma-épithéliales 6,7 WHEn grandi dans ces substrats.
L'étalon-or pour mimer l'environnement stromal dans la peau, les plus grandes et les plus étudiés épithéliums stratifiés à l'aide de ces techniques, est considéré être dé-epidermized derme humain (DED). Préparation du DED implique la suppression de l'épiderme par traitement à la trypsine ou la dissociation physique de cadavre 3,4 de la peau humaine. Toutefois, l'accès à cette peau peut être très difficile pour les laboratoires ne sont pas associés avec des institutions cliniques, et derme malades est presque impossible à obtenir. Comme alternative, les laboratoires utilisent souvent une combinaison de collagène de type I (isolé à partir de queues de rat) et / ou matrice de sarcome Engelbreth-Holm-Swarm souris.
Après la découverte en 1927 par Nageotte 8 que le collagène peut facilement être isolé en utilisant de l'acide acétique et la précipitation de sel, son application à la culture de tissu a ensuite été lancée par Huzella et ses collègues 9. revêtement de collagène s'est révélée être supérieure à celle du verre pour la culture de cellules souches et de 29 explants de tissus comme interrogés par Ehrmann Gey et 9. Actuellement, le principal type de collagène utilisé dans la culture de tissu est isolé à partir de tendons de queue de rat, et est généralement acheté auprès de sources commerciales. Cependant, l'inconvénient de fidèles substrat récapitulation est que le collagène de queue de rat n'est pas identique au collagène humain, ou du derme humain, où le type III collagènes I et sont présents comme constituants principaux, et isolé de queue de rat collagène est toujours fragmenté.
Engelbreth-Holm-Swarm matrice de sarcome de souris est un mélange de protéines gélatineuse sécrétée par les cellules de sarcome de souris en culture Engelbreth-Holm-Swarm 10. Les principaux constituants sont la laminine, collagène de type IV, le sulfate d'héparine protéoglycanes, entactine et nidogène et les rapports exacts de ces protéines peuvent varier d'un lot à l'. Mis à part pro structurelleprotéines, cette matrice contient également des niveaux significatifs de facteurs de croissance tels que la transformation de β du facteur de croissance, facteur de croissance épidermique, de l'insuline-like growth factor 1, bovin facteur de croissance des fibroblastes, et le facteur de croissance dérivé des plaquettes qui pourrait altérer le comportement cellulaire 11,12. Pointant vers la complexité de Engelbreth-Holm-Swarm matrice de sarcome de la souris, un total de 1 851 protéines ont été identifiées dans une étude protéomique récente 13. Compte tenu de la nature riche et complexe de cette matrice, la prudence a été informé lors de l'interprétation et la comparaison des différentes expériences avec l'utilisation de celui-ci 11.
Nos laboratoires ont un vif intérêt dans les maladies génétiques de la peau, en particulier ceux qui ont une prédisposition à développer un cancer cutané spinocellulaire (SCLC) 14. Dans le cas d'récessif bulleuse dystrophique épidermolyse (de EBDR), une maladie grave avec cloques mutations germinales dans le gène COL7A1
Dans ce document, les étapes à suivre pour récapituler cutané micro-environnement stromal de la tumeur (matrice native) proviennent directement des fibroblastes du stroma primaires in vitro sont décrits 18. Matrices autochtones produit par culture à long terme des fibroblastes ont été utilisés comme un équivalent dermique de dosage pour l'invasion des cellules SCLC. Nous présentons des données utilisant la matrice native issus soit de la matrice extracellulaire sécrétée par les fibroblastes EBDR (déficientes en collagène de type VII (C7)) ou à partir de fibroblastes de EBDR rétrovirale transduites avec un collagène de type VII construction exprimant et de démontrer l'effet profond d'une seule collagène sur la tumeur l'invasion des cellules.
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Protocol
Cette étude a été réalisée conformément à la Déclaration de principes d'Helsinki et a été approuvé par les comités d'éthique appropriés.
Une. Préparation des milieux et réactifs
- Préparation de 200x de L-ascorbique 2-phosphate actions
- Dissoudre 29 mg de L-acide ascorbique-2-phosphate par 5 ml de milieu Eagle modifié de (DMEM) la solution de Dulbecco et filtrer sur filtre de 0,22 um de la membrane. Magasin de 0,25 ml aliquotes stériles -20 ° C.
- Ajouter 0,25 ml aliquote de 200x acide L-ascorbique-2-phosphate magasin pour chaque 50 ml de milieu de fibroblastes (DMEM avec 1% de L-glutamine et du sérum bovin foetal à 10%) le jour nécessaire, pour une concentration finale de 0,1 mM de L acide ascorbique-2-phosphate.
- Préparation des milieux de croissance des kératinocytes
- Isolement et culture des kératinocytes primaires du CCN ont été décrits précédemment 21. Préparation des milieux de croissance des kératinocytes est décritey ainsi.
- En bref, préparer les médias comme suit:
300 ml de DMEM et 100 ml de Ham F-12 supplémenté avec 10% de FBS
0,4 mg / ml d'hydrocortisone
5 mg / ml d'insuline
10 ng / ml d'EGF
5 mg / ml de transferrine
8,4 ng / ml de toxine cholérique
13 ng / ml liothyronine
Solution de pénicilline-streptomycine 1x
2. Construction in vitro de fibroblastes dérivés matrice maternelle en acide L-ascorbique 2-phosphate Supplement médias
- Semences 200000 fibroblastes par puits dans des plaques à 6 puits (20 000 cellules / cm 2) dans un milieu supplémenté avec de fibroblastes de l'acide L-ascorbique-2-phosphate. Réinsérez tous les 2-3 jours avec 2-5 ml de milieu. (Remarque: La réalimentation de la fréquence et le volume peuvent être ajustés pour répondre aux besoins individuels des différentes cellules Voir "Discussions".).
- Une épaisse couche de cellules incluses dans la matrice extracellulaire se formera à la fin de 6 semaines, visibles à l'œil nu (
- Soit la matrice native flotteur et remodeler pendant 5 jours, l'évolution des médias tous les 2-3 jours. En raison de la résistance à la traction et le remodelage intrinsèque à l'intérieur de la matrice, la matrice se contracte et devient considérablement réduite à une matrice native plus petit, mais plus épaisse, et est prêt à être utilisé pour le dosage d'invasion.
3. Invasion analyse avec tumeur CSC kératinocytes
- Ramassez la matrice native délicatement avec une pince émoussée et transfert à Nylon net. Une fois sur le net en nylon, propager la matrice doucement pour mentir aussi plate que possible en utilisant un 1 ml micropipettepointe et le forceps émoussé.
- Préparer les cylindres de clones stériles en étalant une petite quantité de vaseline stérile sur une extrémité.
- Placez les cylindres de clones sur la matrice d'origine, avec le côté de la vaseline bas. Cela permet d'assurer un joint étanche entre la matrice et les anneaux native clonales.
- Ajouter cellules SCLC aux cylindres clonales (250 000 cellules dans 100 ul de milieu de croissance des kératinocytes).
- Retirez les cylindres clonales après 6 heures lorsque les cellules SCLC se sont installés sur la matrice maternelle.
- Soulevez le net en nylon avec la matrice maternelle et cellules SCLC à l'interface air-liquide sur support plié en treillis métallique en acier inoxydable.
- Ajouter un média de croissance de kératinocytes, complétée avec de l'acide ascorbique jusqu'à ce que le niveau de support touche le fond de la matrice native.
- Changer de support tous les 2-3 jours et la récolte à 7 et 14 jours après ensemencement des cellules SCLC.
4. La récolte des cultures 3D et préparation pour histologie
- Fixer dans 4% paraformaldehyde pendant une nuit à température ambiante.
- Bissecter les échantillons et les incorporer dans la cire de paraffine pour fixés au formol blocs embarqués, avec la surface coupée à l'extérieur.
- Sinon, incorporer les échantillons bissectés dans l'OCT et enclenchez-gel immédiatement dans de l'azote liquide pour les blocs de tissus congelés frais.
- Couper 4 sections um sur microtome et déparaffinage (si nécessaire). Colorer à l'aide de l'hématoxyline et de l'éosine norme. Pour visualiser les cellules SCLC, anticorps monoclonal de souris contre la kératine 14 (LL001, en interne) peut être utilisé en immunohistochimie coloration.
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Representative Results
Cette technique ouvre la possibilité d'examiner et de comparer le comportement invasif des cellules tumorales (dans ce cas SCLC) sous différents environnements stromales 3D. En utilisant cette technique, non seulement des matrices indigènes C7-déficientes que récapitulées l'environnement EBDR cutanée peuvent être générés, mais aussi des matrices supplémentaires qui ont été génétiquement modifiées pour surexprimer C7 18. Comme le montre la figure 2, l'invasion des kératinocytes EBDR SCLC était significativement retardé en C7-surexprimant matrices indigènes par rapport au contrôle de EBDR C7-déficient. Cette invasion est visualisé par des méthodes histologiques standard, où les gels ont été fixés, incorporés dans des blocs de paraffine et sectionnés et immunocolorées. Anticorps suggéré d'utiliser pour la coloration sont anti-kératine 14 (LL001) pour les cellules SCLC et anti-vimentine (V9) pour les fibroblastes.
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Figure 1. Flux de travail de génération de matrice native dérivé des fibroblastes et le dosage de l'invasion tumorale. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Kératine 14 (LL001) coloration de l'invasion de la SCLC dans la matrice maternelle dérivé de contrôle EBDR fibroblastes déficients en C7 (ai et bi), ou dans des fibroblastes de EBDR, démontre clairement sur-exprimant expression C7 pleine longueur (aii et bii) que le ré-expression de C7 dans la matrice extracellulaire peut retarder SCLC invasion des kératinocytes. noyaux ont été marqués au DAPI (en bleu) et des fibroblastes avec la vimentine (en vert) en bi et bii.
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Discussion
En raison de la nature de cette expérience, le temps total nécessaire pour l'achèvement peut être jusqu'à deux mois. Pendant tout ce temps, les pratiques de culture de soins et de tissus stérile maximum doivent être utilisés pour prévenir la contamination microbienne.
En plus de son rôle en tant que cofacteur dans la synthèse de l'hydroxyproline et de l'hydroxylysine des collagènes, de l'acide ascorbique stimule l'expression d'ARNm du collagène spécifique dans des fibroblastes 22. L'acide ascorbique de choix ici est la plus stable de l'acide L-ascorbique-2-phosphate 23. Réalimentation est conseillé trois fois par semaine, mais ce sera toujours dépendre des cellules étudiées. Les cultures de fibroblastes initiales consomment plus de nutriments que les semaines passent, et la réalimentation plus fréquents avec de plus grands volumes de médias peuvent être utiles. Il est important d'être doux quand l'évolution des médias et des précautions doivent être prises pour minimiser les perturbations de la couche de cellules lors de la production de la matrice maternelle.
La matrice doit devenir visible en général, après 2 semaines, en particulier autour de la circonférence du puits. Rarement, la matrice se libérer sans aucune perturbation mécanique. C'est un reflet de la rénovation intrinsèque de la matrice et résistance à la traction, ce qui tire vers l'intérieur de la matrice, mais peut aussi être un signe que la circonférence de la matrice maternelle a été perturbé pendant les changements de supports.
Lorsque libérer des la couche de cellules de la matrice de la plaque, il faut veiller à ne pas faire des trous à travers la matrice. Petits grattoirs de cellules émoussées peuvent également être utilisés à la place de 1 ml conseils micropipette. Placement de la matrice native publié sur un filet de nylon premier (en étant sûr de mettre la matrice native plat) permet un maniement beaucoup plus facile et levée ultérieure à l'interface air-liquide.
Ce protocole est le premier à décrirel'utilisation de la matrice de fibroblastes natif comme un substrat dermique pour modéliser le micro-environnement dans des dosages de cellules tumorales, afin d'obtenir des données plus précises et physiologiquement pertinentes.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
APS est soutenu par DebRA la British Skin Foundation International et. Yzn est soutenu par A * STAR - Université de PhD Programme de partenariat Dundee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
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