Effektiv Generation Menneskelige induceret pluripotente stamceller fra humane somatiske celler med Sendai-virus

Summary

Her præsenterer vi vores etablerede metode til at omprogrammere humane somatiske celler i transgene-fri menneskelige iPSCs med Sendai-virus, som viser ensartet resultat og øget effektivitet.

Abstract

For et par år siden, etablering af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) indvarslede en ny æra inden for biomedicin. Potentielle anvendelser af menneskelige iPSCs omfatter modellering patogenesen af ​​genetiske sygdomme hos mennesker, autolog celleterapi efter gen korrektion, og personlig drug screening ved at give en kilde til patient-specifikke og symptom relevante celler. Der er imidlertid flere forhindringer at overvinde, såsom at fjerne de resterende omprogrammering faktor transgenekspression efter humane iPSCs produktion. Endnu vigtigere er, kan resterende transgen ekspression i udifferentierede humane iPSCs hæmmer ordentlig differentieringer og misguide fortolkningen af sygdommen relevante in vitro-fænotyper. Med denne grund har integration-fri og / eller transgene fri humane iPSCs blevet udviklet ved hjælp af flere metoder, såsom adenovirus, den piggyBac system minicircle vektor, episomale vektorer, direkte protein levering og syntetiseres mRNA. Men effektiviteten af ​​reprogramming hjælp integration-fri metoder er ganske lav i de fleste tilfælde.

Her præsenterer vi en metode til at isolere menneskelige iPSCs ved hjælp af Sendai-virus (RNA-virus) baseret omprogrammering system. Denne omprogrammering metode viser konsistente resultater og høj effektivitet i omkostningseffektiv måde.

Introduction

Humane embryonale stamceller (hESCs) har en kapacitet til selv at forny in vitro og har pluripotency, hvilket kan være potentielt nyttige for sygdom modellering, til drug screening, og for at udvikle cellebaserede behandlingsformer til at behandle skader sygdom og væv. Men hESCs har en begrænsning for celleudskiftning grund af immunologiske, onkologiske og etiske barrierer, og til at studere sygdomsrelaterede gener, kunne sygdomsspecifikke hESCs isoleres gennem præ-implantation genetisk diagnose (PGD) nærmer sig, men det er stadig teknisk udfordrende og embryoet donationer er temmelig sjældne. Disse problemer er relateret til udviklingen i stamcellebiologiske, hvilket har ført til udviklingen af ​​inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs).

Menneskelige iPSCs er genetisk omprogrammeres fra humane voksne somatiske celler og havnen pluripotente stamceller-lignende funktioner ligner hESCs, hvilket gør dem en nyttig kilde til regenerativ medicin, såsom dtæppe opdagelse, modellering sygdom og celleterapi i patient-specifik måde ^1,2.

Indtil nu, er der flere metoder til at generere menneskelige iPSCs, herunder virus-medieret (retrovirus og adenovirus) ³ non-virus medieret (BAC system og vektorer transfektionsreagenser) ⁴ gen transduktioner og protein fremføringssystemer ^5-7.

Selv om en levering af virus-medierede gener kan sikre et vist niveau af effektivitet, kan virale vektorer forlade genetiske fodaftryk, fordi de integreres i værtskromosomerne at udtrykke omprogrammering gener på en ukontrolleret måde. Selv når viral integration af transkriptionsfaktorer kan aktivere eller inaktivere værtsgener ^8, kan det forårsage en uventet genetisk aberration og risikoen for tumorigenese ^5,9. På den anden side blev den direkte indføring af proteiner eller RNA i somatiske celler rapporteret, men har nogle ulemper, såsom arbejdskrævende, gentagne transffdeling, og lavt omprogrammering ^7,10. Selv episomale og ikke-integrerende adenovirus, adeno-associeret virus og plasmidvektorer stadig er relativt mindre effektive ^11. Af disse grunde er det plausibelt at vælge ikke-integration omprogrammering metoder med høj effektivitet af IPSC generation og færre genetiske abnormiteter. I denne undersøgelse, bruger vi en Sendai-virus baseret omprogrammering. Denne metode er kendt for at være ikke-integreret i værtsgenomet og konsekvent producerer menneskelige iPSCs uden transgene integrationer.

Protocol

1.. Udarbejdelse af Cell og Medier (dag 1) Kultur og udvide human fibroblast med DMEM-medium indeholdende 10% FBS. Plate humane fibroblaster (figur 1) på en 24-brønds plade ved passende tæthed per brønd på dagen før transduktion. BEMÆRK: Følgende seriefortyndinger anbefales (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K og 6.25K), fordi forskellige celletyper har forskellig tilknytning evne. Inkuberes cellerne for en dag mere i et 37 ° C, 5% CO 2 …

Representative Results

Normalt inficerede fibroblaster ikke udviser nogen morfologiske ændringer i flere dage efter Sendai virus transduktion, men fem dage senere, de begynder at have forskellige former (figur 1). Som beskrevet i en højre panel i figur 1, behøver cellerne ikke har typisk fibroblast morfologi mere. De har en rund form og større kerne end cytoplasma. Selv når transduktion udføres i 80% cellulær konfluens, ser det ud som de er mindre sammenflydende i brønden efter at de begynder at ompro…

Discussion

Omprogrammering humane somatiske celler til hiPSCs besidder hidtil usete løfter i grundlæggende biologi, personlig medicin og transplantation ^12. Tidligere human IPSC generationer krævede DNA-virus, der har integration risiko i værtens genom, som kan skabe uønskede genetiske mutationer, der begrænser yderligere kliniske applikationer såsom lægemiddeludvikling og transplantationscentre terapier ^13. Med denne grund har mange undersøgelser blevet rapporteret at generere vektorbaseret og trans…

Materials

CytoTune-iPS Reprogramming Kit	invitrogen	A1378002
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated	Global stem	GSC-6105M	5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X	invitrogen	25200114
DMEM/F-12 medium	invitrogen	11330-032
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 uM (Stock: 10 mM)
basic fibroblast growth factor	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Stock : 100 ug)
Knock-out serum replacement	Gibco	10828028
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)	invitrogen	11965118
Fetal bovine serum	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	LIFE TECHNOLOGIES	11140050	1/100
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid	GIBCO	21985023	1/1000
Hausser Phase Contrast Hemacytometers	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	cell signaling	4745S	1/200
mouse monoclonal Oct4 antibody	Santa Cruz	SC-5279	1/1000
Nanog	R&D	AF1997	1/1000
Alexa Flouor 488 goat anti-mouse	invitrogen	948492	1/2000
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium	cellgro	21-031-CV
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	invitrogen	15596018
picking hood	NuAire	NU-301
dissecting scope	Nikon	SMZ745