Summary
Her præsenterer vi vores etablerede metode til at omprogrammere humane somatiske celler i transgene-fri menneskelige iPSCs med Sendai-virus, som viser ensartet resultat og øget effektivitet.
Abstract
For et par år siden, etablering af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) indvarslede en ny æra inden for biomedicin. Potentielle anvendelser af menneskelige iPSCs omfatter modellering patogenesen af genetiske sygdomme hos mennesker, autolog celleterapi efter gen korrektion, og personlig drug screening ved at give en kilde til patient-specifikke og symptom relevante celler. Der er imidlertid flere forhindringer at overvinde, såsom at fjerne de resterende omprogrammering faktor transgenekspression efter humane iPSCs produktion. Endnu vigtigere er, kan resterende transgen ekspression i udifferentierede humane iPSCs hæmmer ordentlig differentieringer og misguide fortolkningen af sygdommen relevante in vitro-fænotyper. Med denne grund har integration-fri og / eller transgene fri humane iPSCs blevet udviklet ved hjælp af flere metoder, såsom adenovirus, den piggyBac system minicircle vektor, episomale vektorer, direkte protein levering og syntetiseres mRNA. Men effektiviteten af reprogramming hjælp integration-fri metoder er ganske lav i de fleste tilfælde.
Her præsenterer vi en metode til at isolere menneskelige iPSCs ved hjælp af Sendai-virus (RNA-virus) baseret omprogrammering system. Denne omprogrammering metode viser konsistente resultater og høj effektivitet i omkostningseffektiv måde.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESCs) har en kapacitet til selv at forny in vitro og har pluripotency, hvilket kan være potentielt nyttige for sygdom modellering, til drug screening, og for at udvikle cellebaserede behandlingsformer til at behandle skader sygdom og væv. Men hESCs har en begrænsning for celleudskiftning grund af immunologiske, onkologiske og etiske barrierer, og til at studere sygdomsrelaterede gener, kunne sygdomsspecifikke hESCs isoleres gennem præ-implantation genetisk diagnose (PGD) nærmer sig, men det er stadig teknisk udfordrende og embryoet donationer er temmelig sjældne. Disse problemer er relateret til udviklingen i stamcellebiologiske, hvilket har ført til udviklingen af inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs).
Menneskelige iPSCs er genetisk omprogrammeres fra humane voksne somatiske celler og havnen pluripotente stamceller-lignende funktioner ligner hESCs, hvilket gør dem en nyttig kilde til regenerativ medicin, såsom dtæppe opdagelse, modellering sygdom og celleterapi i patient-specifik måde 1,2.
Indtil nu, er der flere metoder til at generere menneskelige iPSCs, herunder virus-medieret (retrovirus og adenovirus) 3 non-virus medieret (BAC system og vektorer transfektionsreagenser) 4 gen transduktioner og protein fremføringssystemer 5-7.
Selv om en levering af virus-medierede gener kan sikre et vist niveau af effektivitet, kan virale vektorer forlade genetiske fodaftryk, fordi de integreres i værtskromosomerne at udtrykke omprogrammering gener på en ukontrolleret måde. Selv når viral integration af transkriptionsfaktorer kan aktivere eller inaktivere værtsgener 8, kan det forårsage en uventet genetisk aberration og risikoen for tumorigenese 5,9. På den anden side blev den direkte indføring af proteiner eller RNA i somatiske celler rapporteret, men har nogle ulemper, såsom arbejdskrævende, gentagne transffdeling, og lavt omprogrammering 7,10. Selv episomale og ikke-integrerende adenovirus, adeno-associeret virus og plasmidvektorer stadig er relativt mindre effektive 11. Af disse grunde er det plausibelt at vælge ikke-integration omprogrammering metoder med høj effektivitet af IPSC generation og færre genetiske abnormiteter. I denne undersøgelse, bruger vi en Sendai-virus baseret omprogrammering. Denne metode er kendt for at være ikke-integreret i værtsgenomet og konsekvent producerer menneskelige iPSCs uden transgene integrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af Cell og Medier (dag 1)
- Kultur og udvide human fibroblast med DMEM-medium indeholdende 10% FBS.
- Plate humane fibroblaster (figur 1) på en 24-brønds plade ved passende tæthed per brønd på dagen før transduktion.
BEMÆRK: Følgende seriefortyndinger anbefales (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K og 6.25K), fordi forskellige celletyper har forskellig tilknytning evne. - Inkuberes cellerne for en dag mere i et 37 ° C, 5% CO 2 inkubator, sikrer cellerne har fuldt levet og udvidet.
2.. Udfør transduktion (dag 2)
- Kontrollere celledensiteten På dagen for transduktion og valgte de mest effektive densitet brønde (Figur 2). Det er bedre at vælge tre forskellige tætheder: høj (80 ~ 90%), midterste (50 ~ 70%) og lav (20 ~ 40%).
- Mindst 1 time før transduktion, sug fibroblast medier fra cellerne og ændre nye 300 pi fibroblast medium.
- Tag et sæt af 4 forskellige Sendai virus rør fra -80 ° C opbevaring. Optø hvert rør på samme tid i et 37 ° C vandbad i nogle få sekunder, og derefter tage rørene fra vandbadet. Efter at tø dem til stuetemperatur; centrifugerør ved 6.000 xg i 10 sek, og placere dem på is indtil brug. Må ikke nedfryses igen og tø virus, da titre ikke vil vedligeholde.
- Tilføj de angivne mængder af hver af de fire Sendaivirusvektorer rør (Oct 4 Klf-4, c-Myc og Sox-2) til mikro-centrifugerør. Sørg for, at løsningen er blandet godt ved pipettering forsigtigt.
For eksempel, hvis 50K celler / en brønd af 24-brønds plade lookwell til transduktion:
(Titer baseret på Certificate of Analysis fra Life Technologies, kan være forskellig fra parti til parti)
Tube hOct-4 = 6,0 x 10 7 CIU, 3 MOI = 5 pi
Tube hSox-2 = 6,5 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4,6 μ; L
Tube hKlf-4 = 6,3 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4,8 pi
Tube hc-Myc = 7,8 x 10 7 CIU, 3 MOI = 3,8 pi
Total = 18.2 pi fire virus faktorer blandingen / én brønd (50K celler) i 24-brønds plade - Afhængigt celledensiteter; tilføje 2X, 1X og 0.5X volumen af virus blandingen i brønden. Ryst forsigtigt pladen front til bag, venstre og højre (2X: 36,4 pi virus blanding, 1X: 18,2 pi og 0,5 X: 9,1 ul).
- Anbring cellerne i et 37 ° C, 5% CO 2-inkubator og inkuberes natten over.
3.. Udskiftning af Culture Medium (Dag 3 & Day 5)
- 24 timer efter transduktion, erstatte mediet med 500 pi frisk fibroblast medium.
- På dag 5, ændre Medium med frisk fibroblast medier.
4.. Forbered MEF Retter for Co-kultur (dag 8)
- Forbered MEF-celler i 60 mm dyrkningsskåle med 10% FBS DMEM-medium indeholdt en day før passage den transducerede fibroblast på MEF feeder-celler.
Bemærk: Vi bruger 5 x 10 5 af MEF i hver 60 mm skål.
5.. Start Co-kultur transducerede celler med MEF feederceller (dag 9)
- Før plating transducerede celler, aspirat 10% FBS indeholdt DMEM medier fra MEF feeder skåle og tilføje frisk 10% FBS indeholdt DMEM medium.
- Fjern mediet fra de transducerede fibroblaster, der er i 24-brønds plade og vaske celler en gang med D-PBS. Tilsæt 200 pi af 0,25% trypsin / EDTA i fibroblastceller underprogrammet 24-brønds plade. Efter mindre end 5 min inkubation med trypsin / EDTA, når cellerne begynder at løsne sig fra pladen, indsamle cellerne med vækstmedium i 15 ml koniske rør. Derefter centrifugeres dem i 6.000 xg i 4 min.
BEMÆRK: Pooling 2X, 1X, og 0,5 X virus transducerede fibroblast anbefales. - Fjern supernatanten medium og vask til at re-suspenderecellepelleten med 4-5 ml frisk fibroblast medium for neutralisering af trypsin. Derefter centrifugeres dem ved 135 xg i 4 min.
- Plate celler som seriefortynding tæthed og begynde at co-kultur med fibroblast medie til MEF: såsom 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 og 1/128 pr 60 mm skål. Afhængigt af celledød i løbet af denne første uge af transduktion, kan man ikke behøver at fortyndes til 1/2 eller 1/128 densitet. Lægge resterende celler til at udtrække totalt RNA som en positiv kontrol for transgen RT-PCR.
- Anbring 60 mm-skåle i 37 ° C, 5% CO2-inkubator natten over.
6.. Foder humane embryonale stamceller Medium og overvåge celler (dag 10)
- Den næste dag, ændre fibroblast medier til humane ES-medier med 10 pM Y-27632. Efter at ændre mediet dagligt med humane ES-medium: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml Knockout Serum erstatning + 10 ml L-glutamin + 10 ml 10 mM MEM minimum ikke-essentielle aminosyrer+ 1 ml 2-mercaptoethanol + 10 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor.
- Har en daglig medier ændring med friske humane ES medier. Efter en uge kontrollere retter en gang per 2 ~ 3 dage under et mikroskop for dannelsen af ES-koloni-lignende celleklumper. Afhængigt af celletypen, vil kulturen tage mere eller mindre tid før kolonier fundet.
7.. Picking induceret pluripotente Stem Cell Kolonier og udvide Cells (dag 20 ~)
- Tre uger efter transduktion, bør kolonier synes vokset ordentligt til plukning.
- Dagen før plukke kolonierne, forberede MEF feeder i 24-brønds plade.
BEMÆRK: Vi bruger 12,5 x 10 5 af MEF i en 24-brønds plade. - Den næste dag, ændre medium for MEF retter fra fibroblast medier til humant ES medier med 10 pM Y-27632. Manuelt vælge en koloni på hver gang under lup i plukningen-hætte og gøre mindre klumper ved pipettering og overføre dempå frisklavet MEF dishes.Try at samle adskillige kloner.
- Passage og udvide hver brønd af en 24-brønds plade til en 6-brønds plade i første omgang. Så fra en 6-brønds plade til en 60 mm skåle før yderligere formering.
8.. Karakterisering af human iPSCs (efter 10 Passager)
- Immunofluorescens
- Plate menneskelige iPSCs i 24-brønds plade og kultur i løbet af 4-5 dage med daglige medier forandring.
- Til start immunofluorescensbestemmelse, vask pladen med D-PBS en gang. Derefter fikseres cellerne straks i 0,4% paraformaldehyd i 30 min. Derefter vaskes tre gange i D-PBS i 5 min.
- Behandl fikserede celler med 0,1% Triton X-100 i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer permeablization opløsning (0,1% triton X-100 opløsning), hvorefter der tilsættes 0,5% BSA blokerende opløsning i 1 time ved stuetemperatur.
- Udfør en påvisning af Nanog, Oct-4, SSEA (fase-specifikke embryonale antigda) og TRA-1-81 (tumorafstødningsantigen) under anvendelse af et anti-humant antistof i 0,5% BSA-opløsning (check materialet tabel antistoffortynding sats). Inkuber primært antistof i 2 timer ved stuetemperatur. Vask derefter tre gange i D-PBS i 5 min hver.
- Kontroller ved hjælp af fluorescensmikroskopi efter 1 times inkubation med Alexa Fluor 488 ged anti-mus IgG-antistoffer som 2. antistof, der er fortyndet 1:2000 i 0,5% BSA-opløsning ved stuetemperatur. Farv alle kerner af hver MEF feeder celler og hiPSCs med DAPI.
- RT-PCR af Transgene Bekræftelse
- Uddrag totalt mRNA fra cellepelleten ved hjælp af RNA-ekstraktionsmetoder reagenser.
- Har en omvendt transkription på portioner (1 mg) af total RNA og den deraf cDNA til PCR-amplifikation af revers transkriptase.
- Forbered PCR blandinger indeholder 2 pi af cDNA-skabelon, 10 ul 2X PCR Master mix, 2 pi 2 pmol primere(Fremad: 1 pi og omvendt: 1 ul) og 6 pi DW. At påvise genekspression gør RT-PCR med primere, der er opført i tabel 1.
- Udfør RT-PCR med GAPDH genet som en kontrol for effektiviteten af amplifikationsreaktionerne. Visualisere og analysere PCR-produktet med 1% agarose-gelelektroforese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normalt inficerede fibroblaster ikke udviser nogen morfologiske ændringer i flere dage efter Sendai virus transduktion, men fem dage senere, de begynder at have forskellige former (figur 1). Som beskrevet i en højre panel i figur 1, behøver cellerne ikke har typisk fibroblast morfologi mere. De har en rund form og større kerne end cytoplasma. Selv når transduktion udføres i 80% cellulær konfluens, ser det ud som de er mindre sammenflydende i brønden efter at de begynder at omprogrammere. Hvis disse typer af morfologiske ændringer begynder at ses i de fleste af brønden, transducerede fibroblaster er klar til at blive udpladet på MEF-feeder dyrkningsskåle.
I vores protokol, vi minimeret cellekultur skala og gav også forskellige omprogrammering muligheder, såsom at ansætte forskellige fibroblast celle tæthed og virustiter og efterfølgende flere re-plating forholdet MEF, hvilket vil øge hiPSCs generation effektivitet ( I begyndelsen af omprogrammering på MEF foderautomater, er det svært at skelne transducerede celletyper, men efter over en uge fra co-kultur, delvist omprogrammerede fibroblaster vises og ligner løsnes ES-lignende form (figur 3). På grund af denne grund, når de menneskelige IPSC kolonier er klar til passage ind i nye MEF feeder fad, manuel plukning er mere effektiv måde til overførsel i stedet for dissociation med enzym. I figur 3 og 4, under mikroskop kun menneskelige iPSCs har klare kanter, som gør en klar sondring mellem de menneskelige iPSCs (betragtes som »fuldt omprogrammerede celler«) og »ufuldstændigt omprogrammerede celler 'af morfologi. Fuldt omprogrammerede celler look ligesom kompakt og tætpakkede. Især kolonierne har klar grænse, mens delvist omprogrammerede celler ligner samle sammen for at gøre koloni, men meget at tabe og skrøbelige til at bryde ned. Selv hvis vi gør en pipettering forsigtigt er det nemt afmonteres. Selv efter at udelukke delvist omprogrammerede menneskelige iPSCs kolonier (i at udvide dem og passage), skal opretholdes ved manuel plukning fuldt omprogrammerede menneskelige iPSCs. Efter plukning kolonier og udvide hiPSC kloner i flere uger, udtryk for stemness markører skal bestemmes. Efter udvidelsen af hiPSC kloner, vi kontrollere dem med forskellige sæt af tests, herunder antistoffarvning (SSEA4, Oct-4, TRA-81 og Nanog) og RT-PCR af pluripotente markør (data ikke vist) som en kvalitetskontrol. Sammenlignet med H9, to forskellige hiPSCs er positive til SSEA4, Oct-4, TRA-81, og Nanog. Dette resultat viser, at isolerede humane iPSCs erhvervet pluripotente kvalitet ( Endelig viser figur 6, at vi ikke kan påvise nogen transgenekspression i hiPSC kloner ved RT-PCR. Mindst over 10 passager hiPSCs, specifikke primere (tabel 1) for eksogen Oct-4, Sox-2, Klf-4 og c-myc kan bruges med positive kontrolprøver med stærke transgenekspressionsniveau. Tabel 1. RT-PCR-primere for bekræftelse transgen. Disse er primersekvenserne, der anvendes til traNsGene bekræftelse. T m er 50,6 ° C i alle primersæt. 
Figur 1. Morfologisk ændring efter Sendai-virus transduktion. Før transduktion, fibroblaster viser typiske spindel-lignende form (til venstre). Cirka otte dage efter transduktion, morfologi transducerede celle forandring som meget mere rund form (til højre). Klik here for at se en større version af dette tal. 
Figur 2.. Diagram over induktion plan for at sikre maksimal effektivitet. Over fire forskellige celletyper kan udpladet i en 24-brønds plade (fra 1 til 4). Fordi deres fastgørelse evne og celleoverlevelse kan være forskellig afhængig af de celletyper, foreslås det at pladen forskellige celledensitet (fra 200K til 6.25K celler per brønd). Desuden kan viruskoncentration justeres (0.5X, 1X og 2X). 
Figur 3.. Dannelse af menneskeskabte pluripotente stamceller koloni fra transduceret fibroblast. I omkring to uger efter re-plating dem i MEF'er bør runde kolonier vises og ligner embryonale stamceller kolonier menneske. Normalt fuldt omprogrammerede humane IPSC kolonier har meget klare grænser. (Pil: fuldt omprogrammeres humane IPSC kolonier, pilespids: delvist omprogrammeret menneskelige iPSCs). Klik her for at se større billede . 
Figur 4.. Picking up menneskeskabte pluripotente stamceller kolonier. IPSC kolonier Humane er ofte omgivet af delvist omprogrammerede celler (venstre). Under lup, kun plukke ES-lignende koloni, bryde ned i små klumper og derefter overføre (til højre). Efter 2 ~ 3 passager, der er udifferentierede hiPSC kolonier (bund og venstre). (Pil: fuldt omprogrammerede humane IPSC kolonier, pilespids: delvist omprogrammeret menneskelige iPSCs) Klik her for at se større billede . 
Figur 5.. Immunfluorescensfarvning med stamcelle pluripotente markører. Immunofluorescensbestemmelse viser menneskelige iPSCs har stemness features.SSEA-4, TRA-81, Nanog, Oct-4aS pluripotente markører og DAPI er en styring til kerne farvning. (A) repræsenterer H9 farvning som en kontrolprøve. (B) og (C) viser humane IPSC kloner.ET = "_blank"> Klik her for at se større billede. 
Figur 6.. Bekræftelse af transgenekspressionsniveau. Mindst efter 10-passage kultur af humane iPSCs, undertrykkelse af eksogen Sox2, Klf-4, c-myc, og Oct-4 genekspressionsniveauer bekræftes af reverse transkriptase polymerase kædereaktioner. hGAPDH er en intern kontrol. For en positiv kontrol, er RNA ekstraheret fra sidesten transducerede fibroblaster (dag 7 efter Sendai-virus-infektion). (bane 1: Marker, banerne 2-6: GAPDH, KLF4, c-myc, Oct-4 og Sox-2 i positiv kontrol, stræder 7 - 11: GAPDH, KLF4, c-myc, Oct-4 og Sox -2 i hiPSCs). Primer navn <td> Sekvens hOCT4 (F) CCC GAA AGA GAA AGC GAA CCA G hOCT4 (R) AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA hMYC (F) TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G hMYC (R) TCC ACA TAC AGT FTT GGA TGA TGA TG hSOX2 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hSOX2 (R) ATG CGC TGG TTC ACG CCC GCG CCC AGG hKLF4 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hKLF4 (R) CGC GCT GGC AGG GCC GCT GCT CGA C hGAPDH (F) AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG hGAPDH (R) GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omprogrammering humane somatiske celler til hiPSCs besidder hidtil usete løfter i grundlæggende biologi, personlig medicin og transplantation 12. Tidligere human IPSC generationer krævede DNA-virus, der har integration risiko i værtens genom, som kan skabe uønskede genetiske mutationer, der begrænser yderligere kliniske applikationer såsom lægemiddeludvikling og transplantationscentre terapier 13. Med denne grund har mange undersøgelser blevet rapporteret at generere vektorbaseret og transgene system uden humane iPSCs flere alternative metoder, men på samme tid, effektiviteten af isolering af "footprint fri" humane iPSCs overvejes. For eksempel bør RNA-virus har et minimalt niveau af genetisk aberration sammenligne med andre metoder 14, selv om der er nogen offentliggørelse for hele genomsekvensering at demonstrere "genomisk sikkerhed 'af Sendai-virus-medieret IPSC generation endnu. Her præsenterer vi en metode til at generere hiPSCs medSendai-virus, som har en høj omprogrammering effektivitet i en omkostningseffektiv måde. De resulterende menneskelige iPSCs er fri for transgen med vedligeholdelse af cellulære og molekylære ligheder til hESCs i proliferativ og udviklingsmuligheder.
Vi kan omprogrammere forskellige oprindelser af fibroblast (> 4) på samme tid med kun ét sæt af Sendai-virus. Og i vores metode, vi anvender forskellige celle confluences og virus dosering forskelle. Denne "mix and match" kombination teknik kan maksimere omprogrammering effekt. Fibroblaster (fra en enkelt patient) i hver brønd har en anden virus infektion niveau, men ved at samle sammen, kunne muligheden for at gøre hiPSCs kolonier stige baseret på vores erfaringer. Andre udgaver af klonal variation blandt hiPSC linjer er spredning sats, cellevedhæftning / overlevelse, status af X-kromosom inaktivering 15, differentiering potentialer 16 etc. Faktisk vi observeret, at hver klon har en forskelligent neurale tilbøjelighed, som kan forudsiges ved at måle ekspressionsniveauet af et mir-371 klynge. Desuden er det lykkedes at generere humane iPSCs fra humane myoblaster med denne metode, hvilket antyder, at Sendai-virus kan anvendes til mange forskellige celletyper i omprogrammering proces. Desuden ved hjælp af vores metode, vi har genereret hiPSCs i mere end 10 forskellige sygdomsrelaterede fibroblaster. I gennemsnit kan fra 5 til 10 hiPSC kloner fås fra en fibroblast.
Selv afledningen af transgene-fri humane iPS celler med Sendai-virus er den mest effektive omprogrammering metode, der kunne være den mest praktiske stier, er der nogle få begrænsninger, der skal overvejes i denne protokol;
- Afhængig af hver Sendai-virus parti, behov virustiteren skal beregnes for konsekvent MOI (som beskrevet i 2.4).
- Vi observerede variation af infektivitet mellem forskellige somatiske celler, som også har brug for yderligere titrering for Robust virusinfektion.
- Sendaivirusset medieret omprogrammering kan betragtes som en af de bedste valg til forskningsformål. Men for det kliniske forsøg, kan det ikke være det første valg, da der er en licensordning problem med det selskab, der oprindeligt blev udviklet Sendai virus system.
- Det tager omkring to måneder indtil de omprogrammeret somatiske celler er fri transgener, hvilket er hvorfor vi er nødt til at tjekke transgenekspressionen efter mindst 10 passager.
- Det ser ud som, at passagen antallet af den primære dyrkede fibroblast kan påvirke effektiviteten af omprogrammering med Sendai-virus, selv om vi ikke har en direkte sammenligning. Spredningen rate skal også bestemmes. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme virkningen af fibroblaster passage numre og deres spredning på omprogrammering effektivitet.
- I denne undersøgelse har vi bruger en mus fødelag for hiPSC produktion og vedligeholdelse, men en feeder gratis system kan være en alternative måde i en fremtidig undersøgelse.
Vores nuværende protokol har været et vigtigt skridt i retning af at studere patient-specifikke hiPSCs for sygdom modellering, regenerativ medicin, og andre applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af Lee laboratorium til værdifulde diskussioner om manuskriptet. Arbejdet i Lee lab blev støttet af tilskud fra Robertson Investigator Award i New York Stem Cell Foundation og fra Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5 x 105/6 cm or 12.5 x 105/24-well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1,000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | Cell Signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1,000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1,000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | Invitrogen | 948492 | 1/2,000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | Cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
