Ett In vivo Tvärbindning metod att isolera proteinkomplex från Drosophila Embryon
Summary
Flerkomponentproteinkomplex spelar avgörande roller under cellfunktion och utveckling. Här beskriver vi en metod som används för att isolera nativa proteinkomplex från Drosophila embryon efter in vivo tvärbindning, följt av rening av de tvärbundna komplex för efterföljande analys struktur-funktion.
Abstract
Många cellulära processer regleras av multisubunit proteinkomplex. Ofta dessa komplex bildar övergående och kräver ursprungliga miljö att montera. Därför, för att identifiera dessa funktionella proteinkomplex, är det viktigt att stabilisera dem in vivo före cellys och efterföljande rening. Här beskriver vi en metod som används för att isolera stora seriösa proteinkomplex från Drosophila embryon. Denna metod är baserad på embryo permeabilisering och stabilisering av komplexen inuti embryon genom in vivo tvärbindning med användning av en låg koncentration av formaldehyd, som lätt kan korsa cellmembranet. Därefter proteinkomplexet av intresse immunrenades följt av gelrening och analyserades genom masspektrometri. Vi illustrerar denna metod med rening av en Tudor proteinkomplex, vilket är avgörande för könsceller utveckling. Tudor är ett stort protein, som innehåller flera Tudor domäner – smallmoduler som interagerar med denaturerad argininer eller lysiner av målproteiner. Denna metod kan anpassas för isolering av nativa proteinkomplex från olika organismer och vävnader.
Introduction
Isolering av multisubunit protein församlingar och DNA-eller RNA-proteinkomplex utförs för att identifiera proteinkomplex, genomisk lokus igen av DNA-bindande regulatoriska proteiner eller RNA-mål av RNA-bindande proteiner. Olika metoder tillåter genomet hela identifiering av DNA-platser som känns igen av transkriptionsfaktorer eller kromatin proteiner (Chip-punkter) 1 och RNA-mål i samband med en given RNA-bindande protein (CLIP-seq) 2. Biblioteken i RNA-härledda cDNA eller DNA-målen sedan djupt sekvens. Dessa metoder använder kemiska eller UV-inducerad tvärbindning för att stabilisera komplexen följt av immunoprecipitation (IP) med en antikropp mot en proteinkomponent av den studerade komplex.
Vid utvecklingen av en organism, många proteinkomplex bildas gående. Därför är det viktigt att analysera sammansättningen och funktionen av dessa komplex in vivo för att förstå de molekylära mekanismer som styr deveckling. Ett sådant in vivo analys skulle vara överlägsen in vitro-metod, eftersom det är nästan omöjligt att återge infödda koncentrationer av de samverkande komponenter och cellulära biokemiska miljö in vitro. Här visar vi en in vivo-metod som vi med framgång använder för att isolera stora proteinkomplex från Drosophila embryon. I denna metod är proteinkomplex i levande embryon som tvärbundits med en låg koncentration av formaldehyd och därefter proteinkomplex av intresse isoleras genom IP med en antikropp mot en känd del av komplexen följt av gelrening av komplexen och masspektrometrianalys till identifiera okända komplexa komponenter. Eftersom formaldehyd kan tränga igenom cellmembranet och har en tvärbindnings intervallet 2,3-2,7 Å 3, kan proteinkomplex tvärbindas in vivo och de komplexa komponenter kommer sannolikt att vara nära varandra. I denna artikel kommer vibeskriva denna metod med användning av isoleringen av Tudor (TuD) proteinkomplex som exempel. TUD är en könsceller protein som är viktigt för könsceller utveckling 4-7. Detta protein innehåller 11 TUD domäner kända för att interagera med denaturerad argininer eller lysiner av andra polypeptider 8-10.
Tidigare har vi genererat en transgen Drosophila linje som uttrycker HA-märkta funktionella TUD 5 och därför är specifika anti-HA-antikropp som används för att dra ner TUD komplex efter tvärbindning.
Förutom protein-protein-tvärbindningar, kan formaldehyd generera nukleinsyra-protein-tvärbindningar och används i Chip-seq experiment. Dessutom, i Drosophila, in vivo tvärbindning med formaldehyd har gjort identifieringen av en RNA-mål på Vasa RNA-helikas protein 11.
Även i den här artikeln beskriver vi en metod för in vivo tvärbindning och purkation av proteinkomplex från Drosophila embryon, kan detta förfarande anpassas för andra organismer och vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formaldehyd har vanligen används som ett tvärbindningsreagens för att identifiera protein-protein och protein-nukleinsyra-interaktioner. Dess bra löslighet och cellmembranpermeabilitet tillsammans med kompatibilitet med nedströms masspektrometri rutiner, gör formaldehyd en idealisk kandidat agent för intracellulära tvärbindningsapplikationer 3,15-17. I synnerhet var det med framgång använts för att identifiera mRNA i samband med Vasa, en kritisk könsceller RNA-helikas i Drosophila 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler och Jimiao Zheng för deras tekniska hjälp med denna studie. Detta arbete stöddes av NSF KARRIÄR bevilja MCB-1054962 till ALA
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694 (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
