Summary
Ingegneria tessutale fibroblasti derivati da matrice nativa è uno strumento emergente per generare un substrato stromale che supporta la proliferazione delle cellule epiteliali e differenziazione. Ecco un protocollo di applicazione di tale metodologia per valutare l'impatto dei diversi tipi di cellule stromali sulla biologia delle cellule tumorali è presentato.
Abstract
Colture organotipiche 3D di cellule epiteliali su una matrice incorporata con cellule mesenchimali sono ampiamente utilizzati per studiare la differenziazione delle cellule epiteliali e invasione. Tipo di coda di ratto collagene e / o matrice derivata da cellule topo sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm è stato tradizionalmente impiegato come substrati per modellare il microambiente stromale o matrice in cui le cellule mesenchimali (di solito fibroblasti) sono popolate. Sebbene esperimenti utilizzando tali matrici sono molto informativo, si può affermare che a causa di una presenza prevalente di una singola proteina (come nel collagene tipo I) o un alto contenuto di componenti della membrana basale e fattori di crescita (come in matrice derivata da topo cellule di sarcoma), questi substrati non meglio riflettono il contributo alla composizione della matrice fatta dalle stesse cellule stromali. Per studiare matrici native prodotte da fibroblasti dermici primari isolati da pazienti con un tumore prona, vesciche disordine genetico (distrofica recessivaepidermolisi bollosa), abbiamo adattato un protocollo matrice originaria esistente per studiare l'invasione delle cellule tumorali. I fibroblasti sono indotte a produrre la propria matrice per un periodo prolungato in coltura. Questa matrice nativa viene poi staccato dal piatto di coltura e le cellule epiteliali vengono seminate su di esso prima che l'intera co-coltura viene generato all'interfaccia aria-liquido. Differenziazione e / o invasione cellulare possono essere valutati nel tempo. Questa tecnica consente di valutare le interazioni delle cellule epiteliali-mesenchimali in un ambiente 3D senza la necessità di una matrice sintetica o estere con l'unico svantaggio è il periodo prolungato di tempo richiesto per produrre la matrice nativa. Qui si descrive l'applicazione di questa tecnica per valutare la capacità di una singola molecola espressa dai fibroblasti, collagene tipo VII, di inibire l'invasione delle cellule tumorali.
Introduction
L'uso di biomateriale in coltura tissutale 3D ha permesso ai ricercatori di studiare il comportamento delle cellule in laboratorio in condizioni fisiologiche più simile ad un ambiente in vivo di quella di una ricapitolato con adesione 2D e un substrato di plastica. In particolare, grandi passi avanti sono stati fatti nella modellazione epiteli stratificati con l'adozione di metodi di coltura 3D all'interfaccia aria-liquido 1-4. Tali tecniche fedelmente imitare differenziazione dei cheratinociti e l'invasione delle cellule tumorali consentendo una maggiore flessibilità e fedeltà per i ricercatori che studiano questi processi. La scelta del substrato biomateriale per simulare l'ambiente stromale ha principalmente comportato l'uso di collagene di tipo I, Engelbreth-Holm-Swarm topo matrice sarcoma e derma de-epidermized. Ad esempio, fibroblasti cancro-associate hanno dimostrato di contribuire verso invasione cancro 5, iniziazione e progressione attraverso interazioni stroma-epiteliale 6,7 when coltivato in tali substrati.
Il gold standard per mimare l'ambiente stromale in pelle, più grandi e più studiati epiteli stratificati utilizzando tali tecniche, è considerato di essere de-epidermized derma umano (DED). Preparazione del DED comporta la rimozione dell'epidermide mediante tripsinizzazione o dissociazione fisica dalla pelle 3,4 cadavere umano. Tuttavia, l'accesso a tali pelle può essere molto difficile per i laboratori non connessi con le istituzioni cliniche e derma malati è quasi impossibile da ottenere. In alternativa, laboratori utilizzano frequentemente una combinazione di collagene di tipo I (isolato da code di ratto) e / o la matrice del mouse Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma.
Dopo la scoperta nel 1927 da Nageotte 8 che il collagene può essere facilmente isolato con acido acetico e precipitazione di sali, la sua applicazione alla coltura di tessuti è stata successivamente lanciato da Huzella e colleghi 9. Rivestimento di collagene ha dimostrato di essere superiore al vetro per coltura cellulare di 29 ceppi e espianti di tessuto come interrogati dai Ehrmann e Gey 9. Attualmente, il principale tipo di collagene utilizzato in coltura tissutale è isolato da tendini ratto-coda, ed è solitamente acquistato da fonti commerciali. Tuttavia, lo svantaggio di fedeli substrato ricapitolazione è che il collagene ratto coda non è identico al collagene umano, o il derma umano, dove tipo I e III collageni sono presenti come costituenti principali, e isolato di ratto coda collagene è invariabilmente frammentato.
Engelbreth-Holm-Swarm matrice del mouse sarcoma è una miscela proteica gelatinosa secreta dalle colture Engelbreth-Holm-Swarm cellule di topo sarcoma 10. I principali componenti sono laminina, collagene di tipo IV, eparina solfato proteoglicani, entactin e nidogen e le esatte rapporti di queste proteine possono variare da lotto a lotto. Oltre a pro strutturaleproteine, questa matrice contiene anche significativi livelli di fattori di crescita come trasformare β fattore di crescita, fattore di crescita epidermico, insulin-like growth factor 1, bovini fattore di crescita dei fibroblasti, e fattore di crescita derivato dalle piastrine che altererebbe comportamento cellulare 11,12. Che punta verso la complessità del Engelbreth-Holm-Swarm matrice del mouse sarcoma, per un totale di 1851 proteine sono stati identificati in un recente studio di proteomica 13. Alla luce della natura ricca e complessa di questa matrice, la cautela è stata informata quando interpretano e confronto diverse esperienze con l'uso di esso 11.
I nostri laboratori hanno un forte interesse per le malattie genetiche della pelle, in particolare quelli con una predisposizione a sviluppare un carcinoma cutaneo a cellule squamose (CSCC) 14. Nel caso di epidermolisi bollosa distrofica recessiva (RDEB), una grave malattia vesciche con mutazioni germinali del gene COL7A1
In questo lavoro i passaggi utilizzati per riepilogare il microambiente cutaneo tumore stromale (matrice nativa) desunte direttamente dai fibroblasti stromali primarie in vitro sono descritti 18. Matrici Native produced da coltura a lungo termine di fibroblasti sono stati utilizzati come dermico equivalente al saggio per l'invasione delle cellule CSCC. Vi presentiamo i dati utilizzando matrice nativa derivata sia dalla matrice extracellulare secreta dai fibroblasti RDEB (deficit di tipo VII collagene (C7)) o da fibroblasti RDEB retrovirally trasdotte con un tipo di collagene VII esprimere costruire e dimostrare l'effetto profondo di un singolo collagene su tumore invasione delle cellule.
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Protocol
Questo studio è stato condotto secondo la Dichiarazione di Helsinki Principi ed è stato approvato dai comitati etici competenti.
1. Preparazione dei Media e reagenti
- Preparazione di 200x di acido L-ascorbico 2-fosfato magazzino
- Sciogliere 29 mg di acido L-ascorbico 2-fosfato per 5 ml di soluzione di Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM) e filtrare attraverso filtro a membrana 0,22 micron. Store come 0,25 ml aliquote sterili -20 ° C.
- Aggiungere 0,25 ml un'aliquota di 200x acido L-ascorbico magazzino 2-fosfato per ogni 50 ml di mezzi di fibroblasti (DMEM con 1% di L-glutammina e siero bovino fetale al 10%) nel giorno richiesto, per una concentrazione finale di 0,1 mM di L -acido ascorbico 2-fosfato.
- Preparazione di terreni di crescita dei cheratinociti
- Isolamento e la coltura di cheratinociti SCC primarie sono state descritte in precedenza 21. Preparazione di terreni di crescita dei cheratinociti è descrittaivi pure.
- Brevemente, preparare il dispositivo come segue:
300 ml di DMEM e 100 ml di Ham F-12 supplementato con 10% FBS
0,4 mg / ml di idrocortisone
5 mg / ml di insulina
10 ng / ml EGF
5 mg / ml di transferrina
8.4 ng / ml di tossina del colera
13 ng / ml liothyronine
Soluzione di penicillina-streptomicina 1x
2. In Vitro Costruzione di fibroblasti derivati da Native Matrix in acido L-ascorbico 2-fosfato integrato multimediale
- Seed 200.000 fibroblasti per pozzetto in piastre da 6 pozzetti (20.000 cellule / cm 2) in mezzi di fibroblasti integrati con delle L-acido ascorbico 2-fosfato. Inserire di nuovo ogni 2-3 giorni con 2-5 ml di media. (Nota: Refeeding frequenza e il volume possono essere adattati per soddisfare le esigenze individuali di cellule diverse Vedere "Discussions".).
- Uno spesso strato di cellule incorporate in matrice extracellulare formerà alla fine di 6 settimane, visibili a occhio nudo (
- Lasciate che il galleggiante matrice nativa e rimodellare per 5 giorni, cambiando i media ogni 2-3 giorni. Grazie alla resistenza alla trazione e rimodellamento intrinseca all'interno della matrice, la matrice contrarre drasticamente e diventa ridotta ad un più piccolo, ma più spessa matrice nativa, ed è pronto per essere utilizzato per saggio di invasione.
3. Invasion Assay con tumore SCC cheratinociti
- Raccogliete la matrice nativa delicatamente con una pinza smussato e trasferimento in rete di nylon. Una volta in rete di nylon, si sviluppa la matrice delicatamente a mentire più piatta possibile utilizzando una micropipetta 1 mlpunta e pinza smussato.
- Preparare i cilindri clonali sterili spalmando una piccola quantità di vaselina sterile su un'estremità.
- Posizionare i cilindri clonali sulla matrice nativa, con il lato vaselina giù. Questo per garantire una tenuta stagna tra la matrice nativa e gli anelli clonali.
- Aggiungi cellule CSCC ai cilindri clonali (250.000 cellule in 100 microlitri di media di crescita dei cheratinociti).
- Rimuovere i cilindri clonali dopo 6 ore quando le cellule CSCC si sono stabiliti sulla matrice nativa.
- Sollevare la rete di nylon con la matrice originaria e le cellule CSCC all'interfaccia aria-liquido su piegati sostegno rete metallica in acciaio inox.
- Aggiungere terreni di coltura di cheratinociti addizionato con acido ascorbico fino al livello di media tocchi il fondo della matrice nativa.
- Cambiare i media ogni 2-3 giorni e la raccolta alle 7 e 14 giorni dopo la semina delle cellule CSCC.
4. La raccolta delle Culture 3D e preparazione per Istologia
- Fissare nel 4% parpernottamento aformaldehyde a temperatura ambiente.
- Bisecare i campioni e incorporare in cera di paraffina fissati in formalina blocchi incorporati, con la superficie di taglio verso l'esterno.
- In alternativa, incorporare i campioni bisecato in ottobre e snap-congelare immediatamente in azoto liquido per blocchi di tessuto congelati freschi.
- Tagliare 4 micron sezioni su microtomo e sparaffinatura (se necessario). Colorare con ematossilina standard ed eosina. Per visualizzare le cellule CSCC, anticorpo monoclonale di topo contro cheratina 14 (LL001, in casa) può essere utilizzato in immunoistologia colorazione.
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Representative Results
Questa tecnica apre la possibilità di esaminare e confrontare il comportamento invasivo di cellule tumorali (in questo caso CSCC) in differenti ambienti stromali 3D. Utilizzando questa tecnica, non solo le matrici native C7-deficienti che ricapitolato l'ambiente RDEB cutanea possono essere generati, ma anche matrici aggiuntivi che sono stati geneticamente modificati per over-esprimono C7 18. Come si vede nella figura 2, invasione di cheratinociti RDEB CSCC era significativamente ritardato in C7-sovraesprimenti matrici native rispetto al controllo RDEB C7-carenti. Questa invasione è visualizzato tramite metodi istologici standard, in cui sono stati fissati i gel, incorporati nei blocchi di paraffina e poi sezionati e immunostained. Anticorpi suggerito di usare per la colorazione sono anti-cheratina 14 (LL001) per celle CSCC e anti-vimentina (V9) per i fibroblasti.
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Figura 1. Flusso di lavoro di generazione di matrice nativa fibroblasti di derivazione e il saggio di invasione tumorale. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Cheratina 14 (LL001) colorazione dell'invasione CSCC nella matrice nativa derivata dal controllo RDEB fibroblasti carenti di C7 (ai e bi), o in fibroblasti RDEB sovra-espressione esprimere C7 full-length (AII e BII), dimostra chiaramente che il ri-espressione di C7 in matrice extracellulare può ritardare CSCC cheratinociti invasione. nuclei sono stati colorati con DAPI (in blu) e fibroblasti con vimentina (in verde) in bi e BII.
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Discussion
A causa della natura di questo esperimento, il tempo totale necessario per il completamento può essere fino a due mesi. In tutto questo tempo, di cura e del tessuto sterile necessità pratiche di coltura devono essere impiegati per prevenire la contaminazione microbica.
Oltre al suo ruolo come cofattore nella sintesi di idrossiprolina e idrossilisina di collagene, acido ascorbico stimola il collagene specifico mRNA in fibroblasti 22. L'acido ascorbico di scelta qui è il più stabile di acido L-ascorbico 2-fosfato 23. Refeeding consiglia tre volte alla settimana, ma questo sarà invariabilmente dipenderanno dalle cellule in fase di studio. Le colture di fibroblasti iniziali consumano più sostanze nutritive come le settimane passano, e rialimentazione più frequenti con volumi dei supporti più grandi possono essere consigliabile. E 'importante essere gentile quando devono essere prese cambiano i media e la cura per ridurre al minimo i disturbi allo strato di cellule durante la produzione di matrice nativa.
La matrice dovrebbe diventare visibile solito dopo 2 settimane, soprattutto intorno alla circonferenza del pozzo. Raramente, la matrice si libererà senza alcuna interruzione meccanica. Questo è un riflesso del rimodellamento intrinseca della matrice e resistenza alla trazione, che tira la matrice verso l'interno, ma può anche essere un segno che la circonferenza della matrice nativa stata disturbata durante cambiamenti dei media.
Quando rilasciare e liberare lo strato di cellule di matrice dalla piastra, bisogna stare attenti a non colpire i fori attraverso la matrice. Piccole ruspe cellulari contundenti possono essere utilizzati anche in sostituzione di 1 ml consigli micropipetta. Posizionamento della matrice nativa rilasciato su una maglia di nylon per primo (avendo cura di porre la matrice nativa piatto) rende la gestione molto più semplice e sollevamento successiva all'interfaccia aria-liquido.
Questo protocollo è il primo a descriverel'uso di matrice fibroblasti nativo come substrato dermico per modellare il microambiente in saggi cellulari tumorali per ottenere dati più precisi e fisiologicamente rilevanti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
APS è supportato da Debra International e la Fondazione britannica pelle. YZN è sostenuta da A * STAR - Università di Dundee partenariato Dottorato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
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