Summary
כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.
Abstract
לפני כמה שנים, הקמת התאים האנושיים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) הובילה עידן חדש ביו. שימושים פוטנציאליים של iPSCs אדם כוללים פתוגנזה מודלים של מחלות גנטיות אנושיות, טיפול בתאים עצמיים לאחר תיקון הגן, והקרנת תרופה מותאמת אישית על ידי מתן מקור של תאים רלוונטיים מטופל ספציפי וסימפטום. עם זאת, ישנם מספר מכשולים להתגבר, כגון ביטול ביטוי transgene גורם תכנות מחדש שנותר לאחר ייצור iPSCs האדם. חשוב מכך, ביטוי transgene שייר בiPSCs אדם שלא עברו התמיינות יכול לעכב בידול נכון ולהטעות את הפרשנות של מחלה רלוונטית בפנוטיפים מבחנה. עם מסיבה זו, ללא אינטגרציה ו / או iPSCs אדם נטול transgene פותחו באמצעות מספר שיטות, כגון אדנווירוס, מערכת piggyBac, וקטור minicircle, וקטורי episomal, אספקת חלבון ישירה ומסונתזת ה-mRNA. עם זאת, יעילות של reprogramming תוך שימוש בשיטות ללא אינטגרציה הוא נמוך למדי ברוב המקרים.
כאן, אנו מציגים שיטה לבודד iPSCs אדם באמצעות סנדאי וירוס מערכת מבוססת תכנות מחדש (וירוס RNA). שיטת תכנות מחדש זה מראה תוצאות עקביות ויעילות גבוהה באופן חסכוני.
Introduction
תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יש יכולת pluripotency העצמי לחדש במבחנה ויש לי, שיכול להיות שעשוי להיות שימושי עבור מודלים מחלה, להקרנת סמים, ולפתח טיפולים מבוססי תאים לטיפול בפציעות מחלות ורקמות. עם זאת, יש לי hESCs הגבלה לטיפול בתחליפי תא בגלל מחסומים חיסוניים, אונקולוגי ואתיים, וללמוד גנים הקשורים למחלות, יכול להיות מבודד hESCs ספציפי למחלה באמצעות אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) מתקרב, אבל זה עדיין מאתגר מבחינה טכנית ותרומות העובר הן די נדירות. סוגיות אלה קשורות להתקדמות בביולוגיה של תאי גזע, מה שהוביל להתפתחותם של תאים מושרה pluripotent גזע (hiPSCs).
iPSCs האנושי לתכנות מחדש מבחינה גנטית מתאי סומטיים מבוגר אנושיים ונמל תכונות גזע pluripotent דמוי תא דומה לhESCs, מה שהופך אותם למקור שימושי עבור רפואת רגנרטיבית כגון דגילוי שטיח, דוגמנות מחלה וטיפול בתאים ב1,2 אופן ספציפי למטופל.
עד עכשיו, יש כמה 3, מערכת אספקת חלבון 5-7 (מערכת BAC וtransfection וקטורים) שאינו וירוס בתיווך 4 transductions גן, ושיטות ליצירת iPSCs אדם, לרבות בתיווך וירוסים (רטרווירוס וadenovirus).
למרות שמשלוח של גנים בתיווך וירוס יכול להבטיח רמה מסוימת של יעילות, וקטורים ויראליים יכולים להשאיר טביעת רגל גנטית, כי הם להשתלב בכרומוזומים מארח לבטא גנים תכנות מחדש באופן בלתי מבוקר. גם כאשר אינטגרציה נגיפית של גורמי שעתוק יכולה להפעיל או להשבית גנים מארח 8, זה יכול לגרום לסטייה גנטית בלתי צפויה ואת הסיכון להיווצרות גידול ב5,9. מצד השני, ההקדמה הישירה של חלבונים או RNA לתאים סומטיים דווחו, אבל יש כמה חסרונות כגון transf עתיר עבודה, חוזר ונשנהection, ורמה הנמוכה של תכנות מחדש של 7,10. וקטורי adenovirus אפילו episomal ולא שילוב, וירוס adeno הקשורים, ופלסמיד עדיין יחסית פחות יעילים 11. מסיבות אלה, סביר לבחור שיטות תכנות מחדש ללא שילוב עם יעילות גבוהה של דור iPSC ומומים גנטיים פחות. במחקר זה, אנו משתמשים בתכנות מחדש המבוסס סנדאי וירוס. שיטה זו ידועה להיות שאינה משתלב בגנום המארח ובעקביות מייצרת iPSCs האנושי ללא אינטגרציות transgene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת נייד ומדיה (יום 1)
- תרבות ולהרחיב פיברובלסטים אנושיים עם תקשורת DMEM המכילה 10% FBS.
- fibroblasts צלחת אדם (איור 1) על גבי צלחת 24 גם בצפיפות המתאימה לכל גם ביום שלפני התמרה.
הערה: דילולים סדרתי הבאים מומלצים (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K ו6.25K) בגלל שיש לי תאים מסוגים שונים יכולת התקשרות שונה. - דגירה תאים לעוד יום אחד במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור, על מנת להבטיח את התאים יש דבק באופן מלא ומורחבים.
2. בצע התמרה (יום 2)
- ביום של התמרה, לבדוק את צפיפות התאים ובחר בארות צפיפות היעילה ביותר (איור 2). עדיף לבחור שלוש צפיפויות שונות: (80 ~ 90%) גבוהים, (20 ~ 40%) באמצע (50 ~ 70%) ונמוכים.
- שעה לפחות 1 לפני התמרה, לשאוב fibroblתקשורת AST מהתאים ולשנות 300 μl החדש של מדיום פיברובלסטים.
- הסר סט אחד של 4 צינורות וירוס סנדאי שונים מ-80 ° C האחסון. להפשיר צינור אחד באותו הזמן באמבט מים C ° 37 לכמה שניות, ולאחר מכן לקחת את הצינורות החוצה מאמבט המים. אחרי זה, להפשיר אותם לטמפרטורת חדר; צינורות צנטריפוגות ב 6,000 XG במשך 10 שניות ומניחים אותם על קרח עד שימוש. אל מחדש הקפאה ולהפשיר את הווירוס מאז כותרות לא לשמור.
- הוסף את הכרכים מצויינים של כל אחד מארבעת צינורות וירוס סנדאי (אוקטובר -4, KLF-4, c-Myc וסוקס-2) לצינור מיקרו צנטריפוגות. ודא כי הפתרון הוא מעורב היטב על ידי pipetting בעדינות.
לדוגמא, אם 50K תאים / גם אחד lookwell צלחת 24 גם לתמרה:
(כייל מבוסס על תעודת ניתוח מחיים טכנולוגיים, יכול להיות שונה מיצווה כדי תצווה)
צינור hOct-4 = 6.0 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 5 μl
צינור hSox-2 = 6.5 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 4.6 μ; L
צינור hKlf-4 = 6.3 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 4.8 μl
צינור HC-Myc = 7.8 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 3.8 μl
סה"כ = 18.2 μl של ארבעה גורמי וירוס תערובת / טוב אחד (50K תאים) של צלחת 24 גם - בהתאם לצפיפויות תא; להוסיף 2X, 1X, ו0.5x נפח של תערובת הווירוס לתוך הבאר. נער בעדינות את הצלחת קדמית לגב, משמאל ומימין (2X: 36.4 μl של תערובת וירוס, 1X: 18.2 μl ו0.5x: 9.1 μl).
- מניחים את התאים במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור ודגירת הלילה.
3. החלפה של תרבות בינונית (יום 3 והיום 5)
- 24 שעות לאחר התמרה, להחליף את המדיום עם 500 בינוני פיברובלסטים μl טריים.
- ביום 5, לשנות בינוני עם תקשורת פיברובלסטים טרי.
4. להכין מנות MEF לעמית התרבות (יום 8)
- הכן את תאי MEF ב60 תרבות מנות מ"מ עם 10% FBS הכיל מדיום DMEM דה אחדy לפני passaging פיברובלסטים transduced על מזין תאי MEF.
הערה: אנו משתמשים 5 x 10 5 של MEF בכל מנה 60 מ"מ.
5. התחל משותף תרבות transduced תאים עם תאי מזין MEF (יום 9)
- לפני ציפוי תאי transduced, לשאוב 10% FBS הכיל DMEM תקשורת ממנות מזין MEF ולהוסיף טריים 10% FBS הכיל מדיום DMEM.
- הוצא את המדיה מfibroblasts transduced שנמצאים בצלחת 24 היטב ולשטוף תאי פעם אחת עם D-PBS. הוסף 200 μl של 0.25% טריפסין / EDTA לתוך תאי פיברובלסטים ביישום לוח 24 גם צלחת. לאחר פחות מ -5 דקות דגירה עם טריפסין / EDTA, כאשר התאים מתחילים להתנתק מהצלחת, אוסף את התאים עם מדיום גידול ב15 מיליליטר צינור חרוטי. אז צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 4 דקות.
הערה: איגום 2X, 1X, ווירוס 0.5x פיברובלסטים transduced מומלץ. - הסר את מדיום supernatant ולשטוף מחדש להשעותהתא גלולה עם 4-5 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים טרי לנטרול מטריפסין. אז צנטריפוגות ב135 XG במשך 4 דקות.
- פלייט תאים כמו צפיפות דילול סדרתי ולהתחיל לתרבות משותפת עם תקשורת פיברובלסטים על MEF: כגון 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, ו1/128 ל60 מנה מ"מ. בהתאם לשיעור המוות של תאים במהלך השבוע של התמרה הראשון, אחד עשוי שלא צריך לדלל עד 1/2 או 1/128 צפיפות. לשים בצד את התאים שנותרו כדי לחלץ רנ"א הכל כביקורת חיובית לtransgene RT-PCR.
- הנח 60 מנות מ"מ ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך לילה.
6. Feed תאי גזע עוברי האנושי בינוניים ולפקח על תאים (יום 10)
- למחרת, לשנות את תקשורת פיברובלסטים לתקשורת ES אדם עם 10 מיקרומטר Y-27632. אחרי זה, לשנות בינוני יומי עם מדיום ES אנושי: 800 מיליליטר DMEM/F12 + 200 מיליליטר החלפת נוק סרום + 10 מיליליטר של L-גלוטמין + 10 מיליליטר של 10 חומצות אמינו מ"מ MEM מינימום שאינו חיוניות+ 1 מיליליטר של 2-mercaptoethanol + 10 / מיליליטר ng הבסיסי פיברובלסטים Growth Factor.
- האם שינוי בתקשורת יומיומי עם תקשורת ES אדם טרי. אחרי שבוע, לבדוק את הכלים פעם אחת לכל 2 ~ 3 ימים תחת מיקרוסקופ להיווצרות של גושי תאים כמו מושבה-ES. בהתאם לסוג התא, התרבות תיקח יותר או פחות זמן לפני שהמושבות נמצאות.
7. בחירת המושרה pluripotent גזע מושבות תאים ומרחיב את התאים (יום 20 ~)
- שלושה שבועות לאחר התמרה, מושבות צריכה להיראות גדלו כראוי לקטיף.
- היום לפני לקטוף את המושבות, להכין מזין MEF בצלחת 24 גם.
הערה: אנו משתמשים 12.5 x 10 5 של MEF בצלחת אחת 24 גם. - למחרת, לשנות בינוני של מנות MEF מתקשורת פיברובלסטים לתקשורת ES אדם עם 10 מיקרומטר Y-27632. באופן ידני לבחור מושבה אחת בכל פעם מתחת למיקרוסקופ בקטיף מכסה המנוע ולהפוך את הגושים קטנים יותר על ידי pipetting ולהעביר אותםגבי הכין חדש MEF dishes.Try לאסוף כמה שיבוטים.
- מעבר ולהרחיב את כל טוב מצלחת 24 גם לצלחת גם 6 בתחילה. ואז מצלחת 6 היטב ל60 מ"מ כלים לפני התפשטות נוספת.
8. אפיון iPSCs האדם (לאחר 10 מעברים)
- Immunofluorescence
- iPSCs צלחת אדם בצלחת 24 גם ותרבות במהלך 4-5 ימים עם שינוי תקשורת מדי יום.
- להתחלת assay Immunofluorescence, לשטוף את הצלחת עם D-PBS פעם אחת. ואז לתקן את התאים באופן מיידי בparaformaldehyde 0.4% למשך 30 דקות. אחרי זה לשטוף שלוש פעמים בD-PBS במשך 5 דקות.
- טיפול בתאים קבועים עם 0.1% טריטון ב PBS פתרון X-100 15 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשאוב את פתרון permeablization (0.1% פתרון X-100 טריטון), ולאחר מכן להוסיף 0.5% פתרון חסימת BSA במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- לבצע זיהוי של Nanog, אוקטובר -4, SSEA (antig העוברי בשלב מסויםen) וTRA-1-81 (אנטיגן הסרטני דחייה) באמצעות נוגדן אנטי אנושי ב0.5% פתרון BSA (לבדוק את טבלת חומר לשיעור דילול נוגדנים). דגירה העיקרית נוגדן ל2 שעות בטמפרטורת חדר. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים בD-PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- בדוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 1 שעות של דגירה עם 488 עיזים נוגדני IgG אנטי עכבר Alexa פלואוריד כנוגדן 2 nd, אשר בדילול 1:2,000 ב0.5% פתרון BSA בטמפרטורת חדר. להכתים את כל הגרעינים של כל תאי MEF מזין וhiPSCs עם DAPI.
- RT-PCR של אישור transgene
- תמצית ה-mRNA הכולל מתא גלולה באמצעות ריאגנטים מיצוי RNA.
- האם שעתוק לאחור על aliquots (1 מיקרוגרם) של רנ"א הכל וcDNA הנגזר לPCR הגברה על ידי הפוך transcriptase.
- הכן את תערובות PCR להכיל 2 μl של תבנית cDNA, 10 μl של תערובת אמן 2X PCR, 2 μl של 2 pmol של פריימרים(קדימה: μl 1 הפוך: μl 1) ו -6 μl של DW. כדי לזהות את ביטוי גנים, לעשות RT-PCR עם פריימרים המופיעים בטבלה 1.
- בצע RT-PCRs עם גן GAPDH כביקורת על יעילות של תגובות ההגברה. לחזות ולנתח מוצר ה-PCR ב -1% אלקטרופורזה agarose ג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
fibroblasts הנגוע בדרך כלל לא מראה שינויים מורפולוגיים במספר ימים לאחר התמרה וירוס סנדאי, אבל חמישה ימים לאחר מכן, הם מתחילים לקבל צורות שונות (איור 1). כפי שתואר בפנל ימני של איור 1, אין לי תאים פיברובלסטים מורפולוגיה טיפוסית יותר. יש להם צורה עגולה וגדול יותר מגרעין ציטופלסמה. גם כאשר התמרה מתבצעת ב80% confluency הסלולרי, זה נראה כאילו הם פחות מחוברות בהרבה אחרי שהם מתחילים לתכנת מחדש. אם סוגים של שינויים מורפולוגיים אלה מתחילים לראות ברוב טובים, fibroblasts transduced מוכן להיות מצופים במנות תרבות MEF-מזין.
בפרוטוקול שלנו, אנחנו ממוזערים בקנה מידה תרבית תאים וגם נתנו אפשרויות שונות תכנות מחדש, כגון העסקת צפיפות שונה פיברובלסטים תא וכייל נגיף, וMEF כמה יחס מחדש ציפוי שלאחר מכן, אשר תגדיל את יעילות דור hiPSCs ( בתחילת תכנות מחדש על מתקני האכלת MEF, קשה להבחין בין סוגי transduced תא, אבל אחרי יותר משבוע מהתרבות משותפת, fibroblasts לתכנות מחדש באופן חלקי מופיע ונראה כמו צורה דמוית ES משוחרר (איור 3). בגלל סיבה זו, כאשר מושבות iPSC אדם מוכנות לpassaging לתוך צלחת מזין MEF חדשה, מסיק ידני הוא דרך יעילה יותר להעברה במקום ניתוק עם אנזים. באיור 3 ואיור 4, מתחת למיקרוסקופ יש רק iPSCs אדם קצוות ברורים, אשר עושים הבחנה ברורה בין iPSCs האנושי (נחשב כ 'תאים לתכנות מחדש באופן מלא ") ותאים לתכנות מחדש באופן חלקי" על ידי מורפולוגיה. תאים לתכנות מחדש באופן מלא loבסדר כמו קומפקטי וצפוף. במיוחד יש לי מושבות גבול ברור, ואילו תאים לתכנות מחדש באופן חלקי נראים כמו איסוף יחד כדי להפוך את המושבה אבל מאוד להפסיד ושביר להישבר. גם אם אנחנו עושים pipetting בעדינות שהוא בקלות מנותק. גם לאחר נטרול מושבות לתכנות מחדש באופן חלקי iPSCs האדם (בהרחבתם וpassaging), iPSCs אדם לתכנות מחדש באופן מלא צריך להיות מתוחזק על ידי קטיף ידני. לאחר קטיף מושבות והרחבת השיבוטים hiPSC במספר שבועות, ביטוי של סמני stemness צריך להיות נחוש. לאחר ההתרחבות של שיבוטים hiPSC, אנחנו לאמת אותם עם סטים שונים של בדיקות, כוללים מכתים נוגדן (SSEA4, אוקטובר -4, TRA-81 וNanog) וRT-PCR של סמן pluripotent (הנתונים אינם מוצגים) כבקרת איכות. בהשוואה לH9, שני hiPSCs שונה הם חיובי לSSEA4, אוקטובר -4, TRA-81, וNanog. תוצאה זו מוכיחה כי iPSCs אדם הבודד שנרכש באיכות pluripotent ( לבסוף, איור 6 מראה שאנחנו לא יכולים לזהות כל ביטוי transgene בשיבוטי hiPSC על ידי RT-PCR. לפחות מעל 10 hiPSCs מעברים, פריימרים ספציפיים (טבלת 1) לאקסוגניים אוקטובר -4, סוקס-2, KLF-4 ו-c-Myc ניתן להשתמש בדגימות בקרה חיוביות עם רמת ביטוי transgene חזקה. טבלת 1. פריימרים RT-PCR לאישור transgene. אלה הם רצפי פריימר המשמשים לטרהאישור nsgene. מ 'T הוא 50.6 ° C בכל קבוצות פריימר. 
איור 1. שינוי מורפולוגי לאחר התמרה וירוס סנדאי. לפני התמרה, fibroblasts להראות צורה טיפוסית כמו ציר-(משמאל). כשמונה ימים לאחר התמרה, מורפולוגיה של שינוי תא transduced כמו הרבה יותר צורה עגולה (מימין). אנא לחץ על here כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 2. תרשים של תכנית אינדוקציה כדי להבטיח יעילות מרבית. יכולים להיות מצופה בארבעה סוגי תאים שונים בצלחת 24 גם (מ 1 עד 4). בגלל יכולת ההתקשרות שלהם והישרדות תא יכולים להיות שונות תלויים בסוגי התאים, הוא הציע לצלחת צפיפות תאים שונה (מ200K ל6.25K תאים לכל היטב). בנוסף, ריכוז נגיף יכול להיות מותאם (0.5x, 1X ו2X). 
איור 3. כינונה של מושבה תא גזע pluripotent מושרה מו transducedibroblast. כבשבועות לאחר מחדש ציפוים לMEFs, מושבות עגולות אמורות להופיע ולהיראות כמו מושבות תאי גזע עובריים אנושיות. בדרך כלל יש לי מושבות iPSC אדם לתכנות מחדש באופן מלא לגבולות מאוד ברורים. (חץ: לתכנות מחדש באופן מלא מושבות אנושיות iPSC, ראש חץ: iPSCs אדם לתכנות מחדש באופן חלקי). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. 
איור 4. הרמת מושבות תאים אנושיות מושרה pluripotent גזע. מושבות iPSC אנושיות לעתים קרובות מוקפות בתאים לתכנות מחדש באופן חלקי (משמאל). מתחת למיקרוסקופ, לקטוף את המושבה כמו-ES בלבד, מתפרק לגושים קטנים ולאחר מכן העברה (מימין). אחרי 2 ~ 3 מעברים, יש מושבות שלא עברו התמיינות hiPSC (תחתונה ושמאל). (חץ: מושבות לתכנות מחדש באופן מלא אדם iPSC, ראש חץ: אדם לתכנות מחדש באופן חלקי iPSCs) לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. 
איור 5. מכתים Immunofluorescence עם סמני pluripotent בתאי גזע. Assay Immunofluorescence תערוכות iPSCs אדם יש stemness features.SSEA-4, TRA-81, Nanog, סמני pluripotent אוקטובר 4as וDAPI הוא שליטה עבור מכתים גרעין. () מייצג מכתים H9 כמו לדוגמא שליטה. (ב) ו (ג) להראות שיבוטים iPSC אנושיים.et = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. 
איור 6. אישור על רמת ביטוי transgene. לפחות אחרי תרבות 10-מעבר של iPSCs אדם, השתקת Sox2 אקסוגניים, KLF-4, c-Myc, ואוקטובר -4 רמות ביטוי גנים הוא אושר על ידי תגובות שרשרת פולימראז reverse transcriptase. hGAPDH היא בקרה פנימית. לביקורת חיובית, RNA מופק fibroblasts transduced שאריות (יום 7 לאחר הדבקת סנדאי וירוס). (1 ליין: דה מרקר, נתיבים 2 - 6: GAPDH, Klf4, c-myc, אוקטובר -4, וסוקס-2 בשליטה חיובית, נתיבים 7-11: GAPDH, Klf4, c-myc, אוקטובר -4, וסוקס -2 בhiPSCs). שם פריימר <td> רצף hOCT4 (F) CCC GAA AGA GAA AGC GAA CCA G hOCT4 (R) AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA hMYC (F) TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G hMYC (R) TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG hSOX2 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hSOX2 (R) ATG CGC TGG TTC ACG CCC GCG CCC AGG hKLF4 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hKLF4 (R) GCT GCC CGC GCT GGC AGG GCT CGA C hGAPDH (F) AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG hGAPDH (R) GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תכנות מחדש של תאים סומטיים אדם לhiPSCs מחזיק הבטחות חסרות תקדים בביולוגיה בסיסית, תרופות אישיות, והשתלה 12. בעבר, דורות iPSC אדם הנדרשים וירוס ה-DNA כי יש סיכון אינטגרציה לתוך הגנום המארח, אשר יכול ליצור מוטציות גנטיות לא רצויות המגבילות את יישומים קליניים נוספים כגון טיפולי פיתוח תרופות והשתלה 13. עם מסיבה זו, מחקרים רבים כבר דיווחו לייצר וקטור וiPSCs האנושי המערכת ללא transgene על ידי מספר שיטות אלטרנטיביות, אבל באותו הזמן, את היעילות של בידוד 'רגל הדפסה חינם' צריכה להיחשב iPSCs אדם. לדוגמא, צריך להיות וירוס RNA רמה מינימאלית של סטייה גנטית בהשוואה לשיטות אחרות 14, למרות שאין פרסום לרצף הגנום כולו כדי להדגים את 'בטיחות גנומי "של דור iPSC תיווך וירוס סנדאי עדיין. כאן, אנו מציגים שיטה ליצירה hiPSCs עםסנדאי וירוס שבו יש יעילות גבוהה תכנות מחדש בדרך יעילה וחסכונית. IPSCs האדם וכתוצאה מכך הם ללא transgene עם תחזוקה של קווי דמיון תאיים ומולקולריים לhESCs בפוטנציאל שגשוג והתפתחותי.
אנחנו יכולים לתכנת מחדש את מקורותיה השונים של פיברובלסט (> 4) באותו הזמן עם רק סט אחד של סנדאי וירוס. ובשיטה שלנו, אנחנו מיישמים confluences תאים שונים והבדלי מינון נגיף. זו טכניקת שילוב 'לערבב ולהתאים "ניתן למקסם את יעילות תכנות מחדש. Fibroblasts (ממטופל אחד) בכל אחד גם יש רמת זיהום בנגיף שונה, אבל על ידי איגום יחד, האפשרות של קבלת מושבות hiPSCs יכולה להגדיל מבוססת על הניסיון שלנו. נושאים אחרים של הווריאציה המשובט בין קווי hiPSC הם קצב התפשטות, מצורף תא / הישרדות, מעמדו של איון כרומוזום X 15, בידול פוטנציאלים 16, וכו 'ואכן, ראיתי שכל שבט יש שונהאף אוזן גרון נטייה עצבית, שאפשר לנבא על ידי מדידת רמת הביטוי של אשכול mir-371. בנוסף יש לנו הצלחנו ביצירת iPSCs אדם מmyoblasts אדם בשיטה זו, אשר טוענת כי סנדאי וירוס יכול לשמש לסוגי תאים רבים ושונים בתהליך תכנות מחדש. יתר על כן, בשיטה שלנו, יש לנו שנוצרו hiPSCs בלמעלה מ 10 fibroblasts מחלה הקשורה שונה. בממוצע, יכולים להיות מושגת 5-10 שיבוטים hiPSC מפיברובלסטים אחד.
למרות הגזירה של תאי iPS אנושיים ללא transgene עם סנדאי וירוס היא שיטת תכנות מחדש היעילה ביותר שיכולים להיות הנתיבים המעשיים ביותר, יש כמה מגבלות שיש להתחשב בפרוטוקול זה;
- בהתאם לכל אצווה סנדאי וירוס, כייל הנגיף צריך להיות מחושב עבור משרד הפנים בקנה אחד (כפי שמתואר ב2.4).
- אנו הבחנו הווריאציה של infectivity בין תאים סומטיים שונים, אשר גם צריכה טיטרציה נוספת לRobuזיהום ויראלי st.
- תכנות מחדש בתיווך וירוס סנדאי יכול להיחשב כאחת האפשרויות הטובות ביותר למטרות מחקר. אבל לניסוי הקליני, שזה לא יכול להיות הבחירה הראשונה, שכן אין נושא רישוי עם החברה שפיתחה את מערכת וירוס סנדאי במקור.
- זה לוקח בערך חודשים עד שהתאים סומטיים לתכנות מחדש חופשיים מtransgenes, וזו הסיבה שאנחנו צריכים לבדוק את ביטוי transgene לאחר לפחות 10 מעברים.
- זה נראה כאילו שמספר המעבר של פיברובלסטים התרבותיים העיקריים עשויים להשפיע על היעילות של תכנות מחדש עם סנדאי וירוס, למרות שאין לנו השוואה ישירה. שיעור הריבוי גם צריך להיות נחוש. יש צורך במחקרים נוספים כדי לקבוע את ההשפעה של מספרי מעבר fibroblasts והתפשטותם על יעילות תכנות מחדש.
- במחקר זה, אנו משתמשים בשכבת מזין עכבר לדור hiPSC ותחזוקה, אבל מערכת חופשית מזין יכולה להיות alternativדרך דואר במחקר עתידי.
הפרוטוקול הנוכחי שלנו היה צעד חשוב לקראת לימוד hiPSCs מטופל ספציפי עבור מודלים מחלה, רפואת רגנרטיבית, ויישומים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות לחברים במעבדה לי לדיונים חשובים על כתב היד. עבודה במעבדה לי נתמכה על ידי מענקים מרוברטסון פרס חוקר של קרן לתאי גזע בניו יורק וממרילנד לתאי גזע למחקר קרן (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5 x 105/6 cm or 12.5 x 105/24-well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1,000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | Cell Signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1,000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1,000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | Invitrogen | 948492 | 1/2,000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | Cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
