Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

Summary

A continuación, presentamos nuestro método establecido para reprogramar las células somáticas humanas en transgenes libre iPSCs humanas con virus Sendai, que muestra resultados consistentes y una mayor eficiencia.

Abstract

Hace unos años, la creación de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) marcó el comienzo de una nueva era en la biomedicina. Los usos potenciales de iPSCs humanos incluyen el modelado patogénesis de enfermedades genéticas humanas, la terapia celular autóloga después de la corrección de genes, y la detección de drogas personalizada, proporcionando una fuente de células relevantes y los síntomas específicos del paciente. Sin embargo, hay varios obstáculos que superar, como la eliminación del factor de reprogramación transgén expresión restante después de la producción iPSCs humanos. Más importante aún, la expresión transgénica residual en iPSCs humanas indiferenciadas podría obstaculizar diferenciaciones adecuadas y confundir a la interpretación de los fenotipos in vitro relevantes enfermedad. Con este motivo, se han desarrollado-la integración libre y / o iPSCs humanos transgenes gratis con varios métodos, como el adenovirus, el sistema piggyBac, minicircle vector, vectores episomales, entrega directa de proteínas y ARNm sintetizado. Sin embargo, la eficiencia de reprogramming utilizando métodos de integración libre es bastante bajo en la mayoría de los casos.

A continuación, presentamos un método para aislar iPSCs humanos mediante el uso de Sendai-virus (virus RNA) sistema de reprogramación en base. Este método de reprogramación muestra resultados consistentes y de alta eficiencia en forma rentable.

Introduction

Las células madre embrionarias (hESCs) tienen una capacidad de auto-renovación in vitro y tienen la pluripotencia, lo que podría ser potencialmente útil para el modelado de la enfermedad, para la detección de drogas, y para el desarrollo de terapias basadas en células para tratar lesiones de la enfermedad y del tejido. Sin embargo, hESCs tienen una limitación para la terapia de reemplazo de la célula debido a las barreras inmunológicas, oncológicas y éticas, y para estudiar los genes relacionados con la enfermedad, hESCs específicos de la enfermedad pueden ser aislados a través de pre-implantación diagnóstico genético (PGD) se acerca, pero sigue siendo un reto técnico y las donaciones de embriones son bastante raros. Estos problemas están relacionados con el progreso en la biología de células madre, lo que ha llevado al desarrollo de células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs).

IPSCs humanos se reprograman genéticamente a partir de células somáticas adultas humanas y albergan características madre pluripotentes similares a células similares a hESCs, que los convierte en una fuente útil para la medicina regenerativa, como ddescubrimiento alfombra, el modelado de la enfermedad y la terapia celular en forma específica para cada paciente ^1,2.

Hasta ahora, hay varios métodos para generar iPSCs humanos, incluyendo mediada por virus (retrovirus y adenovirus) ^3, no el virus mediada (sistema de BAC y vectores de transfección) ⁴ transducciones de genes, y del sistema de administración de proteínas ^5-7.

Aunque una entrega de genes mediada por virus puede garantizar un cierto nivel de eficiencia, vectores virales podrían dejar huella genética, debido a que se integran en los cromosomas del hospedador para expresar genes de reprogramación de una manera incontrolada. Incluso cuando la integración viral de factores de transcripción puede activar o inactivar genes de acogida ^8, que puede causar una aberración genética inesperado y el riesgo de ^5,9 tumorigénesis. Por otra parte, se informó de la introducción directa de proteínas o ARN en las células somáticas, pero tienen algunas desventajas tales como, transf repetida mano de obra intensivaexión, y el bajo nivel de la reprogramación de ^7,10. Incluso episomal y no la integración de adenovirus, virus adeno-asociados, y vectores plasmídicos son todavía relativamente menos eficiente ^11. Por estas razones, es plausible para elegir métodos de reprogramación no-integración con alta eficacia de generación de IPSC y un menor número de anomalías genéticas. En este estudio, utilizamos una reprogramación basada Sendai-virus. Este método es conocido por ser no integrado en el genoma huésped y produce consistentemente iPSCs humanos sin integraciones transgén.

Protocol

1. Preparación de la célula y Medios de Comunicación (Día 1) Cultura y ampliar fibroblastos humanos con medio DMEM que contiene 10% de SFB. Placa fibroblastos humanos (Figura 1) en una placa de 24 pocillos a una densidad apropiada por pozo en el día antes de la transducción. NOTA: Se recomiendan las siguientes diluciones en serie (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K y 6,25), ya que los diferentes tipos de células tienen diferente capacidad de unión. …

Representative Results

Por lo general, los fibroblastos infectados no muestran cambios morfológicos en varios días después de la transducción de virus Sendai, pero cinco días después, empiezan a tener diferentes formas (Figura 1). Como se describe en un panel de la derecha de la Figura 1, las células no tienen la morfología típica de fibroblastos más. Ellos tienen una forma redonda y el núcleo más grande que el citoplasma. Incluso cuando la transducción se realiza en el 80% de confluencia celular…

Discussion

La reprogramación de las células somáticas humanas con hiPSCs sostiene promesas sin precedentes en la biología básica, la medicina personal, y el trasplante ^12. Anteriormente, las generaciones IPSC humanos necesarios virus de ADN que tiene riesgo de integración en el genoma huésped, que puede crear mutaciones genéticas indeseables que limitan otras aplicaciones clínicas tales como el desarrollo de medicamentos y terapias de trasplante ^13. Con este motivo, se ha informado de muchos estudios…

Materials

CytoTune-iPS Reprogramming Kit	invitrogen	A1378002
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated	Global stem	GSC-6105M	5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X	invitrogen	25200114
DMEM/F-12 medium	invitrogen	11330-032
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 uM (Stock: 10 mM)
basic fibroblast growth factor	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Stock : 100 ug)
Knock-out serum replacement	Gibco	10828028
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)	invitrogen	11965118
Fetal bovine serum	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	LIFE TECHNOLOGIES	11140050	1/100
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid	GIBCO	21985023	1/1000
Hausser Phase Contrast Hemacytometers	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	cell signaling	4745S	1/200
mouse monoclonal Oct4 antibody	Santa Cruz	SC-5279	1/1000
Nanog	R&D	AF1997	1/1000
Alexa Flouor 488 goat anti-mouse	invitrogen	948492	1/2000
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium	cellgro	21-031-CV
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	invitrogen	15596018
picking hood	NuAire	NU-301
dissecting scope	Nikon	SMZ745