Summary
Her presenterer vi våre etablert metode for å omprogrammere humane somatiske celler i transgene-free menneskelige iPSCs med Sendai virus, som viser konsistent utfall og forbedret effektivitet.
Abstract
For noen år siden, etablering av menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) innledet en ny æra i biomedisin. Potensielle anvendelser av humane iPSCs inkluderer modellering patogenesen av genetiske sykdommer, autolog celle behandling etter gen korreksjon, og tilpasset medikamentscreening ved å gi en kilde for pasientspesifikke og symptom relevante celler. Imidlertid er det flere hindringer å overvinne, som eliminerer resterende omprogrammering faktor transgen ekspresjon etter menneske iPSCs produksjon. Enda viktigere, kan resttransgene uttrykk i udifferensierte menneskelige iPSCs hemme riktig differensiering og villede tolkningen av sykdoms relevant in vitro fenotyper. Med denne grunn har integrering-fri og / eller i transgene-fritt menneskelig iPSCs blitt utviklet ved hjelp av flere metoder, slik som adenovirus, den piggyBac system, minicircle vektor, episomal vektor, direkte protein levering og syntetisert mRNA. Men effektiviteten av reprogramming bruker integrasjonsfrie metoder er ganske lav i de fleste tilfeller.
Her presenterer vi en metode for å isolere menneskelige iPSCs ved hjelp av Sendai-virus (RNA-virus) basert omprogrammering system. Dette omprogrammering metoden viser konsistente resultater og høy effektivitet i kostnadseffektiv måte.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESCs) har en evne til selv-fornyes in vitro og har pluripotency, som kan være potensielt nyttige for sykdom modellering, for drug screening, og for å utvikle cellebaserte terapier for å behandle sykdommen og vev skader. Men hESCs har en begrensning for celle erstatning terapi på grunn av immunologiske, onkologiske og etiske barrierer, og å studere sykdomsrelaterte gener, kan sykdomsspesifikke hESCs isoleres gjennom pre-implantasjon genetisk diagnose (PGD) nærmer seg, men det er fortsatt teknisk utfordrende og embryo donasjoner er ganske sjelden. Disse problemene er knyttet til fremdriften i stamcellebiologi, noe som har ført til utvikling av induserte pluripotente stamceller (hiPSCs).
Menneskelige iPSCs er genetisk omprogrammeres fra menneskelige voksne somatiske celler og havnen pluripotent stamcelle-lignende funksjoner som ligner på hESCs, noe som gjør dem en nyttig kilde for regenerativ medisin som drug oppdagelse, sykdom modellering og celleterapi i pasient-spesifikk måte 1,2.
Til nå, er det flere metoder for å generere humane iPSCs, inkludert virus-mediert (retrovirus og adenovirus) 3, ikke-virus-mediert (BAC system og vektorer transfeksjon) 4 gen transductions, og protein leveringssystemet 5-7.
Selv om en leveranse av virus-mediert gener kan sikre en viss grad av effektivitet, kunne virale vektorer forlate genetisk fotavtrykk, fordi de integrere i verts kromosomer å uttrykke omprogrammering gener på en ukontrollert måte. Selv når viral integrering av transkripsjonsfaktorer kan aktivere eller deaktivere verts gener 8, kan det føre til en uventet genetisk avvik og risiko for tumorigenesis 5,9. På den annen side ble den direkte innføring av proteiner eller RNA inn i somatiske celler rapportert, men har noen ulemper slik som arbeidskrevende, gjentas transfEL, og lavt nivå av omprogrammering 7,10. Selv episomal og ikke-integrere adenovirus, adeno-assosiert virus, og plasmidvektorer som fremdeles forholdsvis mindre effektive 11. For disse grunner, er det plausibelt å velge ikke-integrasjon omprogrammering metoder med høy effekt av iPSC generasjon og færre genetiske avvik. I denne studien bruker vi en Sendai-virus basert omprogrammering. Denne metoden er kjent for å være ikke-integrert i vertsgenomet og konsekvent produserer menneskelige iPSCs uten transgene integrasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av Cell og Media (Dag 1)
- Kultur og utvide human fibroblast med DMEM medium inneholdende 10% FBS.
- Plate humane fibroblaster (figur 1) på en 24-brønn plate med en passende tetthet per brønn på dagen før transduksjon.
MERK: Følgende seriefortynning anbefales (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K og 6.25K) fordi ulike celletyper har forskjellige vedlegg evne. - Inkuber cellene for en dag i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator, noe som sikrer at cellene er fullstendig fast, og trukket ut.
To. Utfør Transduksjon (Dag 2)
- På dagen for transduksjon, kontrollerer celletetthet og velger de mest effektive tetthet brønner (figur 2). Det er bedre å plukke tre forskjellige tettheter: høy (80 ~ 90%), middels (50 ~ 70%) og lav (20 ~ 40%).
- Minst en time før transduksjon, aspirer fibroblast mediet fra cellene, og endre nye 300 mL av fibroblast medium.
- Fjern ett sett med fire forskjellige Sendai virus rør fra -80 ° C lagring. Tin hvert rør på samme tid i en 37 ° C vannbad i noen få sekunder, og deretter ta rør ut fra vannbadet. Etter det tine dem til romtemperatur; sentrifugerør på 6000 xg i 10 sek og plassere dem på is inntil bruk. Må ikke fryses og tines viruset siden titerne ikke vil opprettholde.
- Til de angitte mengder av hver av de fire Sendai virus rør (Oct-4, KLF-4, c-Myc, og Sox-2) til mikro-sentrifugerør. Sørg for at løsningen er godt blandet ved å pipettere forsiktig.
Hvis for eksempel 50K celler / brønn av en 24-brønns plate lookwell for transduksjon:
(Titer basert på analysesertifikat fra Life Technologies, kan være forskjellig fra parti til parti)
Tube hOct-4 = 6,0 x 10 7 CIU, 3 MOI = 5 mL
Tube hSox-2 = 6,5 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4,6 μ; L
Tube hKlf-4 = 6,3 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4,8 mL
Tube hc-Myc = 7,8 x 10 7 CIU, 3 MOI = 3,8 mL
Totalt = 18,2 mL av fire virus faktorer blanding / en brønn (50K celler) av 24-brønns plate - Avhengig av celletetthet; legge 2X, 1X, og 0,5 x volum av virusblandingen inn i brønnen. Rist platen forfra og bakover, venstre og høyre (2X: 36,4 mL av virus blanding, 1X: 18,2 mL og 0.5x: 9,1 mL).
- Plasser cellene i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator og inkuberes over natten.
Tre. Utskifting av Kultur Medium (Dag 3 & Dag 5)
- 24 timer etter transduksjon, erstatte medium med 500 mL frisk fibroblast medium.
- På dag fem, endre Medium med frisk fibroblast media.
4. Forbered MEF Retter for Co-kultur (Dag 8)
- Forbered MEF celler i 60 mm kultur retter med 10% FBS inneholdt DMEM medium man day før passering transduced fibroblast på MEF mater-celler.
Merk: Vi bruker 5 x 10 5 av MEF i hver 60 mm fatet.
5. Start Co-kultur transduced Cells med MEF mater celler (Dag 9)
- Før plating transduserte celler, inneholdt aspirer 10% FBS DMEM media fra MEF mater retter og legge friske 10% FBS inneholdt DMEM medium.
- Fjern mediet fra de transduserte fibroblaster som er i 24-brønns plate og vaske cellene en gang med D-PBS. Tilsett 200 ul av 0,25% Trypsin / EDTA i fibroblast-cellene inthe 24-brønns plate. Etter at mindre enn 5 min inkubasjon med trypsin / EDTA, når cellene begynner å løsne fra platen, samle cellene med vekstmedium i 15 ml koniske rør. Deretter sentrifuger dem i 6000 xg for 4 min.
MERK: Pooling 2X, 1X, og 0.5x virus transduced fibroblast anbefales. - Fjern supernatanten medium og vaske å re-suspenderecellepelleten med 4-5 ml frisk fibroblast medium for nøytralisering av trypsin. Deretter sentrifuger dem ved 135 xg for 4 min.
- Plate celler som seriefortynning tetthet og begynne å co-kultur med fibroblast media på MEF: eksempel 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, og 1/128 per 60 mm fatet. Avhengig av celledød hastighet i løpet av første uke av transduksjon, kan man ikke trenger å fortynnes til 1/2 eller 1/128 tetthet. Sett bort resterende celler for å trekke ut total RNA som en positiv kontroll for Transgene RT-PCR.
- Plasser 60 mm retter i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator over natten.
6. Strøm humane embryonale stamceller Medium og overvåke Cells (dag 10)
- Den neste dagen, endre fibroblast media til human ES media med 10 mikrometer Y-27632. Etter at forandre medium daglig med human ES medium: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml Knockout Serum erstatning + 10 ml L-Glutamine + 10 ml av 10 mM MEM minimum ikke-essensielle aminosyrer+ 1 ml 2-mercaptoethanol + 10 ng / ml av grunnleggende fibroblast vekstfaktor.
- Gjør en daglig media endring med friske humane ES media. Etter en uke, sjekk rettene en gang per 2 ~ 3 dager under et mikroskop for dannelsen av ES koloni-lignende celle klumper. Avhengig av celletypen, vil kulturen ta mer eller mindre før kolonier blir funnet.
7. Plukke indusert pluripotent Stem Cell Colonies og Utvid Cells (Dag 20 ~)
- Tre uker etter transduksjon, bør kolonier vises vokst skikkelig for plukking.
- Dagen før plukke koloniene, forberede MEF mater i 24-brønns plate.
MERK: Vi bruker 12,5 x 10 5 av MEF i en 24-brønns plate. - Den neste dagen, endre medium av MEF retter fra fibroblast media til human ES media med 10 mikrometer Y-27632. Manuelt velge en koloni på hver gang under mikroskopet i plukk-hette og gjøre mindre klumper ved pipettering og overføre dempå nypreparerte MEF dishes.Try å plukke flere kloner.
- Passasje og utvide hver brønn av en 24-brønn plate på en 6 brønners plate i utgangspunktet. Deretter fra en 6-brønns plate i en 60 mm retter før ytterligere formering.
8. Karakterisering av menneskelig iPSCs (etter 10 Passages)
- Immunfluorescens
- Plate menneskelige iPSCs i 24-brønns plate og kultur i løpet av 4-5 dager med daglig media endring.
- For å starte Immunfluorescens analysen, vaske platene med D-PBS gang. Deretter festes cellene umiddelbart i 0,4% paraformaldehyd i 30 min. Deretter vaskes tre ganger i D-PBS i 5 min.
- Treat faste celler med 0,1% Triton X-100-løsning i PBS i 15 min ved romtemperatur.
- Aspirer permeablization-løsning (0,1% triton X-100-løsning), deretter til 0,5% BSA blokkeringsløsning i 1 time ved romtemperatur.
- Utføre en påvisning av Nanog, Oct-4, SSEA (stadium spesifikke embryonale antigen) og TRA-1-81 (tumor avvisning antigen) ved hjelp av et anti-humant antistoff i 0,5% BSA-løsning (se tabell materialet for antistoff-fortynning rate). Inkuber primær antistoff i 2 timer ved romtemperatur. Deretter vaskes tre ganger i D-PBS i 5 min hver.
- Kontroller ved hjelp av fluorescens-mikroskopi etter 1 time med inkubering med Alexa 488 Fluor geit anti-mus IgG-antistoffer som to nd-antistoff, som er fortynnet 1:2,000 i 0,5% BSA-løsning ved romtemperatur. Flekk alle kjerner av hver MEF mater celler og hiPSCs med DAPI.
- RT-PCR av Transgene Bekreftelse
- Utdrag total mRNA fra cellen pellet ved hjelp av RNA ekstraksjon reagenser.
- Gjøre en omvendt transkripsjon på alikvotene (1 mikrogram) av total RNA og den resulterende cDNA for PCR forsterkning av revers transkriptase.
- Klargjør blandinger PCR å inneholde 2 mL av cDNA mal, 10 mL av 2X PCR Master Mix, 2 mL av 2 pmol av primere(Forward: 1 pl og omvendt: en ul) og 6 mL av DW. For å detektere genekspresjon, gjør RT-PCR med primere som er oppført i tabell 1.
- Utfør RT-PCRs med GAPDH-genet som en kontroll for effektiviteten av amplifikasjonsreaksjoner. Visualisere og analysere PCR produkt med 1% agarose-gel elektroforese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vanligvis infiserte fibroblaster ikke viser noen morfologiske endringer i flere dager etter Sendai virus transduksjon, men fem dager senere, begynner de å ha ulike former (figur 1). Som beskrevet i en høyre panelet på figur 1, gjør cellene ikke har typisk fibroblast morfologi lenger. De har en rund form og større kjerne enn cytoplasma. Selv når transduksjon er utført i 80% cellulær confluency, ser det ut som de er mindre konfluent i brønnen etter at de begynner å omprogrammere. Dersom slike morfologiske endringer begynner å bli sett i det meste av brønnen, transduserte fibroblaster er klar til å bli belagt på MEF-mater kultur retter.
I vår protokollen, minimaliseres vi cellekultur skala og ga også forskjellige omprogrammering muligheter, for eksempel anvendelse av forskjellige fibroblast celletetthet og virus titer, og etterfølgende flere re-pletteringsforholdet MEF, som vil øke produksjonseffektiviteten (hiPSCs I begynnelsen av omprogrammering på MEF matere, er det vanskelig å skille transduserte celletyper, men etter over en uke fra co-kultur, delvis omprogrammeres fibroblaster vises og ser ut som løsnet ES-lignende form (figur 3). På grunn av denne grunn når menneskelig iPSC kolonier er klar for aging inn nye MEF mater fatet, er manuell plukking mer effektiv måte for overføring i stedet for dissosiasjon med enzymet. I Figur 3 og Figur 4, under mikroskop kun menneskelige iPSCs har klare kanter, som gjør et klart skille mellom menneske iPSCs (anses som "fullt omprogrammeres celler ') og' ufullstendig omprogrammeres celler" av morfologi. Fullt omprogrammeres celler look som kompakt og tett pakket. Spesielt koloniene har klar grense, mens delvis omprogrammeres cellene ser ut som å samle sammen for å gjøre kolonien, men veldig tape og skjøre til å bryte ned. Selv om vi gjør en pipettering forsiktig er det lett frittliggende. Selv etter unntatt delvis omprogrammerte menneskelige iPSCs kolonier (i å utvide dem og passaging), fullt omprogrammeres menneskelige iPSCs må opprettholdes ved manuell plukking. Etter plukke kolonier og utvide hiPSC kloner i flere uker, må uttrykk for stemness markører som skal bestemmes. Etter utvidelsen av hiPSC kloner, bekrefter vi dem med ulike sett av tester, inkludert antistoffarging (SSEA4, Oct-4, TRA-81 og Nanog) og RT-PCR av pluripotent markør (data ikke vist) som en kvalitetskontroll. Sammenlignet med H9, to forskjellige hiPSCs er positive til SSEA4, Oct-4, TRA-81, og Nanog. Dette resultatet viser at isolerte menneskelige iPSCs ervervet pluripotent kvalitet ( Til slutt, Figur 6 viser at vi ikke kan oppdage eventuelle transgene uttrykk i hiPSC kloner av RT-PCR. I det minste over 10 passasjer hiPSCs, spesifikke primere (tabell 1) for eksogene Oct-4, Sox-2, KLF-4-og c-Myc kan brukes med positive kontrollprøver med sterk transgen ekspresjon nivå. Tabell 1. RT-PCR primere for transgenet bekreftelse. Disse er primersekvenser som brukes for transgene bekreftelse. T m er 50,6 ° C i alle primer settene. 
Figur 1. Morfologisk endring etter Sendai virus transduksjon. Før transduksjon, fibroblaster viser typisk spindel-lignende form (til venstre). Ca åtte dager etter transduksjon, morfologi av transduserte celleendringer som mye mer rund form (til høyre). Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 2. Diagram av induksjon plan for å sikre maksimal effektivitet. Over fire forskjellige celletyper kan bli belagt i en 24-brønns plate (fra 1 til 4). Fordi deres festeevne og celleoverlevelse kan være forskjellig avhengig av hvilke celletyper, er det foreslått å plate forskjellige celletetthet (fra 200K til 6.25K celler per brønn). Dessuten kan viruskonsentrasjonen justeres (0.5x, 1X og 2X). 
Figur 3. Dannelse av menneskeskapte pluripotent stamcelle koloni fra transduced fibroblast. I ca to uker etter re-plating dem inn MEFs, bør runde kolonier vises og ser ut som humane embryonale stamceller kolonier. Normalt fullt omprogrammeres menneskelige iPSC kolonier har veldig klare grenser. (Arrow: fullt omprogrammeres menneskelige iPSC kolonier, pilspiss: delvis omprogrammeres menneskelig iPSCs). Klikk her for å se større bilde . 
Figur 4 Plukke opp menneskeskapte pluripotent stamcelle kolonier.. Menneske iPSC kolonier er ofte omgitt av delvis omprogrammeres celler (venstre). Under mikroskopet, plukke ES-lignende koloni bare, bryte ned i små klumper og deretter overføre (til høyre). Etter to ~ tre passasjer, det er udifferensierte hiPSC kolonier (nederst og venstre). (Arrow: fullt omprogrammeres menneskelige iPSC kolonier, pilspiss: delvis omprogrammeres menneskelig iPSCs) Klikk her for å se større bilde . 
Figur 5. Immunfluorescens farging med stamcelle pluripotente markører. Immunfluorescens analysen viser menneskelige iPSCs har stemness features.SSEA-4, TRA-81, Nanog, Oct-4aS pluripotent markører og DAPI er en kontroll for kjernen farging. (A) representerer H9 farging som en kontrollprøve. (B) og (C) viser humane iPSC kloner.et = "_blank"> Klikk her for å se større bilde. 
Figur 6. Bekreftelse av transgene uttrykk nivå. Minst etter 10-passasje kultur av menneskelige iPSCs, stanse av eksogene Sox2, KLF-4, c-myc og Oct-4 genuttrykk nivåer bekreftes av revers transkriptase polymerase kjedereaksjoner. hGAPDH er en intern kontroll. For en positiv kontroll, er RNA ekstrahert fra left transduserte fibroblaster (Dag 7 etter Sendai-virus infeksjon). (Lane 1: Marker, baner 2 - 6: GAPDH, Klf4, c-myc, Oct-4, og Sox-2 i positiv kontroll, baner 7 - 11: GAPDH, Klf4, c-myc, Oct-4, og Sox -2 i hiPSCs). Primer navn <td> Sequence hOCT4 (F) CCC GAA AGA GAA AGC GAA CCA G hOCT4 (R) AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA hMYC (F) TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G hMYC (R) TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG hSOX2 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hSOX2 (R) ATG CGC TGG TTC ACG CCC GCG CCC AGG hKLF4 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hKLF4 (R) CGC GCT GGC AGG GCC GCT GCT CGA C hGAPDH (F) AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG hGAPDH (R) GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omprogrammering menneskelige somatiske celler til hiPSCs innehar enestående løftene i grunnleggende biologi, personlig medisin, og transplantasjon 12. Tidligere menneskelige iPSC generasjoner kreves DNA virus som har integrasjon risiko i verten genomet, noe som kan skape uønskede genetiske mutasjoner som begrenser ytterligere kliniske applikasjoner som narkotika utvikling og transplantasjon terapi 13. Med denne grunn har mange studier blitt rapportert å generere vektor-og transgene-fritt system humane iPSCs av flere alternative metoder, men på samme tid, effektiviteten av å isolere 'fotavtrykk fri "humane iPSCs bør vurderes. For eksempel bør den RNA-virus har en minimal grad av genetiske avvik i forhold til andre fremgangsmåter for 14, selv om det ikke er noen publikasjons for hele genomet sekvensering for å demonstrere 'genomisk sikkerhet "for Sendai virus-mediert iPSC generering ennå. Her presenterer vi en metode for generering hiPSCs medSendai-virus, som har en høy virkningsgrad omprogrammering i kostnadseffektiv måte. De resulterende menneskelige iPSCs er fri for transgenet med vedlikehold av cellulære og molekylære likheter til hESCs i proliferativ og utviklingspotensial.
Vi kan omprogrammere forskjellig opprinnelse fibroblast (> 4) samtidig med bare ett sett av Sendai-virus. Og i vår metode, bruker vi ulike celle confluences og virus dosering forskjeller. Denne "mix og match" kombinasjon teknikken kan maksimere omprogrammering effekt. Fibroblaster (fra en enkelt pasient) i hver brønn har en annen virusinfeksjon nivå, men ved å blande sammen, kan muligheten for å gjøre hiPSCs kolonier øke basert på vår erfaring. Andre utgaver av klonal variasjon blant hiPSC linjene er proliferasjonsrate, celle vedlegg / overlevelse, status for X kromosom inaktive 15, potensialer differensiering 16, osv. Ja, observerte vi at hver klone har en forskjelligent neural tilbøyelighet, som kan forutsies ved å måle ekspresjonsnivået av en mir-371 klynge. I tillegg har vi lykkes i å generere menneskelige iPSCs fra menneskelige myoblasts med denne metoden, noe som antyder at Sendai-virus kan brukes til mange forskjellige celletyper i omprogrammering prosessen. Videre bruker vår metode, har vi generert hiPSCs i mer enn 10 ulike sykdomsrelaterte fibroblaster. I gjennomsnitt kunne 5-10 hiPSC kloner fås fra en fibroblast.
Selv om avledning av transgene-free menneskelige iPS-celler med Sendai-virus er den mest effektive omprogrammering metode som kan være de mest praktiske stier, er det noen begrensninger som skal vurderes i denne protokollen;
- Avhengig av hver sendai-virus batch, må virustiter som skal beregnes for konsekvent MOI (som beskrevet i 2.4).
- Vi observerte variasjonen av smittsomhet blant ulike somatiske celler, som også trenger ekstra titrering for Robust virusinfeksjon.
- Den Sendai virus mediert omprogrammering kan betraktes som en av de beste valgene for forskningsformål. Men for den kliniske studien, kan det ikke være førstevalget, siden det er en lisens problem med selskapet som opprinnelig utviklet Sendai virus system.
- Det tar rundt to måneder før de omprogrammeres somatiske celler er fri for transgener, som er grunnen til at vi trenger å sjekke transgene uttrykk etter minst 10 passeringer.
- Det synes som om at passasjen antallet av primære dyrkede fibroblast kan påvirke effektiviteten av omprogrammering med Sendai-virus, selv om vi ikke har en direkte sammenligning. Denne formeringshastigheten må også bestemmes. Videre studier er nødvendig for å bestemme effekten av fibroblaster passasje tall og deres spredning på omprogrammering effektivitet.
- I denne studien bruker vi en mus mater lag for hiPSC generasjon og vedlikehold, men en mater fritt system kan være et alternative måte i en fremtidig studie.
Vår nåværende protokollen har vært et viktig skritt mot å studere pasientspesifikke hiPSCs for sykdom modellering, regenerativ medisin, og andre programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke medlemmene av Lee lab for verdifulle diskusjoner om manuskriptet. Arbeid i Lee lab ble støttet med tilskudd fra Robertson Investigator Award of New York Stem Cell Foundation og fra Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5 x 105/6 cm or 12.5 x 105/24-well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1,000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | Cell Signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1,000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1,000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | Invitrogen | 948492 | 1/2,000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | Cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
