Summary
Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.
Abstract
Een paar jaar geleden, de oprichting van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) luidde een nieuw tijdperk in de medische biologie. Mogelijke toepassingen van menselijke iPSCs omvatten modellering pathogenese van menselijke genetische ziekten, autologe celtherapie na gencorrectie en gepersonaliseerde drug screening door middel van een bron van patiënt-specifieke en symptoom relevante cellen. Er zijn echter verschillende hindernissen te overwinnen, zoals het elimineren van de resterende herprogrammering factor transgenexpressie na menselijke iPSCs productie. Wat nog belangrijker is, kunnen de resterende transgene expressie in ongedifferentieerde menselijke iPSCs juiste differentiaties hinderen en misleiden de interpretatie van ziekte-relevante in vitro fenotypes. Met deze reden hebben integratie vrij en / of transgen vrij mens iPSCs ontwikkeld met verschillende methoden, zoals adenovirus, het piggyBac systeem minicircle vector, episomale vectoren, directe eiwitlevering en gesynthetiseerd mRNA. Echter, de efficiëntie van reprogramming gebruik-integratie vrije methoden is vrij laag in de meeste gevallen.
Hier presenteren we een methode menselijke iPSCs isoleren met Sendai-virus (RNA-virus) gebaseerd herprogrammering systeem. Deze herprogrammering werkwijze toont consistente resultaten en hoge efficiëntie kosteneffectieve manier.
Introduction
Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) een capaciteit om te hernieuwen in vitro en hebben pluripotentie, die nuttig kunnen zijn voor ziektemodel kan, voor drug screening, en cel-gebaseerde therapie te ontwikkelen tegen ziekten en verwondingen te behandelen weefsel. Echter, hESCs een beperking voor celvervangingstherapie vanwege immunologische, oncologische en ethische barrières, en ziekte-gerelateerde genen te bestuderen, kon de ziekte-specifieke hESCs worden geïsoleerd door middel van pre-implantatie genetische diagnostiek (PGD) benaderingen, maar het is nog steeds technisch uitdagend en het embryo donaties zijn vrij zeldzaam. Deze problemen zijn gerelateerd aan de voortgang van stamcel biologie, die heeft geleid tot de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs).
Human iPSCs zijn genetisch geprogrammeerd zijn van menselijke volwassen somatische cellen en de haven pluripotente stamcel-achtige functies vergelijkbaar met hESCs, waardoor ze een nuttige bron voor regeneratieve geneeskunde, zoals d maaktvloerkleed ontdekking, ziekte modellering en celtherapie in patiënt-specifieke wijze 1,2.
Tot nu toe zijn er verschillende methoden om menselijke iPSCs genereren, waaronder virus-gemedieerde (retrovirus en adenovirus) 3, niet-virus gemedieerde (BAC systeem en vectoren transfectie) 4 gen transductie en eiwit afgiftesysteem 5-7.
Hoewel een levering van virus gemedieerde genen kunnen zorgen voor een zekere mate van efficiency kunnen virale vectoren genetische voetafdruk verlaten, omdat hun integratie in gastheerchromosomen om herprogrammering genen tot expressie ongecontroleerd. Zelfs wanneer virale integratie van transcriptiefactoren kunnen activeren of inactiveren gastheergenen 8, kan het een onverwachte genetische aberratie en het risico van tumorigenese 5,9 veroorzaken. Anderzijds, de directe invoering van eiwitten of RNA in somatische cellen werden gerapporteerd, maar hebben een aantal nadelen, zoals arbeidsintensieve, herhaalde transfectie, en lage niveau van 7,10 herprogrammeren. Zelfs episomale en niet-integrerende adenovirus, adeno-geassocieerd virus en plasmidevectoren zijn nog relatief minder efficiënt 11. Om deze redenen is het aannemelijk niet-integratie herprogrammering methoden met een hoge werkzaamheid van IPSC generatie en minder genetische afwijkingen kiezen. In deze studie gebruiken we een Sendai-virus gebaseerde herprogrammering. Deze methode staat bekend als niet-geïntegreerd in het gastheergenoom produceert het altijd menselijke iPSCs zonder transgen integraties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Cel en Media (dag 1)
- Cultuur en vergroten humane fibroblasten met DMEM medium dat 10% FBS.
- Plaat humane fibroblasten (Figuur 1) op een 24-wells plaat in de juiste dichtheid per putje op de dag voor transductie.
OPMERKING: De volgende seriële verdunningen worden aanbevolen (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K en 6.25K) omdat verschillende celtypen hebben verschillende gehechtheid vermogen. - Incubeer de cellen gedurende nog een dag in een 37 ° C, 5% CO2 incubator, zodat de cellen volledig verkleefd en uitgebreid.
2. Voer Transduction (Dag 2)
- Op de dag van transductie, controleer dan de celdichtheid en koos voor de meest efficiënte dichtheid putten (figuur 2). Het is beter om drie verschillende dichtheden halen: hoog (80 ~ 90%), midden (50 ~ 70%) en een lage (20 ~ 40%).
- Ten minste 1 uur voor transductie, zuigen de fibroblast media uit de cellen en verander nieuwe 300 ul van fibroblast medium.
- Verwijder een set van 4 verschillende Sendaivirus buizen uit de -80 ° C bewaren. Dooi elke buis op hetzelfde moment in een 37 ° C waterbad gedurende enkele seconden, en neem dan de buizen uit het waterbad. Daarna ontdooien ze op kamertemperatuur; centrifuge buizen bij 6000 xg gedurende 10 seconden en leg ze op ijs tot gebruik. Niet opnieuw invriezen en ontdooien van het virus, omdat de titers niet zal handhaven.
- Voeg de aangegeven hoeveelheden van elk van de vier Sendaivirus buizen (Oct-4, Klf-4, c-Myc en Sox-2) micro-centrifugebuis. Zorg ervoor dat de oplossing goed gemengd is door pipetteren voorzichtig.
Als bijvoorbeeld 50K cellen / putje van een 24-wells plaat Lookwell voor transductie:
(Titer gebaseerd op het Certificate of Analysis van Life Technologies, kunnen verschillen van partij tot partij zijn)
Tube hOct-4 = 6,0 x 10 7 ICB, 3 MOI = 5 ul
Tube hSox-2 = 6,5 x 10 7 ICB, 3 MOI = 4,6 μ; L
Tube hKlf-4 = 6,3 x 10 7 ICB, 3 MOI = 4,8 pl
Tube hc-Myc = 7,8 x 10 7 ICB, 3 MOI = 3,8 pl
Totaal = 18,2 ul van vier virus factoren mengsel / een goed (50K cellen) van de 24-well plaat - Afhankelijk van de cel dichtheden; voeg 2X, 1X, en 0.5X volume van het virus mengsel in de put. Schud de plaat van voor naar achter, links en rechts (2X: 36,4 ul van virus mengsel, 1X: 18.2 ui en 0.5X: 9,1 pi).
- Plaats de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator en incubeer overnacht.
3. Vervanging van Cultuur Medium (dag 3 en dag 5)
- 24 uur na transductie, vervang het medium met 500 ul vers fibroblast medium.
- Op dag 5, veranderen Medium met verse fibroblast media.
4. Bereid MEF Gerechten voor de co-cultuur (Dag 8)
- Bereid MEF cellen in 60 mm cultuur gerechten met 10% FBS bevatte DMEM-medium een day voor passage van de getransduceerde fibroblast op MEF feeder-cellen.
Opmerking: Wij maken gebruik van 5 x 10 5 van MEF in elk 60 mm schaal.
5. Start Co-cultuur Getransduceerde Cellen met MEF Feeder Cells (Dag 9)
- Voordat plating getransduceerde cellen, aspireren 10% FBS bevatte DMEM media van MEF feeder gerechten en voeg verse 10% FBS bevatte DMEM medium.
- Verwijder het medium uit de getransduceerde fibroblasten die in de 24-well plaat en was cellen eenmaal met D-PBS. Voeg 200 ul van 0,25% trypsine / EDTA in de fibroblast cellen inde 24-wells plaat. Na minder dan 5 minuten incubatie met trypsine / EDTA, wanneer de cellen beginnen te los van de plaat, het verzamelen van de cellen met groeimedium in 15 ml conische buis. Centrifugeer ze daarna in 6000 g gedurende 4 minuten.
OPMERKING: Pooling 2X, 1X, en 0.5X virus getransduceerde fibroblast wordt aanbevolen. - Verwijder het supernatant en was opnieuw suspenderende cel pellet met 4-5 ml vers fibroblast medium voor neutralisatie van trypsine. Centrifugeer ze vervolgens bij 135 g gedurende 4 minuten.
- Cellaag seriële verdunning dichtheid en beginnen samen met fibroblast cultuur media op MEF: zoals 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 en 1/128 per 60 mm schaal. Afhankelijk celdood frequentie tijdens de eerste week van transductie, kan men niet hoeft te verdunnen tot 1/2 of 1/128 dichtheid. Opzij zetten overblijvende cellen aan totale RNA-extract als een positieve controle voor Transgene RT-PCR.
- Plaats 60 mm schalen in 37 ° C, 5% CO2 incubator overnacht.
6. Feed menselijke embryonale stamcellen Medium en Bewaken van de Cellen (Dag 10)
- De volgende dag veranderen fibroblast media humane ES-medium met 10 uM Y-27632. Daarna veranderen medium dagelijks met menselijke ES medium: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml Knockout Serum Vervanging + 10 ml L-glutamine + 10 ml 10 mM MEM minimale niet-essentiële aminozuren+ 1 ml 2-mercaptoethanol + 10 ng / ml basic Fibroblast Growth Factor.
- Doe een dagelijkse media verandering met verse menselijke ES media. Na een week, kijk de gerechten eenmaal per 2 ~ 3 dagen onder een microscoop voor de vorming van ES kolonie-achtige cel klonten. Afhankelijk van het celtype, de cultuur meer of minder tijd duren voordat kolonies vertonen.
7. Kiezen van de geïnduceerde pluripotente stamcellen Kolonies en Vouw de Cellen (Dag 20 ~)
- Drie weken na transductie, moet kolonies goed lijken gekweekt voor het plukken.
- De dag voor het plukken van de kolonies, bereiden MEF feeder in 24-well plaat.
LET OP: Wij maken gebruik van 12,5 x 10 5 van MEF in een 24-well plaat. - De volgende dag, veranderen medium van MEF gerechten uit fibroblast media voor de menselijke ES media met 10 uM Y-27632. Handmatig kies er een kolonie op elk tijdstip onder de microscoop in de picking-kap opzetten en kleinere bosjes door pipetteren en overbrengenop vers bereide MEF dishes.Try verschillende klonen halen.
- Passage en uitbreiden van de elk putje van een 24-wells plaat een 6 wells plaat in eerste instantie. Dan van een 6-wells plaat met een 60 mm schalen voor verdere vermeerdering.
8. Karakterisering van Human iPSCs (na 10 Passages)
- Immunofluorescentie
- Plaat menselijke iPSCs in 24-well plaat en cultuur tijdens 4-5 dagen met dagelijks wisselen van materiaal.
- Voor het starten van immunofluorescentiebepaling, was de plaat met D-PBS eenmaal. Bevestig vervolgens de cellen direct in 0,4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten. Daarna Was driemaal in D-PBS gedurende 5 minuten.
- Behandel gefixeerde cellen met 0,1% Triton X-100 oplossing in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het permeabilisering oplossing (0,1% triton X-100 oplossing) en voeg 0,5% BSA blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Voer een detectie van Nanog, oktober-4, SSEA (fase-specifieke embryonale ANTIGnl) en TRA-1-81 (tumorrejectieantigen) gebruik van een anti-humaan antilichaam in 0,5% BSA-oplossing (controleer het materiaal tafel voor antilichaamverdunning tarief). Incubeer primair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was daarna drie keer in D-PBS gedurende 5 minuten elk.
- Controleer met behulp van fluorescentie microscopie na 1 uur incubatie met Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG antilichamen 2e antilichaam, die 1:2.000 verdund in 0,5% BSA-oplossing bij kamertemperatuur. Vlekken op alle kernen van elke MEF feeder cellen en hiPSCs met DAPI.
- RT-PCR Transgene Bevestiging
- Extract totaal mRNA uit cel pellet met behulp van RNA-extractie reagentia.
- Een omgekeerde transcriptie op porties (1 ug) totaal RNA en de resulterende cDNA voor PCR amplificatie door Reverse Transcriptase.
- Bereid de PCR mengsels 2 pi cDNA template, 10 pl 2X PCR Master Mix, 2 ui 2 pmol primers bevatten(Vooruit: 1 ui en omgekeerde: 1 pl) en 6 pl DW. Om genexpressie te detecteren, doe de RT-PCR met de in tabel 1 vermelde primers.
- Voer de RT-PCR met GAPDH gen als controle voor de efficiëntie van de amplificatiereacties. Visualiseren en PCR product geanalyseerd met 1% agarose-gelelektroforese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Meestal geïnfecteerde fibroblasten geen morfologische veranderingen in verscheidene dagen na Sendaivirus transductie tonen, maar vijf dagen later, beginnen ze verschillende vormen (figuur 1) hebben. Zoals beschreven in een rechterpaneel van figuur 1, hebben de cellen geen typische fibroblast morfologie meer. Ze hebben een ronde vorm en grotere kern dan cytoplasma. Zelfs wanneer transductie wordt uitgevoerd in 80% cellulaire confluentie, het lijkt alsof ze zijn minder samenvloeiing in de put nadat ze beginnen te herprogrammeren. Indien dergelijke morfologische veranderingen beginnen te worden gezien in de meeste van de put, getransduceerde fibroblasten gereed zijn uitgeplaat op MEF-feeder kweekschalen.
In ons protocol, we geminimaliseerd celkweek schaal en gaf herprogrammering verschillende mogelijkheden, zoals gebruik van verschillende fibroblast celdichtheid virustiter en vervolgens verscheidene re-plating verhouding MEF die hiPSCs opwekkingsrendement toenemen ( Begin herprogrammering van MEF feeders, is het moeilijk om getransduceerde celtypen te onderscheiden, maar na meer dan een week na co-kweek, gedeeltelijk geherprogrammeerd fibroblasten verschijnen en eruit losgemaakt ES-achtige vorm (fig. 3). Omwille van deze reden, wanneer de menselijke IPSC kolonies zijn klaar voor de passage naar nieuwe MEF feeder schotel, manuele picking is efficiëntere manier voor de overdracht plaats van dissociatie met enzym. In figuur 3 en figuur 4, onder de microscoop enige menselijke iPSCs duidelijke randen, die een duidelijk onderscheid tussen menselijke iPSCs (beschouwd als 'volledig geherprogrammeerd cellen') en 'onvolledig geherprogrammeerd cellen' van morfologie maken. Volledig geherprogrammeerd cellen look als compact en stevig verpakt. Vooral de kolonies hebben duidelijke grens, terwijl gedeeltelijk geherprogrammeerd cellen eruit verzamelen samen om kolonie te maken, maar erg te verliezen en fragiel te breken. Zelfs als we een pipetteren voorzichtig is gemakkelijk los. Zelfs na het uitsluiten gedeeltelijk geherprogrammeerd menselijke iPSCs kolonies (tijdens het uitbreiden van hen en passage), moet volledig geherprogrammeerd menselijke iPSCs te worden gehandhaafd door manuele picking. Na het plukken kolonies en uitbreiding hiPSC klonen in enkele weken, expressie van stemness markers moet worden bepaald. Na expansie van hiPSC klonen we ze verifiëren verschillende testreeksen, waaronder antilichaam kleuring (SSEA4, Oct-4, TRA-81 en Nanog) en RT-PCR van pluripotente marker (gegevens niet getoond) als kwaliteitscontrole. Vergeleken met H9, twee verschillende hiPSCs zijn positief SSEA4, oktober-4, TRA-81, en Nanog. Dit resultaat toont aan dat geïsoleerde menselijke iPSCs verworven pluripotent kwaliteit ( Tenslotte Figuur 6 toont dat we geen transgenexpressie niet kan detecteren hiPSC klonen door RT-PCR. Althans over 10 passages hiPSCs specifieke primers (Tabel 1) exogene Oct-4, Sox-2, Klf-4 en c-Myc kan worden gebruikt met positieve controlemonsters met sterke transgen expressieniveau. Tabel 1. RT-PCR-primers voor Transgene bevestigen. Dit zijn de primersequenties die worden gebruikt voor traNsGene bevestiging. Tm is 50.6 ° C in alle primer sets. 
Figuur 1. Morfologische verandering na Sendaivirus transductie. Vóór de transductie, fibroblasten tonen typische spindel-achtige vorm (links). Ongeveer acht dagen na transductie, morfologie van getransduceerde cel verandering als veel meer ronde vorm (rechts). Klik heer om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 2. Schema van de inductie van plan om maximale efficiëntie te garanderen. Meer dan vier verschillende celtypen kunnen worden uitgeplaat in een 24-putjes plaat (1 tot 4). Omdat de bevestiging vermogen en celoverleving verschillend afhankelijk van de celtypen kunnen zijn, wordt voorgesteld om verschillende celdichtheid (van 200K tot 6.25K cellen per putje) plaat. Bovendien kan virusconcentratie worden aangepast (0.5X, 1X en 2X). 
Figuur 3. Vorming van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen kolonie van getransduceerde fibroblast. In ongeveer twee weken na de re-plating ze in MEF, moet rond kolonies verschijnen en zien eruit als menselijke embryonale stamcellen kolonies. Normaal gesproken is de volledig geherprogrammeerd menselijke IPSC kolonies hebben een zeer duidelijke grenzen. (Pijl: volledig geherprogrammeerd menselijke IPSC kolonies, pijlpunt: gedeeltelijk geherprogrammeerd menselijke iPSCs). Klik hier voor grotere afbeelding . 
Figuur 4. Picking up humane geïnduceerde pluripotente stamcellen kolonies. Menselijke IPSC kolonies worden vaak omringd door gedeeltelijk geherprogrammeerd cellen (links). Onder de microscoop, het plukken van de ES-achtige kolonie alleen, breken in kleine groepjes en vervolgens overdracht (rechts). Na 2 ~ 3 passages, er zijn ongedifferentieerde hiPSC kolonies (onderaan en links). (Pijl: volledig geherprogrammeerd menselijke IPSC kolonies, pijlpunt: gedeeltelijk geherprogrammeerd menselijke iPSCs) Klik hier voor grotere afbeelding . 
Figuur 5. Immunofluorescentiekleuring met stamcellen pluripotent markers. Immunofluorescentieassay toont menselijke iPSCs hebben stemness features.SSEA-4, TRA-81, Nanog, oktober-4as pluripotent markers en DAPI is een controle voor kern kleuring. (A) vertegenwoordigt H9 kleuring als controlemonster. (B) en (C) tonen menselijke iPSC klonen.et = "_blank"> Klik hier voor grotere afbeelding. 
Figuur 6. Bevestiging van transgene expressie niveau. Tenminste na 10-passage cultuur van menselijke iPSCs, silencing van exogene Sox2, Klf-4, c-Myc, en oktober-4 genexpressie niveaus wordt bevestigd door reverse transcriptase polymerase kettingreacties. hGAPDH is een interne controle. Voor een positieve controle wordt RNA geëxtraheerd uit overgebleven getransduceerde fibroblasten (Dag 7 na Sendai-virus infectie). (Laan 1: Marker, lanen 2-6: GAPDH, Klf4, c-Myc, Oct-4 en Sox-2 positieve controle, lanen 7-11: GAPDH, Klf4, c-Myc, Oct-4 en Sox -2 in hiPSCs). Primer Naam <td> Sequence hOCT4 (F) CCC GAA AGA GAA AGC GAA CCA G hOCT4 (R) AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA hMYC (F) TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G hMYC (R) TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG hSOX2 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hSOX2 (R) ATG CGC TGG TTC ACG CCC GCG CCC AGG hKLF4 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hKLF4 (R) CGC GCT GGC AGG GCC GCT GCT CGA C hGAPDH (F) AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG hGAPDH (R) GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Herprogrammeren van menselijke somatische cellen om hiPSCs houdt ongekende beloften in fundamentele biologie, persoonlijke geneeskunde, en transplantatie 12. Voorheen menselijke iPSC generaties vereist DNA-virus dat integratie risico heeft in het gastheergenoom, waarbij ongewenste genetische mutaties die verdere klinische toepassingen zoals ontwikkeling en transplantatie drugtherapie 13 beperken kan maken. Met deze reden zijn veel studies gerapporteerd naar vector-en-transgen vrij systeem menselijke iPSCs genereren door verscheidene alternatieve methoden, maar tegelijkertijd de efficiëntie van het isoleren "voetafdruk free" menselijke iPSCs worden overwogen. Bijvoorbeeld, moet de RNA-virus een minimaal niveau van genetische aberratie te vergelijken met andere methoden 14 hebben, hoewel er geen publicatie voor hele genoom sequencen aan de 'genomic veiligheid' van Sendai-virus gemedieerde IPSC generatie nog aantonen. Hier presenteren we een methode voor het genereren hiPSCs deSendai-virus dat een hoge herprogrammering efficiëntie in kosteneffectieve manier heeft. De resulterende menselijke iPSCs zijn vrij van transgene met behoud van cellulaire en moleculaire overeenkomsten met hESCs in proliferatieve en ontwikkelingspotentieel.
We kunnen verschillende oorsprong van fibroblast (> 4) herprogrammeren tegelijk met slechts een set van de Sendai-virus. En in onze methode, passen we verschillende cel confluences en virusdosis verschillen. Deze 'mix en match' combinatie techniek kan de herprogrammering effectiviteit te maximaliseren. Fibroblasten (van een enkele patiënt) in elk putje een andere virusinfectie niveau, maar door samen te poolen, zou de mogelijkheid van het maken van hiPSCs kolonies te verhogen op basis van onze ervaring. Andere aspecten van de klonale variatie onder hiPSC lijnen zijn proliferatiesnelheid, celaanhechting / overleving, status van X-chromosoom-inactivatie 15, differentiatie potentialen 16, enz. Inderdaad, we hebben geconstateerd dat elke kloon heeft een verschillendent neurale neiging, die kunnen worden voorspeld door het meten van het expressieniveau van een mir-371 cluster. Daarnaast hebben wij kon genereren menselijke iPSCs van menselijke myoblasten met deze methode suggereert dat de Sendai-virus kan worden gebruikt voor vele verschillende celtypen herprogrammeringsproces. Bovendien, met behulp van onze methode, we hebben hiPSCs gegenereerd in meer dan 10 verschillende ziekte-gerelateerde fibroblasten. Gemiddeld kan 5 tot 10 hiPSC klonen verkregen ve fibroblast.
Hoewel de afleiding van transgen vrij mens iPS cellen met het Sendai-virus is de meest efficiënte herprogrammering methode die zou de meest praktische wegen, zijn er enkele beperkingen te worden beschouwd in dit protocol;
- Afhankelijk elke Sendai-virus batch, de virustiter te worden berekend voor een consistente MOI (zoals beschreven in 2.4).
- We zagen de variatie van besmettelijkheid tussen verschillende somatische cellen, die ook moet extra titratie voor Robust virale infectie.
- De Sendai-virus bemiddelde herprogrammering kan worden beschouwd als een van de beste keuzes voor onderzoeksdoeleinden. Maar voor de klinische proef, het misschien niet de eerste keuze, aangezien er een licentie probleem met het bedrijf dat als eerste het Sendai-virus systeem.
- Het duurt ongeveer twee maanden tot de geherprogrammeerd somatische cellen vrij zijn van transgenen, en daarom moeten we de transgenexpressie checken na ten minste 10 passages.
- Het lijkt erop dat de passage nummer van de primaire gekweekte fibroblast de efficiëntie van herprogrammering met de Sendai-virus kunnen beïnvloeden, maar we hebben niet een directe vergelijking. De proliferatiesnelheid moet ook worden bepaald. Verdere onderzoeken zijn nodig om het effect van fibroblasten passage nummers en hun proliferatie van de herprogrammering efficiëntie bepalen.
- In deze studie maken we gebruik van een muis feeder laag voor hiPSC generatie en onderhoud, maar een feeder-free-systeem kan een alternativ zijne manier in een toekomstige studie.
Onze huidige protocol is een belangrijke stap naar het bestuderen van patiënt-specifieke hiPSCs voor de ziekte van modellering, regeneratieve geneeskunde, en andere toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen de leden van de Lee lab bedanken voor waardevolle discussies over het manuscript. Werk in de Lee lab werd ondersteund door subsidies van Robertson Investigator Award van New York Stem Cell Foundation en uit Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5 x 105/6 cm or 12.5 x 105/24-well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1,000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | Cell Signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1,000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1,000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | Invitrogen | 948492 | 1/2,000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | Cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
