Summary
조직 공학 섬유 아세포 유래 기본 행렬은 상피 세포의 증식과 분화를 지원하는 기질 기판을 생성하는 새로운 도구입니다. 이곳에서 종양 세포 생물학에 다른 간질 세포 유형의 영향을 평가하기 위하여이 방법을 적용하는 프로토콜이 제시된다.
Abstract
중간 엽 세포를 포함하는 매트릭스에 상피 세포의 3 차원의 Organotypic 문화가 널리 상피 세포의 분화와 침략을 연구하는 데 사용됩니다. I 콜라겐 및 / 또는 Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종 세포에서 파생 된 매트릭스는 전통적으로 중간 엽 세포 (일반적으로 섬유 아세포) 채워지로 매트릭스 또는 기질 미세 환경을 모델링하는 기판으로 사용 된 쥐의 꼬리 타입. 이러한 행렬을 사용하여 실험이 매우 유익하지만, 그것은 주장 될 수 인해 (예 타입 I 콜라겐에서와 같이) 하나의 단백질 또는 기저막 성분과 같은 마우스로부터 유도 된 매트릭스와 같은 성장 인자 (높은 함량의 최우선 존재 육종 세포),이 기판은 가장 기질 세포 자체에 의해 매트릭스 조성에 기여를 반영하지 않습니다. 종양이 발생하기 쉬운 유전 적 물집 질환 (열성 이영 환자에서 분리 된 주요 피부 섬유 아 세포에 의해 생성 된 기본 행렬을 연구하는표피 박리증), 우리는 종양 세포의 침공을 연구하는 기존의 기본 매트릭스 프로토콜을 적용했다. 섬유 아 세포 배양에 오랜 기간 동안 자신의 행렬을 생성하도록 유도합니다. 이 기본 행렬은 다음 배양 접시로부터 분리되고 전체 공 배양은 공기 - 액체 계면에 발생하기 전에 상피 세포를 그것에 시딩. 세포 분화 및 / 또는 침입는 시간이 지남에 따라 평가 될 수있다. 이 기술은 유일한 단점은 기본 행렬을 생성하는 데 필요한 시간을 장시간 채로 합성 또는 외국 행렬에 대한 필요없이 3D 설정에서 상피 간엽 세포 상호 작용을 평가하는 능력을 제공한다. 여기에 우리가 종양 세포의 침윤을 억제하는 섬유 아 세포에 의해 표현 된 단일 분자의 기능, 유형 VII 콜라겐을 평가하는이 기술의 응용 프로그램을 설명합니다.
Introduction
3 차원 조직 배양에서 생체 물질의 사용은 2 차원 접착 및 플라스틱 기재로 효과적으로 요약 한보다 생체 내 환경에 더 가깝다 생리적 조건 하에서 실험실에서 세포 행동을 연구하는 연구자 사용할 수있다. 특히, 커다란 진보는 앞으로 공기 - 액체 인터페이스 1-4에서 3 차원 배양 방법의 도입으로 계층화 상피 세포를 모델링되었습니다. 이러한 기술은 충실하게 각질 세포 분화와 이러한 프로세스를 공부하는 연구자에 대한 유연성과 정확도를 가능하게 종양 세포 침입을 모방. 기질 환경을 모방하는 생체 재료 기판의 선택은 주로 I 콜라겐 유형, Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종 매트릭스와 디 epidermized 진피의 사용을 포함하고있다. 예를 들어, 암 관련 섬유 아 세포는 각막 상피 상호 작용 6,7를 통해 암 침공 5, 개시 및 진행에 기여하는 것으로 나타났다 갔지N 같은 기판에서 성장.
피부의 기질 환경을 흉내 낸위한 황금 표준은 이러한 기술을 사용하여 가장 크고 가장 널리 연구 층상 상피 세포는 인간의 진피 (DED)를 해제 epidermized 할 간주됩니다. DED의 제조는 인간 사체 피부 3,4에서 트립신 또는 물리적 탈퇴를 통해 표피의 제거를 포함한다. 그러나, 피부에 대한 접근은 임상 기관과 관련이없는 실험실을 위해 매우 어려울 수 있으며, 병 진피 얻을 거의 불가능하다. 대안으로, 실험실 자주 I 콜라겐 (쥐의 꼬리에서 분리) 및 / 또는 Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종 매트릭스 타입의 조합을 사용합니다.
그 콜라겐 8 Nageotte에 의해 1927 년 발견 쉽게 아세트산 염 침전을 이용하여 분리 할 수 있습니다 후, 조직 배양에의 응용은 이후 Huzel에 의해 개척되었다라와 동료 9. 콜라겐 코팅은 에르와 Gey 9 심문으로 29 균주 및 조직 절편의 세포 배양을위한 유리에 우수한 것으로 판명되었다. 현재 조직 배양에 사용되는 콜라겐의 주요 유형은 쥐 꼬리, 힘줄에서 고립되고, 일반적으로 상용 소스에서 구입한다. 그러나 충실한 기판 재현부의 단점은 쥐의 꼬리 콜라겐은 인간의 콜라겐, 또는 타입 I과 III 콜라겐이 주요 성분으로 존재하는 인간의 진피, 동일하지 않은, 고립 된 쥐의 꼬리 콜라겐은 변함없이 조각 것입니다.
Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종 행렬은 배양 Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종 세포 (10)에 의해 분비되는 젤라틴 단백질의 혼합물이다. 주요 성분은 라미닌, IV 형 콜라겐, 헤파린 황산 프로테오글리칸, entactin 및 nidogen하고이 단백질의 정확한 비율은 배치에서 배치에 따라 다를 것입니다. 이외에도 구조 프로에게에서teins,이 행렬은 또한 성장 인자 β, 표피 성장 인자, 인슐린 - 유사 성장 인자 1, 소 섬유 아세포 성장 인자, 및 셀룰러 동작 11,12을 변화시키는 혈소판 유래 성장 인자가 바뀌는 등의 성장 인자의 유의 수준을 포함한다. Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종 행렬의 깎아 지른듯한 복잡쪽으로 향하고, 1,851 단백질의 총 최근 프로테오믹스 연구 (13)에서 확인되었다. 해석하고 11의 사용으로 다른 실험을 비교할 때이 행렬의 풍부하고 복잡한 자연의 빛에주의 권고하고있다.
우리의 실험실은 유전 적 피부 질환, 피부 편평 상피 세포 암 (CSCC) 14을 개발하는 경향과 특히에 관심이 있습니다. 열성 이영의 표피 박리증 (RDEB), COL7A1 유전자의 생식 세포 돌연변이 심한 물집이 생기는 질병의 경우
본 논문에서는 피부 종양 기질 미세 환경 (기본 매트릭스)를 요점을 되풀이하는 데 사용되는 단계는 체외에서 기본 간질 섬유 아세포에서 직접 파생는 18에 설명되어 있습니다. 기본 행렬이 P섬유 아 세포의 장기 배양 roduced는 CSCC 세포 침입에 대한 분석에 해당하는 피부로 사용되었다. 우리는 (유형 VII 콜라겐 (C7) 결핍) RDEB 섬유 아세포 또는 retrovirally 종양의 단일 콜라겐의 깊은 효과를 생성하고 보여 표현하는 유형 VII 콜라겐 형질 RDEB 섬유 아세포에서 분비 세포 외 기질 중 하나에서 파생 된 기본 행렬을 사용하여 데이터를 제시 세포 침공.
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Protocol
이 연구는 헬싱키 원칙의 선언에 따라 수행하고 적절한 윤리위원회의 승인을 받았다.
1. 미디어 및 시약의 준비
- L-아스 코르 빈산 2 - 인산 주식의 200 배의 준비
- 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM) 용액 5 ㎖ 당 L-아스 코르 빈산 2 - 인산의 29 밀리그램을 녹이고 0.22 ㎛의 멤브레인 필터를 통해 필터링합니다. 상점 -20 ° C에서 0.25 ㎖의 멸균 분주로
- L의 0.1 ㎜의 최종 농도를 위해 필요한 일에 섬유 아세포 미디어 (1 % L-글루타민 및 10 % 소 태아 혈청 DMEM)의 각 50ml로 200X L-아스 코르 빈산 2 - 인산 재고 0.25 ㎖의 분취 량을 쓰 -아스 코르 빈산 2 - 인산.
- 각질 세포 성장 배지의 제조
- 기본 SCC 각질 세포의 분리 및 배양은 이전에 21 설명 하였다. 각질 세포 성장 배지의 제조가 기술되고내부뿐만 아니라.
- 다음과 같이 간단히, 미디어를 준비합니다
DMEM 300 ㎖ 및 10 % FBS로 보충 된 햄 F-12을 100 ㎖
0.4 ㎎ / ㎖의 하이드로 코티손
5 ㎎ / ㎖ 인슐린
10 NG / ML EGF
5 ㎎ / ㎖의 트랜스페린
8.4 NG / ML 콜레라 독소
13 NG / ML의 liothyronine
1X 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션
2. L-아스 코르 빈산 2 - 인산 보충 미디어에서 섬유 아세포 유래의 기본 매트릭스의 체외 건설
- 6 - 웰 플레이트 L-아스 코르 빈산 2 - 인산의 보충 섬유 아세포 미디어 (20,000 세포 / cm 2) 잘 당 종자 20 만 섬유 아세포. 미디어의 2-5 ㎖로 2-3 일마다 재 공급. (주 : 재 이송 주파수 및 음량은 다른 세포의 개별적인 필요에 맞게 조절 될 수있다 "토론"참조.).
- 세포 외 기질 (extracellular matrix)에 포함 된 세포의 두꺼운 층은 육안으로 볼 수 육주, (끝에 형성 할 것이다
- 기본 행렬 플로트하자 2-3 일마다 미디어를 변경, 5 일 동안 리모델링. 인해 인장 강도와 매트릭스 사이에 본질적인 개조, 행렬 크게 수축 작지만 두꺼운 기본 행렬로 축소되고, 침입 분석에 이용 될 준비가된다.
3. 종양 SCC 각질과 침략 분석
- 무딘 집게로 조심스럽게 기본 행렬을 들고 나일론 그물로 전송할 수 있습니다. 일단 나일론 그물에, 1 ㎖의 마이크로 피펫을 사용하여 가능한 한 평면 거짓말을 부드럽게 매트릭스를 확산팁과 무딘 집게.
- 한쪽 끝에서 멸균 바셀린 소량의 번짐에 의해 멸균 클론 실린더를 준비합니다.
- 아래 바셀린면, 네이티브 매트릭스 클론 실린더를 놓습니다. 이 기본 행렬과 클론 링이 단단히 밀착을 보장하는 것입니다.
- 클론 실린더 (각질 세포 성장 배지 100 μL에 25 셀)에 CSCC 세포를 추가합니다.
- CSCC 세포가 기본 행렬에 정착했을 때 6 시간 후 클론 실린더를 제거합니다.
- 각부 스테인리스 철망 지지체 위에 공기 - 액체 계면에 네이티브 매트릭스 및 CSCC 세포와 나일론 네트 리프트.
- 미디어 레벨이 기본 행렬의 바닥에 닿을 때까지 아스코르브 산 보충 된 각질 세포 성장 배지를 추가한다.
- 7시에 2-3 일마다 수확 미디어를 변경하고 CSCC 세포의 14 일 후 파종.
4. 3D 문화의 수확 및 조직학 준비
- 4 % 파에 수정실온에서 하룻밤 aformaldehyde.
- 절단 된면이 바깥쪽으로 향하도록 포르말린 고정 파라핀 블록 왁스 샘플 및 소스를 양분.
- 또는 OCT에서 양분 샘플을 포함하고 스냅 동결을 즉시 냉동 조직 블록에 대한 액체 질소에.
- 마이크로톰 및 왁스 제거에 4 μm의 섹션 (필요한 경우) 컷. 표준 헤 마톡 실린 및 에오신을 사용하여 얼룩. CSCC 세포를 시각화하기 위해, 케라틴 14 대한 마우스 단일 클론 항체 (LL001는 사내) immunohistology 염색에 사용될 수있다.
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Representative Results
이 기술은 검사 및 다른 3D 간질 환경 하에서 (이 경우 CSCC 소재) 종양 세포의 침습성을 비교 동작의 가능성을 연다. 이 기술을 사용하여, RDEB의 피부 환경을 효과적으로 요약 C7-결핍 기본 행렬뿐만 아니라 생성뿐만 아니라 유전자에 표현 C7 (18)에 설계 한 추가 행렬을 할 수 있습니다. 그림 2에서 보는 바와 같이, RDEB CSCC의 각질 세포의 침공은 C7-결핍 RDEB 제어에 비해 C7-과발현 기본 행렬에 크게 지연되었다. 이 침공은 젤이, 고정 된 파라핀 블록에 포함 된 후 단면과 면역 염색 된 표준 조직 학적 방법을 통해 시각화됩니다. 염색에 사용하는 제안 된 항체는 CSCC 세포와 섬유 아 세포에 대한 항 멘틴 (V9)에 대한 안티 각질 14 (LL001)이다.
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그림 1. 섬유 아세포에서 파생 된 기본 행렬과 종양의 침공 분석의 생성 워크 플로우. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. C7의 섬유 아세포 결핍 제어 RDEB에서 파생 된 기본 행렬에 CSCC 침공의 각질 14 (LL001) 염색 (AI & BI), 또는 RDEB 섬유 아 세포에서 과발현 전체 길이 C7 식 (AII 및 BII)를 명확하게 보여주는 다시 표현 세포 외 기질에서 C7의 CSCC의 각질 세포 침입을 지연 할 수 있습니다. 핵이 (파란색) DAPI로 염색 하였다 BI 및 BII에 (녹색) 멘틴와 섬유 아 세포.
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Discussion
때문에 본 실험의 특성상 완료에 필요한 전체 시간은 최대 2 개월 일 수있다. 이 시간 동안, 최대한의주의와 무균 조직 배양 방법은 미생물 오염을 방지하기 위해 사용되어야합니다.
이외에도 하이드 록시 프롤린 및 히드 록시 리신의 콜라겐의 합성에 보조 인자로서의 역할에서, 아스코르브 산 (22)은 섬유 아세포에서 콜라겐 특정 mRNA 발현을 자극한다. 여기서 선택의 아스코르브 산보다 안정적인 L-아스 코르 빈산 2 - 인산 (23)이다. 재 공급은 일주일에 세 번 좋습니다 그러나 이것은 변함없이 연구되고있는 세포에 의존한다. 주 통과 초기 섬유 아세포 배양 더 많은 영양소를 섭취하고, 큰 미디어 볼륨이 더 자주 재 이송이 바람직 할 수있다. 그것은 변화하는 미디어 및 관리는 기본 매트릭스 생산 동안 세포층에 교란을 최소화하기 위해 이동해야 할 때 부드러운 것이 중요합니다.
매트릭스는 특히 잘의 둘레, 보통 이주 후 표시가 될 것이다. 가끔, 매트릭스는 기계 중단없이 자체를 사용할 수있게됩니다. 이것은 안쪽으로 행렬을 끌어 행렬 및 인장 강도의 고유 리모델링을 정확하게 반영하고 있으며, 또한 기본 행렬의 둘레는 미디어 변경하는 동안 방해되었다는 표시 일 수있다.
해제 플레이트에서 매트릭스 세포 층을 확보하는 경우, 하나의 매트릭스를 통해 구멍을 찌를하지 않도록주의해야합니다. 작은 무딘 셀 스크레이퍼는 또한 1 ㎖의 마이크로 피펫 팁 대신에 사용될 수있다. 나일론 상에 출시 된 기본 행렬의 배치 (평면 기본 행렬을 배치해야되는 것은) 공기 - 액체 인터페이스에 훨씬 쉽게 처리 및 후속 드는있게 먼저 메쉬.
이 프로토콜을 설명하는 첫번째이다더 정확하고 생리 관련 데이터를 얻기 위해 종양 세포 분석법에 미세 환경을 모델링하는 경피 기판으로서 원시 섬유 아세포 매트릭스의 사용.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
APS는 데브라 국제 및 영국 피부 재단이 지원됩니다. 던디 파트너십 박사 프로그램의 대학 - YZN는 * STAR에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- BD Biosciences - Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from: http://SPC-356230 Rev 5.0 Forthcoming.
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , Forthcoming.
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
