Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

Summary

Här presenterar vi vår etablerade metoden för att programmera om mänskliga somatiska celler i transgena fria humana iPSCs med Sendai-virus, som visar konsekvent resultat och ökad effektivitet.

Abstract

För några år sedan, inrättandet av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) inleddes en ny era inom biomedicin. Potentiella användningsområden för mänskliga iPSCs inkluderar modellering patogenes av genetiska sjukdomar, autologa cellterapi efter gen korrigering, och personlig drogscreening genom att tillhandahålla en källa av patientspecifika och symptom relevanta celler. Det finns emellertid flera hinder att övervinna, såsom eliminering av återstående omprogrammering faktor transgen expression efter humana iPSCs produktion. Ännu viktigare, kan rest transgenuttryck i odifferentierade humana iPSCs hämmar ordentlig indelningar och vilseleda tolkningen av sjukdoms relevanta in vitro fenotyper. Med denna anledning har integration fria och / eller transgena fria mänskliga iPSCs tagits fram med hjälp av flera metoder, såsom adenovirus, den piggyBac systemet minicircle vektor, episomala vektorer, direkt protein leverans och syntetiserade mRNA. Men effektiviteten hos reprogramming använder integrationsfria metoder är ganska låg i de flesta fall.

Här presenterar vi en metod för att isolera mänskliga iPSCs med Sendai-virus (RNA-virus) baserad omprogrammering systemet. Denna omprogrammering metod visar konsekventa resultat och hög effektivitet i kostnadseffektivt sätt.

Introduction

Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har en förmåga att själv förnya in vitro och har pluripotens, vilket kan vara potentiellt användbara för sjukdomsmodellering, för drogscreening, och att utveckla cellbaserade terapier för behandling av sjukdomar och vävnadsskada. Men hESCs har en begränsning för cellersättningsterapi på grund av immunologiska, onkologiska och etiska hinder, samt för att studera sjukdomsrelaterade gener, kan sjukdomsspecifika hESCs isoleras genom preimplantatorisk genetisk diagnostik (PGD) närmar sig, men det är fortfarande tekniskt utmanande och embryodonationer är ganska sällsynta. Dessa frågor är relaterade till framsteg i stamcellsbiologi, vilket har lett till utvecklingen av inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs).

Mänskliga iPSCs är genetiskt omprogrammeras från humana vuxna somatiska celler och hamnen pluripotenta stamcellsliknande egenskaper som liknar hESCs, vilket gör dem en användbar källa för regenerativ medicin såsom dmatta upptäckt, modellering sjukdom och cellterapi vid patientspecifikt sätt ^1,2.

Tills nu, det finns flera metoder för att generera humana iPSCs, inklusive virusmedierad (retrovirus och adenovirus) ^3, icke-virusmedierad (BAC Organ och vektorer transfektion) ^fyra gense transduktioner och proteinleveranssystem ^5-7.

Även en leverans av virusmedierade gener kan garantera en viss nivå av effektivitet, kan virala vektorer lämna genetiska avtryck, eftersom de integreras i värdkromosomer att uttrycka omprogrammering gener på ett okontrollerat sätt. Även när viral integration av transkriptionsfaktorer kan aktivera eller inaktivera värdgener ^8, kan det orsaka en oväntad genetisk avvikelse och risken för tumörbildning ^5,9. Å andra sidan, var det direkta införandet av proteiner eller RNA till somatiska celler rapporterats, men har vissa nackdelar, såsom arbetskrävande, upprepade transfektion och låga omprogrammering ^7,10. Även episomala och icke-integrerande adenovirus, adeno-associerat virus, och plasmidvektorer är fortfarande relativt hög förbrukning ^11. Av dessa skäl är det rimligt att välja icke-integration omprogrammering metoder med hög effekt för iPSC generation och färre genetiska avvikelser. I denna studie använder vi en Sendai-virus baserad omprogrammering. Denna metod är känd för att vara icke-integrerad i värdgenomet och konsekvent producerar mänskliga iPSCs utan transgena integrationer.

Protocol

1. Beredning av cell-och media (Dag 1)

1. Kultur och expandera human fibroblast med DMEM-medium innehållande 10% FBS.
2. Tallrik humana fibroblaster (figur 1) på en 24-brunnsplatta vid en lämplig densitet per brunn dagen före transduktion.
   OBS: Följande seriespäd rekommenderas (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K och 6.25K) eftersom olika celltyper har olika fästförmåga.
3. Inkubera cellerna för en dag i ett 37 ° C, 5% CO ₂ inkubator, se till att cellerna har helt anslutit sig och utvidgas.

2. Utför Transduktion (Dag 2)

1. På dagen för transduktion, ta en celldensiteten och valde de mest effektiva densitet brunnar (Figur 2). Det är bättre att plocka tre olika densiteter: hög (80 ~ 90%), mellersta (50 ~ 70%) och låg (20 ~ 40%).
2. Minst en timme före transduktion, aspirera fibroblast media från cellerna och ändra nya 300 ul av fibroblast-medium.
3. Ta bort en uppsättning av 4 olika Sendai virus rör från -80 ° C förvaring. Tina varje rör samtidigt i ett 37 ° C vattenbad i några sekunder, och sedan ta rören ut ur vattenbadet. Efter det, tina dem till rumstemperatur; centrifugrör vid 6000 xg under 10 sekunder och placera dem på is tills användning. Återanvänd inte frysa och tina viruset eftersom titrar inte kommer att behålla.
4. Lägg de indikerade volymerna av vardera av de fyra Sendaivirus rör (Oct-4, Klf-4, c-Myc och Sox-2) till mikrocentrifugröret. Se till att lösningen blandas väl genom att pipettera försiktigt.
   Till exempel, om 50K celler / en brunn av 24-brunnsplatta lookwell för transduktion:
   (Titer baserat på analyscertifikatet från Life Technologies, kan skilja sig från parti till parti)
   Rör hOct-4 = 6,0 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 5 ^
   Tube hSox-2 = 6,5 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 4,6 μ; L
   Rör hKlf-4 = 6,3 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 4.8 l
   Tube hc-Myc = 7,8 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 3.8 l
   Totalt = 18.2 l av fyra virusfaktorer blandning / en väl (50K celler) av 24-brunnar
5. Beroende på celltäthet; lägga till 2X, 1X, och 0,5 X volym av viruset blandningen i brunnen. Skaka försiktigt plattan framifrån och bakåt, vänster och höger (2X: 36.4 l av virusblandning, 1X: 18,2 il och 0,5 X: 9,1 l).
6. Placera cellerna i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator och inkubera över natten.

3. Byte av odlingsmedium (Dag 3 & Dag 5)

1. 24 timmar efter transduktion, ersätta mediet med 500 l färska fibroblast medium.
2. Dag 5, byta medium med färska fibroblast media.

4. Förbered MEF Rätter för Co-kultur (Dag 8)

1. Förbered MEF celler i 60 mm odlingsskålar med 10% FBS innehöll DMEM-medium en day innan passaging den omvandlade fibroblast på MEF feeder-celler.
   OBS: Vi använder oss av 5 x 10 ⁵ MEF i varje 60 mm maträtt.

5. Starta Co-kultur omvandlade celler med MEF matarceller (dag 9)

1. Innan plätering omvandlade celler, innehöll aspirera 10% FBS DMEM media från MEF matare rätter och lägg färska 10% FBS innehöll DMEM-medium.
2. Avlägsna mediet från de transducerade fibroblaster som finns i 24-brunnar och tvätta cellerna en gång med D-PBS. Addera 200 pl av 0,25% trypsin / EDTA in i fibroblastceller inthe 24-brunnar. Efter mindre än 5 min inkubation med trypsin / EDTA, när cellerna börjar att lossna från plattan, samla upp cellerna med tillväxtmedium i 15 ml koniska rör. Centrifugera dem sedan i 6000 xg under 4 min.
   OBS: Sammanslagning 2X, 1X, och 0,5 X virus omvandlade fibroblast rekommenderas.
3. Avlägsna supernatanten mediet och tvätta på nytt avbrytacellpelleten med 4-5 ml färskt fibroblast mediet för neutralisering av trypsin. Centrifugera dem Sedan vid 135 xg under 4 min.
4. Plate celler som seriespädtäthet och börja att samarbeta kultur med fibroblast media på MEF: t.ex. 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 och 1/128 per 60 mm skål. Beroende på celldödshastighet under den första veckan av transduktion, kan en inte behöver spädas till 1/2 eller 1/128 densitet. Bortse återstående cellerna för att extrahera totalt RNA som en positiv kontroll för Transgene RT-PCR.
5. Placera 60 mm plattor i 37 ° C, 5% _{CO2-inkubator} över natten.

6. Mata mänskliga embryonala stamcells Medium och Övervaka celler (dag 10)

1. Nästa dag, ändra fibroblast medier för human ES media med 10 ^ M Y-27.632. Efter det, ändra medel dagligen med human ES medium: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml Knockout Serum Byte + 10 ml L-glutamin + 10 ml 10 mM MEM minsta icke-essentiella aminosyror+ 1 ml 2-merkaptoetanol + 10 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor.
2. Gör en daglig medieförändring med färska humana ES-media. Efter en vecka, kolla disken en gång per 2 ~ 3 dagar under ett mikroskop för bildandet av ES koloniliknande cellklumpar. Beroende på celltypen, kommer kulturen ta mer eller mindre tid innan kolonier hittades.

7. Plocka Induced pluripotenta stamceller kolonier och Expandera Cells (Dag 20 ~)

1. Tre veckor efter transduktion, bör kolonier visas vuxit ordentligt för att plocka.
2. Dagen innan plocka kolonierna, förbereda MEF matare i 24-brunnar.
   OBS: Vi använder 12,5 x 10 ⁵ av MEF i en 24-brunnar.
3. Nästa dag, byta medium MEF rätter från fibroblast media till human ES media med 10 ^ M Y-27632. Plocka manuellt en koloni vid varje tidpunkt under mikroskop i plock-huva och göra mindre klumpar genom att pipettera och överföra dempå nyligen beredd MEF dishes.Try att plocka flera kloner.
4. Passage och expandera varje brunn från en 24-brunnar till en 6 brunnar från början. Sedan från en 6-brunnar till en 60 mm rätter innan vidare förökning.

8. Karakterisering av Human iPSCs (efter 10 passager)

1. Immunofluorescens
   1. Plate mänskliga iPSCs i 24-brunnar och kultur under 4-5 dagar med daglig media förändring.
   2. För att starta immunofluorescensanalys, tvätta plattan med D-PBS gång. Fixa Då cellerna omedelbart i 0,4% paraformaldehyd under 30 min. Därefter tvättas tre gånger i D-PBS under 5 min.
   3. Behandla fixerade cellerna med 0,1% Triton X-100-lösning i PBS under 15 min vid rumstemperatur.
   4. Aspirera permeablization-lösning (0,1% Triton X-100-lösning), tillsätt sedan 0,5% BSA-blockeringslösning under 1 timme vid rumstemperatur.
   5. Gör en upptäckt av Nanog, oktober-4, SSEA (stadium specifika embryonala antigen) och TRA-1 till 81 (tumöravstötningsantigen) med användning av en anti-human-antikropp i 0,5% BSA-lösning (kontrollera materialet tabell för utspädning antikropp hastighet). Inkubera primär antikropp under 2 timmar vid rumstemperatur. Tvätta sedan tre gånger i D-PBS under 5 min vardera.
   6. Kontrollera med hjälp av fluorescensmikroskopi efter 1 timme av inkubering med Alexa Fluor 488 get anti-mus IgG-antikroppar som ^{2: a} antikropp, som är utspädd 1:2000 i 0,5% BSA-lösning vid rumstemperatur. Färga alla kärnor av varje MEF matarceller och hiPSCs med DAPI.
2. RT-PCR av Transgene Bekräftelse
   1. Extrahera total mRNA från cellpelleten genom användning av RNA extraktionsreagens.
   2. Gör en omvänd transkription på alikvoter (1 mikrogram) av total-RNA och den resulterande cDNA för PCR-amplifiering av omvänt transkriptas.
   3. Förbered PCR-blandningar för att innehålla 2 pl cDNA mall, 10 pl 2X PCR Master Mix, 2 pl av 2 pmol primers(Framåt: 1 pl och bakåt: 1 l) och 6 pl DW. För att detektera genuttryck, gör RT-PCR med primers som listas i tabell 1.
   4. Utför RT-PCR med GAPDH-genen som en kontroll för effektivitet amplifieringsreaktionerna. Visualisera och analysera PCR-produkten med 1% agaros-gelelektrofores.

Representative Results

Vanligtvis infekterade fibroblaster visar inte några morfologiska förändringar i flera dagar efter Sendaivirus transduktion, men fem dagar senare, börjar de att ha olika former (Figur 1). Som beskrivs i en högra panelen i figur 1, har cellerna inte något typiskt fibroblast morfologi längre. De har en rund form och större kärna än cytoplasma. Även när transduktion utförs i 80% cellulär konfluens, det ser ut som de är mindre sammanflytande i brunnen efter att de börjar programmera. Om dessa typer av morfologiska förändringar börjar synas i de flesta av de bra, omvandlade fibroblaster är redo att vara klädd på MEF-matar kultur rätter.

I våra protokoll, minimerade vi cellodling skala och dessutom gav olika omprogrammering möjligheter, till exempel att använda olika fibroblastcellinje densitet och virus titer, och därefter flera re-plating förhållande MEF, som kommer att öka hiPSCs produktionseffektiviteten (

I början av omprogrammering på MEF matare, är det svårt att skilja omvandlade celltyper, men efter mer än en vecka från co-kultur, delvis omprogrammerade fibroblaster verkar och ser ut som lossade ES-liknande form (Figur 3). På grund av denna anledning när mänskliga IPSC kolonier är redo för passage in i nya MEF matare maträtt, är manuell plockning effektivare sätt för överföring i stället för dissociation med enzym.

I figur 3 och figur 4, under mikroskopet endast mänskliga iPSCs har tydliga kanter, som gör en klar åtskillnad mellan mänskliga iPSCs (betraktas som "helt omprogrammerade celler") och "ofullständigt omprogrammerade celler" av morfologi. Fullt omprogrammerade celler look som kompakt och tätt packade. Speciellt kolonierna har tydlig gräns, medan delvis omprogrammerade cellerna ser ut som att samla ihop till kolonin men mycket att förlora och sköra att bryta ner. Även om vi gör en pipett försiktigt det enkelt loss. Även efter exklusive delvis omprogrammerade mänskliga iPSCs kolonier (under utöka dem och passaging), fullt omprogrammerade mänskliga iPSCs måste upprätthållas genom manuell plockning.

Efter plocka kolonier och expanderande hiPSC kloner i flera veckor, måste uttrycket av stemness markörer som skall bestämmas. Efter utbyggnaden av hiPSC kloner, vi kontrollera dem med olika typer av tester, inklusive antikroppsfärgning (SSEA4, oktober-4, TRA-81 och Nanog) och RT-PCR av pluripotenta markör (data visas inte) som en kvalitetskontroll.

Jämfört med H9, två olika hiPSCs är positiva till SSEA4, oktober-4, TRA-81, och Nanog. Detta resultat visar att isolerade humana iPSCs förvärvade pluripotenta kvalitet (

Slutligen Figur 6 visar att vi inte kan påvisa någon transgen uttryck i hiPSC kloner med RT-PCR. Åtminstone över 10 passager hiPSCs, specifika primers (tabell 1) för exogen oktober-4, Sox-2, Klf-4 och c-Myc kan användas med positiva kontrollprover med stark transgenexpression nivå.

Figur 1. Morfologisk förändring efter Sendai-virus-transduktion. Före transduktion, fibroblaster visar typiska spindelliknande form (vänster). Ungefär åtta dagar efter transduktion, morfologi transducerad cellförändringar som mycket mer rund form (till höger). Klicka here för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Diagram av induktions plan för att säkerställa maximal effektivitet. Över fyra olika celltyper kan beläggas med en 24-brunnsplatta (från 1 till 4). Eftersom deras fästförmåga och cellöverlevnad kan vara olika beroende på celltyper, föreslås till tallrik olika celltäthet (från 200K till 6.25K celler per brunn). Dessutom kan viruskoncentration justeras (0,5 X, 1X och 2X).

Figur 3. Bildning av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller koloni från transducerad fibroblast. I ungefär två veckor efter re-plating dem i MEF, bör runda kolonier verkar och ser ut som mänskliga embryonala stamcellskolonier. Normalt fullt omprogrammerade mänskliga IPSC kolonier har väldigt tydliga gränser. (Arrow: helt omprogrammeras mänskliga IPSC kolonier, pilspets: delvis omprogrammeras mänskliga iPSCs). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. Plocka upp mänskliga inducerade pluripotenta stamcellskolonier. Mänskliga IPSC kolonier är ofta omgivna av delvis omprogrammerade celler (vänster). Under mikroskop, plocka ES-liknande koloni endast, bryta ner i små klumpar och därefter överföring (till höger). Efter 2 ~ 3 passager, finns det odifferentierade hiPSC kolonier (nederst & vänster). (Arrow: helt omprogrammerade mänskliga IPSC kolonier, pilspets: delvis omprogrammeras mänskliga iPSCs) Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5. Immunofluorescensfärgning med stamcells pluripotenta markörer. Immunofluorescens analys visar mänskliga iPSCs har stemness features.SSEA-4, TRA-81 är Nanog, oktober-4aS pluripotenta markörer och DAPI en kontroll för nukleär färgning. (A) representerar H9 färgning som ett kontrollprov. (B) och (C) visar mänskliga IPSC kloner.et = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 6. Bekräftelse av transgenuttryck nivå. Åtminstone efter 10-passage kultur av mänskliga iPSCs, tysta av exogena Sox2, Klf-4, c-Myc, och okt-4 genuttryck nivåer bekräftas av omvänt transkriptas polymeras kedjereaktioner. hGAPDH är en intern kontroll. För en positiv kontroll, är RNA extraherat från överblivna omvandlade fibroblaster (dag 7 efter Sendai-virusinfektion). (spår 1: Marker, lanes 2-6: GAPDH, Klf4, c-Myc, oktober-4, och Sox-2 i positiv kontroll, lanes 7-11: GAPDH, Klf4, c-myc, oktober-4, och Sox -2 i hiPSCs).

<td> Sekvens

Primer Namn
hOCT4 (F)	CCC GAA AGA GAA AGG GAA CCA G
hOCT4 (R)	AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA
hMYC (F)	TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G
hMYC (R)	TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG
hSOX2 (F)	ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G
hSOX2 (R)	ATG CGC TGG TTC ACG CCC GCG CCC AGG
hKLF4 (F)	ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G
hKLF4 (R)	CGC GCT GGC AGG GCC GCT GCT CGA C
hGAPDH (F)	AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG
hGAPDH (R)	GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT

Tabell 1. RT-PCR-primrar för transgen bekräftelsen. Dessa är de primersekvenser som används för transgene bekräftelsen. _Tm är 50,6 ° C i alla de primeruppsättningar.

Discussion

Omprogrammering mänskliga somatiska celler till hiPSCs rymmer oanade löften i grundläggande biologi, personlig medicin, och transplantation ^12. Tidigare mänskliga IPSC generationer krävs DNA-virus som har risk integrering i värdgenomet, vilket kan skapa oönskade genetiska mutationer som begränsar ytterligare kliniska tillämpningar såsom läkemedelsutveckling och transplantationsterapier ^13. Med denna anledning har många studier rapporterats att generera vektor-och transgena fria systemet mänskliga iPSCs av flera alternativa metoder, men samtidigt, effektivitet isolera "fotavtryck fri" mänskliga iPSCs bör övervägas. Till exempel bör det RNA-virus har en minimal nivå av genetisk avvikelse jämfört med andra metoder ^14, även om det inte finns någon publikation för hela genom sekvensering för att visa "iska säkerhet" av Sendai-virus-medierad iPSC generationen ännu. Här presenterar vi en metod för generering hiPSCs medSendai-virus, som har en hög omprogrammering effektivitet i kostnadseffektivt sätt. De resulte mänskliga iPSCs är fria från transgenen med underhåll av cellulära och molekylära likheter med hESCs i proliferativ och utvecklingspotential.

Vi kan programmera olika ursprung av fibroblast (> 4) på ​​samma gång med endast en uppsättning av Sendai-virus. Och i vår metod, vi tillämpar olika cellsammanflöden och virus doseringsskillnader. Denna "mix and match" kombinationen teknik kan maximera omprogrammering effektivitet. Fibroblaster (från en enda patient) i varje brunn har en annan virusinfektion nivå, men genom att samla ihop, kan möjligheten att göra hiPSCs kolonier ökar baserat på vår erfarenhet. Andra frågor av den klonala variationen bland hiPSC linjer är spridningshastigheten, cellbindning / överlevnad, status för X-kromosom inaktivering ^15, potentialer differentiering ^16, etc. I själva verket konstaterade vi att varje klon har en skiljer sigent neural benägenhet, vilket kunde förutsägas genom att mäta expressionsnivån av en MIR-371 klustret. Dessutom har vi lyckats generera humana iPSCs från humana myoblaster med denna metod, vilket tyder på att Sendai-virus kan användas till många olika celltyper i omprogrammering process. Dessutom, med hjälp av vår metod har vi genererat hiPSCs i mer än 10 olika sjukdomsrelaterade fibroblaster. I genomsnitt kunde 5-10 hiPSC kloner erhållas från en fibroblast.

Även om härledningen av transgen fria mänskliga iPS-celler med Sendai-virus är den mest effektiva omprogrammering metod som kan vara den mest praktiska vägar, finns det några begränsningar som måste beaktas i detta protokoll;
- Beroende på var och en Sendai-virus-batch, behöver virustiter beräknas för konsekvent MOI (som beskrivs i 2.4).
- Vi observerade variationen av smittsamhet mellan olika somatiska celler, som också behöver ytterligare titrering för Robust virusinfektion.
- Den Sendaivirus medierad omprogrammering kan betraktas som en av de bästa valen för forskningsändamål. Men för den kliniska prövningen, kan det inte vara det första valet, eftersom det finns en licensfrågan med det företag som ursprungligen utvecklades i Sendai virus system.
- Det tar ungefär två månader tills de omprogrammerade somatiska celler är fria från transgener, det är därför vi måste kontrollera transgenexpression efter minst 10 passager.
- Det verkar som att passagen antalet primär odlade fibroblaster kan påverka effektiviteten av omprogrammering med Sendai-virus, även om vi inte har en direkt jämförelse. Den proliferationshastighet måste också bestämmas. Ytterligare studier behövs för att fastställa effekten av fibroblaster passagenummer och deras spridning på omprogrammering effektivitet.
- I denna studie använder vi en mus matarskikt för hiPSC generering och underhåll, men en matarfria systemet kan vara ett Alternative sätt i en framtida studie.

Vår nuvarande protokollet har varit ett viktigt steg mot att studera patientspecifika hiPSCs för sjukdomsmodellering, regenerativ medicin, och andra applikationer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CytoTune-iPS Reprogramming Kit	Invitrogen	A1378002
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated	Global stem	GSC-6105M	5 x 105/6 cm or 12.5 x 105/24-well plate
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 medium	Invitrogen	11330-032
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μM (Stock: 10 mM)
basic fibroblast growth factor	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Stock : 100 ug)
Knock-out serum replacement	Gibco	10828028
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)	Invitrogen	11965118
Fetal bovine serum	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	LIFE TECHNOLOGIES	11140050	1/100
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid	GIBCO	21985023	1/1,000
Hausser Phase Contrast Hemacytometers	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	Cell Signaling	4745S	1/200
mouse monoclonal Oct4 antibody	Santa Cruz	SC-5279	1/1,000
Nanog	R&D	AF1997	1/1,000
Alexa Flouor 488 goat anti-mouse	Invitrogen	948492	1/2,000
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
picking hood	NuAire	NU-301
dissecting scope	Nikon	SMZ745