Summary
Engenharia de tecidos da matriz nativa derivada de fibroblastos é uma ferramenta emergente para gerar um substrato do estroma que suporta a proliferação de células epiteliais e de diferenciação. Aqui, um protocolo de aplicação desta metodologia para avaliar o impacto de diferentes tipos de células do estroma em biologia de células tumorais é apresentado.
Abstract
Culturas organotípicas 3D de células epiteliais de uma matriz de incorporado com células mesenquimais são amplamente usadas para estudar diferenciação de células epiteliais e invasão. Tipo Rat cauda I colágeno e / ou matriz derivada de Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma rato têm sido tradicionalmente empregada como substratos para modelar a matriz ou estroma microambiente em que as células mesenquimais (geralmente fibroblastos) são preenchidos. Embora experiências utilizando tais matrizes são muito informativa, pode argumentar-se que, devido a uma presença predominante de uma única proteína (tal como no colagénio de tipo I) ou um elevado teor de componentes de membrana basal e de factores de crescimento (tais como na matriz derivada de rato células de sarcoma), estes substratos não refletir melhor a contribuição para a composição da matriz feita pelas próprias células do estroma. Para estudar matrizes nativas produzidas por fibroblastos dérmicos primários isolados de pacientes com um tumor de bruços, desordem empolando genética (distrófica recessivaepidermólise bolhosa), nós adaptamos um protocolo matriz nativa existente para estudar a invasão das células tumorais. Os fibroblastos são induzidos a produzir a sua própria matriz durante um período prolongado em cultura. Esta matriz nativa é então separado da placa de cultura e as células epiteliais são semeados em que antes de toda a co-cultura é elevada para a interface ar-líquido. A diferenciação e / ou invasão celular pode então ser avaliado ao longo do tempo. Esta técnica proporciona a capacidade para avaliar as interacções de células epiteliais mesenquimais num ambiente 3D, sem a necessidade de uma matriz sintética ou externa, com a única desvantagem é o período prolongado de tempo necessário para produzir a matriz nativa. Aqui descreve-se a aplicação desta técnica para avaliar a capacidade de uma única molécula expressa por fibroblastos, colagénio tipo VII, para inibir a invasão de células tumorais.
Introduction
O uso de biomateriais em cultura de tecido 3D tem permitido aos investigadores estudar o comportamento de células no laboratório sob condições fisiológicas mais semelhante a um ambiente in vivo do que a de um recapitulado com aderência 2D e um substrato de plástico. Em particular, a passos largos para a frente foram feitos na modelagem epitélios estratificados com a adoção de métodos de cultura 3D na interface ar-líquido 1-4. Tais técnicas imitar fielmente diferenciação dos queratinócitos e invasão das células tumorais permitindo maior flexibilidade e fidelidade para pesquisadores que estudam esses processos. A escolha do substrato biomaterial para imitar o ambiente estromal envolveu principalmente o uso de colágeno tipo I, Engelbreth-Holm-Swarm matriz sarcoma rato e derme de-epidermized. Por exemplo, os fibroblastos associados ao cancro têm sido mostrados para contribuir para a invasão de cancro 5, a iniciação e a progressão através de interacções estromais-epitelial 6,7 when cultivados em tais substratos.
O padrão ouro para imitar o ambiente estromal na pele, os maiores e mais estudados epitélio estratificadas utilizando tais técnicas, é considerado para ser de-epidermized derme humana (DED). Preparação do DED envolve a remoção da epiderme através de tripsinização e dissociação física da pele de um cadáver humano 3,4. No entanto, o acesso a essa pele pode ser muito difícil para os laboratórios não associados com as instituições clínicas e derme doentes é quase impossível de se obter. Como alternativa, os laboratórios freqüentemente usam uma combinação de colágeno tipo I (isolado de caudas de rato) e / ou matriz sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm mouse.
Após a descoberta em 1927 por Nageotte 8 que o colágeno pode ser facilmente isolado usando ácido acético e precipitação de sal, a sua aplicação à cultura de tecidos foi posteriormente lançada pela Huzella e colegas 9. Revestimento de colágeno mostrou-se superior ao vidro para cultura de células de 29 linhagens e explantes de tecido como interrogados por Ehrmann e Gey 9. Actualmente, o principal tipo de colagénio utilizada em cultura de tecido é isolado a partir de tendões da cauda de rato, e está geralmente comprados a partir de fontes comerciais. No entanto, a desvantagem para recapitulação substrato fiel é que o colágeno da cauda de rato não é idêntico ao colágeno humano, ou a derme humanos, onde tipo I e III colágenos estão presentes como principais constituintes, e isolado de colágeno da cauda de rato é invariavelmente fragmentada.
Engelbreth-Holm-Swarm matriz sarcoma mouse é uma mistura de proteína gelatinosa secretada por Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma rato cultivadas 10. Os principais constituintes são laminina, colagénio tipo IV, proteoglicana de sulfato de heparina, entactina e nidogï ¿½ io e as proporções exactas destas proteínas pode variar de lote para lote. Além de pró estruturalproteínas, essa matriz também contém níveis significativos de factores de crescimento, tais como factor de crescimento transformante β, factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento 1 semelhante à insulina, factor de crescimento de fibroblastos bovino e factor de crescimento derivado de plaquetas, que iria alterar o comportamento celular 11,12. Apontando para a enorme complexidade de Engelbreth-Holm-Swarm matriz sarcoma mouse, um total de 1.851 proteínas foram identificadas em um estudo de proteômica recente 13. Tendo em vista a natureza rica e complexa desta matriz, a cautela tenha sido avisada ao interpretar e comparar as diferentes experiências com o uso do mesmo 11.
Nossos laboratórios têm um grande interesse em doenças de pele genética, particularmente aqueles com uma predisposição para o desenvolvimento de carcinoma cutâneo de células escamosas (cSCC) 14. No caso de epidermólise bolhosa distrófica recessiva (RDEB), uma doença grave com formação de bolhas mutações germinativas no gene COL7A1
Neste trabalho, os passos utilizados para recapitular o microambiente estromal tumor cutâneo (matriz nativa) derivado diretamente a partir de fibroblastos estromais primários in vitro são descritos 18. Matrizes nativos produced por cultura a longo prazo de fibroblastos foram usadas como um equivalente dérmico de ensaio para a invasão das células cSCC. Apresentamos dados usando matriz nativo, oriundo da matriz extracelular secretada por fibroblastos RDEB (deficientes em colágeno tipo VII (C7)) ou a partir de fibroblastos RDEB retrovirally transduzidas com o colágeno tipo VII expressar construir e demonstrar o profundo efeito de um único colágeno no tumor invasão celular.
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Protocol
Este estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Princípios de Helsínquia e foi aprovado pelos Comitês de Ética apropriados.
1. Preparação de meios e reagentes
- Preparação de 200x de ácido L-ascórbico estoque 2-fosfato
- Dissolve-se 29 mg de ácido L-ascórbico 2-fosfato por 5 ml de solução de Dulbecco meio de Eagle modificado (DMEM) e filtra-se através de filtro de membrana de 0,22 um. Loja de 0,25 ml alíquotas estéreis em -20 ° C.
- Adicionar 0,25 ml de aliquota de 200x ácido L-ascórbico estoque 2-fosfato para cada 50 ml de meio de fibroblastos (DMEM com 1% de L-glutamina e 10% de soro fetal bovino) no dia em que é necessária, para uma concentração final de 0,1 mM de L de ácido ascórbico 2-fosfato.
- Preparação de meios de crescimento de queratinócitos
- Isolamento e cultura de queratinócitos SCC primários têm sido descritos anteriormente 21. Preparação de meios de crescimento de queratinócitos está descritonele também.
- Em resumo, preparar os meios de comunicação da seguinte forma:
300 ml de DMEM e 100 ml de Ham F-12 suplementado com 10% de FBS
0,4 mg / ml de hidrocortisona
5 mg / ml de insulina
10 ng / mL de EGF
5 mg / ml de transferrina
8,4 ng / ml toxina da cólera
13 ng / ml de liotironina
Solução de penicilina-estreptomicina 1x
2. In Vitro da construção de matriz nativo de fibroblastos derivados de Ácido L-Ascórbico 2-fosfato Meios Suplementado
- Semente 200.000 fibroblastos por poço em placas de 6 poços (20000 células / cm 2) em meio suplementado com fibroblasto de ácido L-ascórbico 2-fosfato. Alimente novamente a cada 2-3 dias, com 2-5 ml de mídia. (Nota: Refeeding freqüência e volume pode ser ajustado para atender às necessidades individuais de diferentes células Consulte "discussões".).
- Uma espessa camada de células incorporadas na matriz extracelular vai formar no final de 6 semanas, visíveis a olho nu (
- Deixe o flutuador matriz nativa e remodelar por 5 dias, mudando de mídia a cada 2-3 dias. Devido à resistência à tracção e remodelação intrínseca dentro da matriz, a matriz vai contrair drasticamente reduzida e tornar-se a uma matriz nativa menor, mas mais grosso, e está pronta para ser utilizada para o ensaio de invasão.
3. Invasão de Ensaio com Tumor SCC queratinócitos
- Pegue a matriz nativa delicadamente com uma pinça sem corte e transferir para Nylon net. Uma vez na rede de nylon, espalhar a matriz suavemente a mentir tão plana quanto possível, utilizando uma micropipeta de 1 mlponta e uma pinça sem corte.
- Preparar os cilindros clonais estéreis manchando uma pequena quantidade de solução estéril de vaselina em uma extremidade.
- Colocar os cilindros clonais na matriz nativa, com o lado de baixo de vaselina. Isto é para assegurar uma boa vedação entre a matriz nativa e os anéis clonais.
- Adicionar células cSCC aos cilindros clonais (250.000 células em 100 ul de meio de crescimento de queratinócitos).
- Retire os cilindros clonais após 6 horas, quando as células CSCC se estabeleceram na matriz nativa.
- Levante a rede de nylon com a matriz nativa e células CSCC a interface ar-líquido sobre o suporte de malha de arame de aço inoxidável dobrado.
- Adicionar meio de crescimento de queratinócitos suplementado com ácido ascórbico até o nível mídia toca o fundo da matriz nativa.
- Mudança de mídia a cada 2-3 dias e colheita aos 7 e 14 dias pós-semeadura de células CSCC.
4. A colheita das culturas 3D e Preparação para Histologia
- Fix em 4% parovernight aformaldehyde à temperatura ambiente.
- Bisseccione as amostras e incorporar em cera de parafina para fixadas em formalina blocos encaixados, com superfície de corte voltada para fora.
- Alternativamente, incorporar as amostras bifurcadas em outubro e encaixe-congelante imediatamente em nitrogênio líquido por blocos de tecido fresco congelado.
- Corte 4 mM seções em micrótomo e dewax (se necessário). Mancha usando hematoxilina padrão e eosina. Para visualizar as células cSCC, anticorpo monoclonal de rato contra a queratina 14 (LL001, in-house) pode ser usado em imuno-coloração.
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Representative Results
Esta técnica abre-se a possibilidade de analisar e comparar o comportamento das células do tumor invasivo (neste caso cSCC) sob diferentes ambientes de estroma 3D. Usando esta técnica, não só matrizes nativas C7-deficientes que retomados ambiente RDEB dérmica pode ser gerado, mas também matrizes adicionais que foram geneticamente modificados para sobre-expresso C7 18. Como pode ser visto na Figura 2, a invasão de queratinócitos RDEB cSCC foi significativamente retardado em C7-overexpressing matrizes nativas em comparação com o controlo RDEB C7-deficiente. Esta invasão é visualizado através de métodos histológicos padrão, onde os géis foram fixados, incluídos em blocos de parafina e seccionados e imunomarcadas. Anticorpos sugerida a utilização de coloração são anti-queratina 14 (LL001) para células CSCC e anti-vimentina (V9) para fibroblastos.
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Figura 1. Fluxo de trabalho de geração de matriz nativa derivada de fibroblastos eo ensaio de invasão do tumor. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Queratina 14 (LL001) coloração da invasão cSCC na matriz nativa derivada de controlo RDEB fibroblastos deficientes em C7 (ai e bi), ou em fibroblastos RDEB sobre-expressando C7 expressão de comprimento completo (aii e bii), demonstra claramente que o re-expressão de C7 na matriz extracelular pode retardar cSCC invasão dos queratinócitos. Núcleos foram coradas com DAPI (em azul) e fibroblastos com vimentina (em verde) em BI e BII.
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Discussion
Devido à natureza desta experiência, o tempo total necessário para a conclusão pode ser superior a dois meses. Ao longo deste tempo e de cuidados de tecidos estéril práticas cultura UTMOST deve ser empregue para evitar a contaminação microbiana.
Para além do seu papel como co-factor na síntese de hidroxiprolina e hidroxilisina de colagénios, ácido ascórbico estimula a expressão de mRNA específica de colagénio em fibroblastos 22. O ácido ascórbico de escolha aqui é a mais estável de ácido L-ascórbico 2-fosfato 23. Realimentação é aconselhável três vezes por semana, mas isso irá invariavelmente ser dependente das células em estudo. As culturas de fibroblastos iniciais vai consumir mais nutrientes como as semanas passam, e realimentação mais freqüente com volumes maiores de mídia pode ser aconselhável. É importante ser gentil quando deve ser tomado mudança mídia e cuidado para minimizar os distúrbios para a camada de células durante a produção da matriz nativa.
A matriz deve tornar-se visível normalmente após 2 semanas, especialmente em torno da circunferência da cavidade. Raramente, a matriz vai libertar-se sem qualquer perturbação mecânica. Este é um reflexo da remodelação intrínseca da matriz e força de tracção, o que puxa para dentro da matriz, mas também pode ser um sinal de que a circunferência da matriz nativa foi perturbado durante mudanças de meio.
Quando soltar e liberar a camada de células da matriz da placa, deve-se ter cuidado para não criar buracos através da matriz. Pequenas raspadores de células rombas também podem ser utilizados em vez de 1 ml dicas micropipeta. Colocação da matriz nativa liberado para uma malha de nylon primeiro (certificando-se de colocar a matriz nativa flat) torna muito mais fácil para a manutenção ea elevação subseqüente à interface ar-líquido.
Este protocolo é o primeiro a descrevera utilização de matriz de fibroblastos nativo como um substrato dérmico para modelar o microambiente em ensaios de células de tumores, a fim de obter dados mais precisos e fisiologicamente relevantes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
APS é suportado por Debra Internacional e da Fundação Britânica da Pele. YZN é apoiado por A * STAR - University of Dundee Parceria Programa de Doutoramento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
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