Summary
Complejos de proteínas con múltiples componentes juegan un papel crucial durante la función y el desarrollo celular. Aquí se describe un método usado para aislar los complejos de proteínas nativas a partir de embriones de Drosophila después de la reticulación en vivo seguido de la purificación de los complejos reticulados para el análisis de estructura-función subsiguiente.
Abstract
Muchos procesos celulares están controlados por complejos de proteínas con múltiples subunidades. Frecuentemente, estos complejos se forman transitoriamente y requieren entorno nativo de montar. Por lo tanto, para identificar estos complejos de proteínas funcionales, es importante para estabilizar ellos in vivo antes de la lisis celular y la posterior purificación. Aquí se describe un método para aislar grandes complejos de proteínas de buena fe a partir de embriones de Drosophila. Este método se basa en la permeabilización del embrión y la estabilización de los complejos dentro de los embriones de reticulación en vivo usando una baja concentración de formaldehído, que puede atravesar fácilmente la membrana celular. Posteriormente, el complejo proteína de interés se inmunopurificó seguido por purificación en gel y se analizaron por espectrometría de masas. Se ilustra este método mediante la purificación de un complejo de proteínas de Tudor, que es esencial para el desarrollo de la línea germinal. Tudor es una proteína grande, que contiene varios dominios Tudor - pequeñamódulos que interactúan con argininas metiladas o lisinas de las proteínas diana. Este método puede adaptarse para el aislamiento de complejos de proteínas nativas de diferentes organismos y tejidos.
Introduction
El aislamiento de las asambleas de proteínas y complejos de múltiples subunidades de ADN o ARN-proteína se realiza para identificar los complejos de proteínas, genómica loci reconocida por proteínas reguladoras se unen al ADN o ARN objetivos de las proteínas de unión de ARN. Diferentes métodos permiten la identificación de todo el genoma de ADN sitios reconocidos por factores de transcripción o proteínas de la cromatina (ChIP-seq) 1 y los objetivos de ARN asociados con una proteína de unión al ARN dado (CLIP-seq) 2. Las bibliotecas de ADNc de ARN derivados u objetivos de ADN son entonces profundamente secuenciados. Estos métodos utilizan química o reticulación para estabilizar los complejos seguido por inmunoprecipitación (IP) con un anticuerpo contra un componente de proteína del complejo estudiado inducida por UV.
Durante el desarrollo de un organismo, muchos complejos de proteínas forman transitoriamente. Por lo tanto, es crucial para analizar la composición y función de estos complejos in vivo para comprender los mecanismos moleculares que controlan development. Tal análisis in vivo sería superior a enfoque in vitro, ya que es prácticamente imposible de reproducir concentraciones nativas de los componentes que interactúan y entorno bioquímico celular in vitro. Aquí se demuestra un enfoque in vivo que utilizamos con éxito para aislar grandes complejos de proteínas a partir de embriones de Drosophila. En este método, los complejos de proteínas en los embriones vivos se reticulan con una baja concentración de formaldehído y, posteriormente, los complejos de proteínas de interés se aíslan por IP con un anticuerpo contra un componente conocido de los complejos seguido de purificación en gel de los complejos y el análisis de espectrometría de masas para identificar los componentes complejos desconocidos. Dado que el formaldehído es capaz de permear la membrana de la célula y tiene un rango de reticulación de 2.3 a 2.7 Å 3, los complejos de proteínas se pueden reticular in vivo y los componentes complejos son propensos a estar cerca el uno al otro. En este artículodescribir este método usando el aislamiento de entramado (Tud) complejo de la proteína como un ejemplo. Tud es una proteína de la línea germinal que es esencial para el desarrollo de la línea germinal 4-7. Esta proteína contiene 11 dominios TUD conocidos para interactuar con argininas metiladas o lisinas de otros polipéptidos 8-10.
Anteriormente, hemos generado una línea de Drosophila transgénica que expresa HA-etiquetados funcional Tud 5 y por lo tanto, el anticuerpo específico anti-HA se utiliza para tirar hacia abajo compleja Tud después de la reticulación.
Además de reticulaciones proteína-proteína, el formaldehído puede generar enlaces cruzados de proteína-ácido nucleico y se utiliza en los experimentos de ChIP-ss. Además, en Drosophila, in vivo de reticulación con formaldehído ha permitido la identificación de una diana de ARN de la proteína helicasa Vasa ARN 11.
Aunque en este artículo se describe un método para la reticulación in vivo y purficación de complejos de proteínas a partir de embriones de Drosophila, este método se puede adaptar para otros organismos y tejidos.
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Protocol
1. Preparación grandes de Apple Juice Placas de agar
- Para hacer 4 platos, añadir 375 ml de H2O, 11,25 g de agar con mosca y una barra de agitación en un matraz de 1000 ml. Se trata de Mix A. Autoclave Mix A con la tapa frasco sin apretar tope en un ciclo de 30 min-esterilización para productos líquidos.
- Añadir 125 ml de jugo de manzana, 12,5 g azúcar de mesa y una barra de agitación a un vaso de 500 ml. Esta es la mezcla B. El calor de la mezcla B en una plataforma calentada mientras se agitaba y mantener la temperatura a aproximadamente 70 ° C hasta que se terminó el tratamiento en autoclave de la mezcla A.
- Tras la finalización de Mix A autoclave, transferir Mix B en Mix A. Mantenga la agitación de la mezcla combinada con suavidad y deje que se enfríe durante 15 minutos. Evitar el exceso de enfriamiento y la solidificación de agar dado lugar antes de la adición de conservante.
- Hacer 10% (peso / volumen) metil solución de 4-hidroxibenzoato en etanol. Esto actuará como un conservante. Añadir 3,75 ml de la solución a la mezcla de jugo de manzana-agar anteriormente. Mantener la agitación durante anotheR 5 min.
- Vierta 125 ml manzana mezcla de jugo-agar con conservante en cada 300 cm2 de plástico o placa de espuma de poliestireno. Deje que se enfríe a temperatura ambiente y se solidifique. Evite la formación de burbujas de aire mientras se vierte.
Nota: Las placas de manzana jugo de agar están listos para usar inmediatamente. Cubra las placas utilizadas con los abrigos claros y almacenar a 4 ° C durante un máximo de una semana.
2. Drosophila embriones Recolección y Tratamiento Pre-reticulación
- Cargue una jaula de población con aproximadamente 40.000 a 50.000 moscas de la que se recogen los embriones.
- Haga dos placas que contienen cada uno 125 ml de harina de maíz-melaza estándar medio 12 y espolvorear aproximadamente 4 g de levadura de panadería seca en cada plato. Coloque estas placas en la jaula de la población en una incubadora a 25 ° durante 48 horas para engordar a las moscas.
- Caliente 2 manzana jugo de placas de agar a 25 ° C. Espolvorear aproximadamente 1 g de levadura de panadería seca en cada unoplato. Coloque las 2 placas en la jaula de la población para comenzar a recoger 0-1 embriones-hr de edad.
- Saque las placas al final de la colección 1 hr. Reemplace con 2 nuevas placas si se necesita otra ronda de recolección.
- Agregar suficiente agua para cubrir las placas y volver a suspender los embriones suavemente con un pincel fino. Vierta los embriones se volvieron a suspender por un tamiz de dos capas hechas de malla de alambre de acero inoxidable.
Nota: La capa superior está hecha de tamaño de poro medio (850 m) de malla que recoge gran parte de la mosca vez que deja pasar los embriones. La capa inferior está hecha de malla fina (75 micras), que recoge los embriones vez que deja pasar la levadura y el agua. - Utilice el pincel fino para transferir los embriones recogidos en una canasta de la colecta hecha con un tubo de 50 ml y malla de nylon fino. Enjuague los embriones brevemente con agua y luego seque la malla en toallas de papel para secarse.
- Sumerja los embriones en el 50% de lejía con agitación suave durante 3 min. Enjuague a fondoLY con agua para eliminar cualquier lejía restante. Seque la malla en toallas de papel para secarse.
- Sumerja los embriones dechorionated en isopropanol con agitación suave durante 15 segundos o hasta que la descomposición de agregados múltiples del embrión (esto no debe durar más de 30 segundos). Seque la malla en toallas de papel para secarse a fondo.
- Sumerja los embriones en heptano durante 5 minutos mientras se utiliza una pipeta para transmitir heptano sobre los embriones para mantenerlos resuspendido. Seque la malla en toallas de papel para secarse.
- Enjuague los embriones con corrientes de Tampón fosfato salino, pH 7,4 (PBS) que contenía 0,1% de Triton X-100 (PBST) durante 3 min.
- Desmontar la canasta de la colecta y transferir los embriones junto con la malla a un tubo de 15 ml que contiene 10 ml de PBST. Invertir el tubo suavemente para lavar los embriones de la malla.
- Retire la malla del tubo. Poner el tubo en posición vertical y dejar que los embriones se hunden hasta el fondo del tubo por gravedad.
Nota: Aproximadamente 100-300l de embriones se espera para una colección de 1 hr de una jaula. - Retire el PBST y continuar realizando reticulación inmediatamente.
3. In vivo La reticulación de embriones obtenidos
- Preparar 0,2% de formaldehído en PBST inmediatamente antes de su uso. Añadir 10 ml de fijador formaldehído para los embriones y se incuba a 25 ° C con agitación suave en un agitador rotatorio durante 10 min. Desechar fijador no utilizada por el final del día.
- Se detiene la reacción de reticulación
- Al final de la reticulación, dejar que los embriones se hunden hasta el fondo del tubo.
- Eliminar la solución de formaldehído. Inmediatamente después, añadir 10 ml de 0,25 M de glicina en PBST para inactivar la reacción de reticulación. Incubar a 25 ° C con agitación suave en un agitador rotatorio durante 5 min.
- Deje que los embriones se hunden hasta el fondo del tubo. Eliminar la solución de enfriamiento. Lavar los embriones con 10 ml de PBST tres veces.
- Retire completamente el PSolución de lavado BST utilizando una pipeta. Embriones Almacenar a -80 ° C hasta su uso.
4. Proteína preparación de la muestra y la inmunoprecipitación
- Homogeneizar 500 l embriones reticulados usando un homogeneizador Dounce en 2 ml de tampón de lisis (urea 0,5 M, 0,01% de SDS, 2% de Triton-X 100, fluoruro de fenilmetanosulfonilo 2 mM de [PMSF] y cóctel inhibidor de la proteasa en PBS).
Nota: Realice este y los siguientes pasos a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. - Transferir el lisado a 1,5 ml de tubos de centrífuga y mueva suavemente sobre una plataforma giratoria durante 15 minutos para asegurar la lisis completa. Centrifugar el lisado a 16.000 xg durante 5 min para sedimentar los restos celulares. Guardar el sobrenadante en un tubo limpio 15 ml.
- Añadir 40 l perlas de agarosa anti-HA suspensión al sobrenadante y se incuba en una plataforma giratoria durante 2,5 h.
- Se precipitan las perlas mediante centrifugación a 2500 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante, pero dejan aproximadamente 250 l en el tubo. Resuspender las perlas en el sobrenadante restante y transferir a una columna de centrifugación de 1,5 ml con un filtro de poro de 10 micras.
- Se centrifuga la columna de centrifugación a 12.000 xg durante 10 seg y desechar el flujo a través.
- Lavar las perlas mediante la adición de 200 l de tampón de lavado (0,1 M de glicina, 1 M de NaCl, 1% de Igepal CA-630, 0,1% de Tween-20, en PBS). Centrifugar la columna a 12.000 xg durante 10 seg y deseche el lavado. Repetir el lavado dos veces más.
- Añadir 40 l de tampón de elución (2 mg / ml de HA-péptido en PBS) a las perlas y se incuba a 37 ° C durante 15 min con agitación suave cada 5 min. Centrifugar la columna a 12.000 xg durante 10 segundos y recoger el eluido.
- Confirmar elución del complejo por análisis de transferencia Western usando anticuerpo anti-HA 13.
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Representative Results
La eficacia de la reticulación y la purificación con éxito del complejo de la proteína reticulada Tud se analizaron por SDS-PAGE en un 3% - 7% de gel de paso (ilustrado en la Figura 1), seguido de Western blot (Figura 2).
El propósito de utilizar el 3% - gel de paso 7% se basa en la separación efectiva de reticulado complejo de proteínas Tud de la proteína Tud no reticulada restante y la concentración del complejo. Bajo nuestras condiciones in vivo de reticulación mencionados anteriormente, una gran proporción de proteínas Tud todavía podría permanecer sin reticular. Esta proteína libre de Tud sería copurifican con el complejo reticulado durante IP hasta la separación por SDS-PAGE. Aunque es grande en tamaño, no reticuladas proteína Tud (285 kDa) migra a través de la 3% - 7% frontera sin retención obvia. Considerando que el reticulado complejo proteico Tud con mayor peso molecular tendría dificultades para migrar a través de la frontera de gel, lo que resulta en the complejo está "atrapado" y se concentraron en la frontera o "colas", cerca de la frontera y, por tanto, la separación de la proteína libre Tud.
La inclusión de un control adecuado es crítico para validar la especificidad de este protocolo de reticulación. Por lo tanto, hemos utilizado embriones que expresan la proteína de GFP marcada con HA 14 para supervisar la extensión de la reticulación. Hemos realizado experimentos piloto de diferentes concentraciones de formaldehído (0,1% - 2%) en embriones que expresan GFP marcada con HA y parte de los resultados (0,1% - 0,5%) se muestran aquí (Figura 3). Es claro que la mayoría absoluta de la proteína GFP en los embriones tratados (hasta 0,5% de formaldehído) se mantuvo sin reticular, que validó que nuestro protocolo de reticulación no hace proteína diana de reticulación a las moléculas que rodean al azar. En particular, el tratamiento con formaldehído 0,2% (Figura 3, carril 5 y 6) no mostró productos reticulados cuando se compara con uncrControl osslinked (Figura 3, carril 1 y 2) a pesar del tiempo de exposición prolongado de la película, lo que justifica aún más nuestra oferta de 0,2% de formaldehído en este protocolo. Sin embargo, los embriones de control GFP siempre deben ser entrecruzados en paralelo con el entrecruzamiento complejo Tud en las mismas condiciones y muestras de la proteína GFP de control se debe ejecutar en el 3% - gel paso 7% junto con TUD muestras complejas siguiente IP. Además, tanto complejo Tud y el correspondiente control GFP 3% - 7% áreas de gel deben ser extirpados y se sometieron a análisis de espectrometría de masas para determinar los candidatos positivos falsos que estarán presentes tanto en banda compleja Tud y el control GFP.
La eficacia de la reticulación in vivo se determinó mediante la comparación de la proteína libre de Tud y complejo Tud del control sin reticular y embriones muestras reticuladas respectivamente (Figura 2A). Proteína libre Tud a partir de embriones de control sin reticular casi exclusively migra a través del 3% - 7% fronteriza con mínima cantidad retenida cerca de la zona fronteriza (Figura 2A, carril 1). Contrariamente a eso, los embriones reticulados mostraron la presencia de gran peso molecular Tud complejo reticulado en el 3% - 7% de gel de frontera (Figura 2A, carril 2). Esto muestra claramente que nuestro procedimiento de reticulación reticulado con éxito aproximadamente el 50% de la proteína total Tud con sus socios que interactúan en vivo (comparar Figura 2A carril 1 y 2).
La elución competitiva con HA-péptido confirmó la purificación exitosa y fortaleció la especificidad del complejo purificado de proteína Tud (Figura 2B). La fracción de elución por HA-péptido contenía el complejo concentrada alrededor del 3% - zona fronteriza del 7% y también libre de proteínas Tud (Figura 2B, carril 1). El siguiente tampón de muestra SDS eluido mayormente libre Tud que queda en las cuentas y mínima cantidad de complejo Tud (
. Figura 1 Diagrama del 3% -. Gel de paso 7% utilizado para SDS-PAGE El 3% - gel de paso 7% se moldea manualmente de una manera tal que contiene tres capas. Desde la parte superior a la parte inferior, las capas son gel de apilamiento 3%, 3% de gel de separación y 7% gel separador. Para trabajar con el sistema Mini-Protean (Bio-Rad) utilizado en este manuscrito, se hizo la altura del gel de separación 3% a ser de aproximadamente 1 cm como se muestra en el diagrama.
Nota: El gel de apilamiento 3% y los que separan capas de gel de 3% son extremadamente frágiles así que tenga mucho cuidado al manipular el gel para evitar la distorsión de estas capas.
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. Figura 2 Western blot resultados de embriones reticulados y control de los embriones lisados y purificación de Tudor complejo de proteínas a través de IP Panel A, carril 1, el crudo lisado de proteínas de los embriones de control sin reticular.; carril 2, lisado crudo de proteína a partir de embriones de formaldehído reticulados. Panel B, carril 1, elución por HA-péptido después IP de lisado embrión reticulado; carril 2, elución por 2 x tampón de muestra SDS después de la elución inicial HA-péptido. SDS-PAGE se realizó a 200 V durante 3,5 h. Anticuerpo anti-HA (1:1.000) se utilizó en Western blot.
Figura 3. Western blot resultados de embriones reticulados y control de los embriones que expresan GFP-etiquetados HA. Carril 1, proteína cruda lisado of embriones de control sin reticular; carril 2, igual que el carril 1, pero el doble de la cantidad; carril 3, el crudo proteína lisado de embriones reticulados utilizando 0,1% de formaldehído; carril 4, mismo que la calle 3, pero el doble de la cantidad; carril 5, lisado crudo de proteína de embriones reticulados utilizando 0,2% de formaldehído; carril 6, igual que el carril 5, pero el doble de la cantidad; carril 7, lisado crudo de proteína de embriones reticulados utilizando 0,3% de formaldehído; carril 8, igual que el carril 7, pero el doble de la cantidad. Carril 9, lisado crudo de embriones reticulados utilizando 0,5% de formaldehído. SDS-PAGE se llevó a cabo a 200 V durante 45 min en un 4% - gel de gradiente de 15%. Anticuerpo anti-HA (1:1.000) se utilizó en Western blot.
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Discussion
El formaldehído se ha usado comúnmente como un reactivo de reticulación para la identificación de proteína-proteína y las interacciones proteína-ácido nucleico. Su buena solubilidad y permeabilidad de la membrana celular, junto con la compatibilidad con los procedimientos de espectrometría de masas aguas abajo, crea formaldehído un agente candidato ideal para aplicaciones de reticulación intracelulares 3,15-17. En particular, se utiliza con éxito para identificar los ARNm asociados con Vasa, una helicasa de ARN de células germinales de Drosophila crítico en 11. Además, el formaldehído tiene uno de los más cortos brazos espaciadores (2.3 a 2.7 a) entre los agentes de reticulación disponibles comercialmente, lo que implica que sólo las moléculas que existen en las proximidades se pueden reticular en condiciones adecuadas, el fortalecimiento de la especificidad de los socios que interactúan de la proteína diana . Por las razones antes expuestas, el formaldehído fue elegido como el agente de reticulación en el protocolo. Sin embargo, esto no debe excluir la usefulness de otros agentes de reticulación in vivo para la aplicación en embriones de Drosophila. Sin embargo, hemos tratado de utilizar ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP), un N-hidroxisuccinimida (NHS) de éster reticulante familia utiliza con frecuencia en combinación con formaldehído en los ensayos de chip 17,18, para reemplazar el formaldehído en nuestro estudio, pero sin aparente Tud complejo se obtuvo con este agente de reticulación Por otro lado, DSP podría ser eficaz para otros complejos de proteínas que necesitan ser determinados en base de caso por caso. Además de enfoque in vivo de reticulación, agentes de reticulación in vitro de bismaleimidohexano (BMH) familia han demostrado ser eficaces en la captura de las interacciones proteína-proteína en embriones de Drosophila 14,19, sin embargo, en estos experimentos se produjo después de la reticulación se hicieron extractos de embriones.
El tiempo de reticulación, la temperatura y la concentración de formaldehído son las tres principales factoresres que influyen en la eficiencia de reticulación. Nuestro protocolo se ha probado el uso de experiencias piloto para cada factor individual, por lo tanto, se ha optimizado para la reticulación de proteínas Tud y sus socios que interactúan en embriones de Drosophila en vivo, mientras se mantiene el equilibrio entre la especificidad del complejo reticulado y el riesgo de de reticulación de las moléculas no específicas. Reticulación no específica conduce a la presencia de falsos positivos en el complejo y debe ser cuidadosamente controlado con un control de proteína no relacionada, por ejemplo GFP, que se utilizó en nuestros experimentos. Además, las condiciones óptimas de reticulación pueden variar con diferentes moléculas diana. Por lo tanto, el uso de nuestro protocolo como punto de partida, el tiempo óptimo de reticulación, la temperatura y la concentración de formaldehído tendrá que ser determinada para un complejo de la proteína de interés dada.
Una vez establecidas las condiciones óptimas de reticulación es fundamental follow con precisión cada vez que los embriones se reticulan para minimizar la reticulación no específica. Paso crucial adicional es el lavado de las perlas después de IP con alta concentración de NaCl (1 M) y dos detergentes (IGEPAL CA-630 y Tween-20) para reducir la unión no específica de proteínas no relacionadas a partir de extractos de embriones a las perlas.
Nuestro protocolo depende de la alta afinidad entre la proteína diana y el anticuerpo utilizado para desplegar el complejo de proteínas durante la IP. Por lo tanto, epítopo del anticuerpo en la proteína diana no debe ser destruido por reticulación y debe ser accesible para el anticuerpo en IP. Además, la interacción proteína-anticuerpo objetivo debe soportar los lavados estrictas dirigidas a la reducción de las proteínas de fondo no específicas. Estos requisitos para IP éxito pueden evitar que uno que emplea una combinación anticuerpo-epítope particular, sin embargo, debería ser posible encontrar un par de anticuerpos-epítopo adecuado para una proteína de interés. En particular, el epítopo HA-etiqueta y el anticuerpo correspondiente se han utilizado con éxito en este protocolo.
El protocolo descrito se puede utilizar para el aislamiento de complejos de proteínas nativas durante las diferentes etapas de desarrollo y en diferentes tejidos. Aunque se demuestra este método para Drosophila, nuestro protocolo se puede adaptar para otros organismos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler y Jimiao Zheng por su ayuda técnica con este estudio. Este trabajo fue apoyado por NSF CARRERA conceder MCB-1054962 de ALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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